CC BY
67
ционной поверхностью фаги и сэкономить время и материалы при проведении последующих манипуляций. Кроме того, результаты нашего исследования продемонстрировали, что использование биотинилированных МКА 2F5 приводит к уменьшению количества специфически связавшихся фаговых клонов, однако данные клоны обладают большим уровнем связывания. Таким образом, решение о биотинилировании антител должно приниматься в каждом конкретном случае самим исследователем в зависимости от поставленных задач. Если же требуется отобрать пептидные последовательности, обладающие наибольшей специфичностью связывания с антителами (к примеру, для отбора диагностических пептидов), предпочтительно, по нашему мнению, использовать небиотинилированные антитела для аффинной селекции. А для получения большого разнообразия пептидов, но с разной специфичностью, целесообразно производить биотинилирование.
Сведения об авторах: ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.
Щербакова Н.С. - научн.сотр. отдела иммуноте-рапевтических препаратов, e-mail: nadia_nsk@ngs.ru, Чикаев А.Н. - стажер-исследователь отдела имму-нотерапевтических препаратов,
Карпенко Л.И. - зав. лабораторией разработки средств иммунопрофилактики,
Ильичев А.А. - зав. отделом иммунотерапевтиче-ских препаратов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ерошкин А. М. // Молекул. биол. - 1988. - Т. 2. - C. 635-644.
2. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. - М., 1984.
3. AdeyN., Mataragnon A., Rider J. et al. // Gene. - 1995. - Vol. 156. -P. 27-31.
4. Amin N., Aguilar A., Chamacho F. et al. // Malaysian J. Med. Sci. -2009. - Vol. 16. - P. 4-14.
5. Böttger V., Böttger A. // Meth. Mol. Biol. - 2009. - Vol. 524. - P. 181-201.
6. Casey J., Coley A., Parisi K. et al. // Protein Eng. Des. Sel. - 2009. -Vol. 22. - P. 85-91.
7. FackF., Hügle-Dörr B., SongD. et al. // J. Immunol. Meth. - 2009. - Vol. 206. - P. 43-52.
8. Huyer-Hansen G., HamersM. J. A. G., Pedersen A. N. et al. // J. Immunol. Meth. - 2000. - Vol. 235. - P. 91-99.
9. Knittelfelder R., Riemer A., Jensen-Jarolim E. // Expert Opin. Biol. Ther. - 2009. - Vol. 9. - P. 493-506.
10. Liu N, Wu G., LiH. et al. // Int. Immunopharm. - 2009. - Vol. 9. - P. 291-297.
11. Parker C., Deterding L., Hager-Braun C. et al. // J. Virol. - 2001. -Vol. 69. - P. 6609-6617.
12. Peluso P., Wilson D, Do D. et al. // Anal. Biochem. - 2003. - Vol. 312. - P. 113-124.
13. Scholle M, Collart F, Kay B. // Prot. Expr. Purific. - 2004. - Vol. 37. - P. 243-252.
14. Scott J., Smith G. // Science. - 1990. - Vol. 249 - P. 386-390.
15. Scott J., Craig L. // Curr. Opin. Biotechnol. - 1994. - Vol. 5. - P. 40-48.
16. Smith G. // Science. - 1990. - Vol. 228. - P. 1315.
17. SongaH., Luo W., Chena Y. // Vet. Microb. - 2010. - Vol. 145. - P. 17-22.
18. Wallmann J., Epstein M., Singh P. et al. // Clin. Exp. Allergy. - 2010. - Vol. 40. - P. 650-658.
Поступила 16.06.11
THE IMPACT OF THE ANTIBODY 2F5 BIOTINYLATION ON THE SELECTION OF THE PEPTIDES FROM COMBINATORIAL PHAGE LIBRARY
N. S. Shcherbakova, A. N. Chikaev, L. I. Karpenko, A. A. Ilichev
State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector", Koltsovo, Novosibirsk Region, Russia
The impact of monoclonal antibodies (mAb) biotinylation on the output and the repertoire of selected peptides in the biopanning procedure were tested. A comparative analysis of the peptides selected from phage library using the biotinylated and non-biotinylated mAb 2F5 was performed. It was shown that the output of peptides homologous to the native epitope was 1.7-fold higher for biotinylated antibodies, whereas the binding capacity of the selected phages with mAb 2F5 in ELISA was higher in the case of using non-biotinylated antibodies. It should be noted that the phages exposing peptides, which have 4-5 amino acid sequence similarity with the native epitope, demonstrate the highest binding affinity. The phages that expose peptides with 3 amino acid sequence similarity demonstrate different binding affinity: from the smallest to the largest. Based on the obtained data, it is safe to suggest that the rational biopanning may proceed in accordance with the task.
Key words: phage-peptide display, mAb 2F5, biotinylation of antibodies
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 579.852.12:579.222].083.1
О. А. Смоленцева, Д. Р. Яруллина, О. Н. Ильинская
индукция синтеза ш у лактобацилл в условиях стресса
Кафедра микробиологии биолого-почвенного факультета Казанского (Приволжского) федерального университета
Установлено, что увеличение биосинтеза оксида азота (NO) в клетках Lactobacillus plantarum 8Р-А3 происходит при сильном стрессовом воздействии, сопровождающемся значительным снижением жизнеспособности микробных клеток: нагревании при 70 и 80°C, продолжительном культивировании, токсическом действии гексилрезорцина. Факторы, не вызывающие гибель клеток, такие как прогревание при 60°C, гомосеринлактон в концентрации 50 мкг/мл и экзогенная рибонуклеаза Bacillus intermedius 7P в концентрации до 300 мкг/мл, не индуцируют синтез NO. Активация биосинтеза NO в ответ на стрессовые воздействия свидетельствует в пользу универсальности ключевых механизмов стресс-ответа клеток различного уровня организации и важной роли в них NO.
Ключевые слова: оксид азота (NO), Lactobacillus plantarum, высокотемпературный стресс, гомосеринлактон, гексилрезорцин, рибонуклеаза Bacillus intermedius 7P (биназа)
Биосинтез оксида азота (NO) в клетках лактобацилл осуществляется по альтернативному пути NO-синтазной денитрификации (NOS) [12], подобно тому, как это происходит у ряда грамположительных бактерий [17] и в клетках эукариот [15]. Консервативность NOS-подобных белков в процессе эволюции предполагает универсальность физиологических функций NO.
Наряду с такими многочисленными функциями, как вазодилатация, нейротрансмиссия, снижение агрегации тромбоцитов, реакция иммунной системы, регуляция тонуса гладких мышц, состояние памяти и др. [15], сигнальная молекула NO играет важную роль
в стрессовых и адаптивных ответах в организме человека и животных [7]. У прокариот функциональное значение NO при стрессе остается пока мало изученным. Взаимодействуя с факторами транскрипции, NO может активировать экспрессию генов важнейших систем репарации ДНК: SoxRS, SOS, OxyR и Ada, тем самым участвуя в трансдукции генетического сигнала резистентности к различным стрессорам [2-4, 19]. У обладающих NOS-активностью бактерий Bacillus subtilis и B. anthracis с NO связывают механизмы устойчивости к окислительному стрессу [21, 27].
В настоящей работе исследованы эффекты ряда стрессоров физической и химической природы на синтез NO пробиотическими бактериями Lactobacillus plantarum 8Р-А3, которые потенциально способны модулировать уровень NO в макроорганизме [12, 13]. Выявленные взаимосвязи между силой стрессового влияния и уровнем биосинтеза NO указывают на функциональное значение данного агента в стресс-ответе бактерий.
Материалы и методы
Материалы. В качестве индукторов стресс-ответа у бактерий в работе использовали следующие соединения: 1) 4-н-гексилрезорцин, концентрация 50 мкг/мл ("Sigma-Aldrich"; мол. масса 196 КД), как ауторегулятор из группы алкилоксибензолов (АОБ); 2) гидробромид а-амино-у-бутиролактона, концентрация 50 мкг/мл ("Sigma-Aldrich"; мол. масса 182), как общий структурный элемент внеклеточных микробных регуляторов из группы гомосеринлактонов (ГСЛ); 3) биназу, гуанилспецифичную рибонуклеазу (РНКаза) Bacillus intermedius 7Р, концентрации 5, 10, 100, 300 мкг/мл (Экспериментальный завод Института органического синтеза АН Латвии, мол. масса 12,3 кД).
Штамм и условия культивирования. Использовали бактерии Lactobacillus plantarum 8Р-А3, выделенные из препарата "Лактобактерин сухой" (ФГУП Пермское НПО "Биомед") [12]. Бактерии L. plantarum 8Р-А3 выращивали в пробирках объемом 50 мл, содержащих 30 мл среды DeMan-Rogosa-Sharpe (MRS) с добавлением используемых в работе эффекторных веществ и без таковых в контроле. Время культивирования с ауторегу-ляторами составило 5, 10, 15, 20 сут, с биназой - 2 сут. Затем клетки трижды отмывали от среды Hanks' буфером c кальцием и магнием (PAA Laboratories GmbH) и концентрировали в нем же центрифугированием.
Для изучения температурного воздействия выращенные на среде MRS в течение 2 сут до стационарной фазы роста и отмытые вышеописанным способом клетки L. plantarum 8P-A3 нагревали на водяной бане в течение 30 мин при температуре 60, 70, 80°C. Контрольный вариант инкубировали в аналогичных условиях при 37°C.
Определение токсичности стрессоров. С целью выяснения влияния исследуемых стрессорных факторов на жизнеспособность лактобацилл пробы окрашивали с помощью LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit (Molecular Probes, «Invitrogen»), следуя инструкциям фирмы-изготовителя. Данный реактив включает SYTO 9 и йодид пропидия (PI) и флюоресцентно окрашивает жизнеспособные клетки в зеленый цвет, а клетки с поврежденными мембранами - в красный. Приготовленные препараты микро-скопировали под флюоресцентным микроскопом Leica DM 6000B (Германия), оборудованным набором соответствующих фильтров. Полученные изображения флюоресцентного сигнала анализировали с помощью компьютерной программы Leica FW4000.
Регистрация No. Уровень NO определяли с помощью NO-чувствительного флюоресцентного индикатора сульфата 1,2-диаминоантрахинона (DAA) (Molecular Probes, "Invitrogen") в концентрации 50 мкг/мл [14]. Клетки L. plantarum 8P-A3 инкубировали c добавлением флюоресцентного красителя при 37°C в течение 1 ч, затем трижды отмывали от красителя Hanks' буфером и
микроскопировали под флюоресцентным микроскопом Leica DM 6000B (Германия). Контрольный вариант на автофлюоресценцию бактерий инкубировали в буфере, не содержащем красителей. Полученные изображения флюоресцентного сигнала анализировали с помощью компьютерной программы Leica FW4000.
Статистическая обработка результатов. Математическую обработку полученных результатов проводили в компьютерной программе "Microsoft Excel". Результаты считали достоверными при среднеквадратическом отклонении а < 10%. В качестве критерия достоверности полученных разностей использовали t-критерий Стьюдента (p < 0,05).
Результаты и обсуждение
Результаты исследования последних лет расширили функции NO от свойств потенциально токсичного свободнорадикального соединения до универсального фактора регуляции физиологических систем и экспрессии генов. Результаты данной работы находятся в русле современной концепции [7], рассматривающей NO как ключевое звено стресс-реакции организмов различного уровня организации.
Участие NO в ответе лактобацилл на тепловой стресс продемонстрировано в эксперименте по выяснению воздействия температуры на NO-ергическую систему бактерий. Ему предшествовал анализ влияния нагревания на рост и жизнеспособность бактерий. Оказалось, что получасовое нагревание суспензии клеток до 60C не оказывает влияния на физиологическую активность лактобацилл; действие температуры 70C при тех же условиях приводит к гибели 90% бактерий, а 80C - к полной потере жизнеспособности микроорганизмов (рис. 1, светлые столбцы).
С помощью флюоресцентного окрашивания DAA идентифицировали увеличение продукции NO в подвергшихся воздействию получасовому нагреванию при 70 и 80°C клетках L. plantarum 8Р-А3 по сравнению с бактериями, находившимися при физиологической температуре роста 37C (рис. 1, заштрихованные столбцы). Существенно, что аналогичной реакцией сопровождается ответ на тепловой шок у млекопитающих. При гипертермии у животных происходит возрастание образования NO, который в свою очередь активирует синтез протекторных стресс-белков
250
Рис. 1. Влияние нагревания в течение 30 мин на жизнеспособность бактерий Lactobacillus plantarum 8P-A3 (светлые столбцы) и относительное содержание в них NO (заштрихованные столбцы), измеренное флюоресцентным окрашиванием сульфатом 1,2-диаминоантрахинона (DAA).
Жизнеспособность бактерий определяли с помощью флюоресцентного
окрашивания LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit. За 100% принято количество жизнеспособных клеток, инкубируемых при оптимальной температуре 37oC. Относительное содержание NO в интактных клетках принято за 100%. По оси абсцисс - температура нагревания (в oC); по оси ординат - количество интактных клеток и относительное содержание NO (в %).
120
100
Hsp70 [25], обладающих целым набором защитных свойств при температурном стрессе [26]. Таким образом, очевидно, что увеличение генерации NO является одним из ключевых звеньев адаптации клеток млекопитающих [7]. Отмечено, что биосинтез Hsp70 в одинаковой степени характерен как для прокариот, так и для эукариот [28]. Можно предположить, что увеличение продукции NO при температурном воздействии происходит у лакто-бацилл с целью адаптации к повышению температуры.
Нагревание при 60C в течение 30 мин не вызывало изменений в жизнеспособности клеток и в образовании ими NO (см. рис. 1). По-видимому, данное воздействие находится ниже стрессорного уровня температурного фактора. Ранее считалось, что 3-минутное воздействие температурой 60C значительно снижает жизнеспособность L. plantarum DPC2739 [18]. Ввиду высокой промышленной значимости лак-тобацилл отмеченная термотолерантность исследуемого штамма может иметь практический потенциал, например, в пищевых производствах, технологические стадии которых зачастую протекают при достаточно высоких значениях температуры [18, 20].
Особая роль NO в стресс-ответе отмечена при оценке влияния на NOS-активность L. plantarum 8Р-А3 ауторегуляторных веществ из группы ГСЛ и АОБ. Использованные в работе неацилированный лактон гомосерина (ГСЛ) и гексилрезорцин (АОБ) оказывают на бактерии видонеспецифическое регуляторное действие [11]. Ранее было показано, что уровень NO в культуре L. fermentum, измеренный на 2-е сутки культивирования в присутствии ГСЛ или АОБ, не отличался от такового в контрольном образце, не содержащем ауторегуляторов [9]. ГСЛ и АОБ являются индукторами длительных динамических процессов, обусловленных в естественных условиях изменением концентрации субстратов и пространственных возможностей [5, 8, 10], поэтому мы исследовали воздействие данных веществ на NOS-активность лакто-бацилл в периодической культуре в течение продолжительного (20 дней) периода времени (рис. 2).
Независимо от наличия ауторегуляторов в среде роста лактобацилл, начиная с 5-х суток культивиро-
2 5 10 15 20
Рис. 2. Влияние 50 мкг/мл ГСЛ (темные столбцы) и 50 мкг/мл гексилрезорцина (заштрихованные столбцы) на относительное содержание NO в пересчете на 1 клетку
Lactobacillus plantarum 8P-A3. Светлые столбцы - контроль. По оси абсцисс - время (в сутках); по оси ординат - относительное содержание NO (в усл. ед/клетка).
Рис. 3. Влияние ГСЛ (50 мкг/мл) и гексилрезорцина (50 мкг/мл) на физиологическое состояние и численность
клеток Lactobacillus plantarum 8P-A3. За 100% принято количество клеток в стационарной фазе роста контрольного варианта (2 дня) без добавления ауторегулятора. Светлые столбцы - интактные клетки, заштрихованные - общее количество клеток. По оси абсцисс - вариант (I - контроль; II - с внесением ГСЛ; III - с внесением гексилрезорцина) и время культивирования (в сут); по оси ординат - %.
вания, мы наблюдали снижение количества клеток с интактной мембраной, вероятно, вызванное старением популяции бактерий. После 10 дней в популяции L. plantarum 8Р-3А их количество было приближено к нулю (рис. 3, светлые столбцы). При этом такая длительно культивируемая культура лактобацилл характеризуется повышенным синтезом NO (см. рис. 2, светлые столбцы).
На 2-е сутки культивирования в присутствии АОБ (50 мкг/мл) регистрировали достоверное снижение как общего количества бактерий L. plantarum 8Р-А3, так и содержания интактных клеток, что свидетельствует о токсическом действии АОБ по отношению к исследуемым лактобациллам. ГСЛ (50 мкг/мл) не оказывал значимого влияния на клетки лактобацилл (см. рис. 3). Флюоресцентное окрашивание показало, что в варианте, выращенном в присутствии АОБ, уровень NO в расчете на 1 клетку возрастал спустя 5 дней культивирования по сравнению с таковым в контрольных клетках, инкубируемых без ауторегуляторов (см. рис. 2, заштрихованные столбцы). В клетках, подверженных воздействию ГСЛ, не выявлено достоверного изменения содержания NO (см. рис. 2, темные столбцы). Очевидно, ГСЛ, будучи слабым стрессором, не влияет на синтез NO бактериями, тогда как токсичный для лак-тобацилл АОБ приводит к значительному повышению продукции NO у исследуемых микроорганизмов.
Таким образом, NOS-активность бактерий зависит от физиологического состояния микроорганизмов и повышается в стареющей популяции лактобацилл, а также при токсическом действии АОБ, что свидетельствует в пользу известной теории, предполагающей участие сигнальной молекулы NO в стресс-ответе клеток [2-4, 19].
Предположение о наличии у биназы стрессинду-цирующих свойств основано на известной биологической активности данного фермента, обусловленной катализируемым им расщеплением рибонуклеиновых кислот [6, 24]. Однако в изученных концентрациях би-наза не проявила себя как стрессор, поскольку не оказывала влияния на жизнеспособность L. plantarum 8Р-
5 10 50 100 300
Рис. 4. Количество клеток Lactobacillusplantarum 8P-A3 с интактной мембраной в пробах, выращенных в присутствии различных концентраций биназы (светлые столбцы) и относительное содержание в них NO (заштрихованные столбцы).
За 100% принято количество интактных клеток в пробах без добавления биназы (контроль). Относительное содержание NO в последних принято за 100%. По оси абсцисс - концентрация биназы (в мкг/мл); К - контрольный вариант без добавления биназы; по оси ординат - количество интактных клеток и относительное содержание NO (в %).
A3 (рис. 4, светлые столбцы). Полученные результаты могут быть связаны с ограниченным проникновением биназы в клетки лактобацилл. Поскольку основным направлением в изучении биназы является ее апопто-генность в отношении злокачественных эукариотиче-ских клеток [22], о проникновении данного фермента в бактериальные клетки пока мало что известно.
На биосинтез NO лактобациллами в наименьшей из исследованных концентраций (5 мкг/мл) биназа влияния не оказала. Эффект малых концентраций биназы, по-видимому, как и в случае получасового нагревания L. plantarum 8Р-А3 при 60°C, свидетельствует об отсутствии стрессорного эффекта исследуемого фактора. Начиная с 10 мкг/мл биназа снижала продукцию NO по сравнению с таковой в контрольных клетках (рис. 4, заштрихованные столбцы). Если принять во внимание токсические свойства NO [15], то снижение его образования в ответ на обработку клеток биназой можно рассматривать как положительное влияние малых доз РНКазы на лактобациллы. Из литературы известно о ростстимулирующих эффектах данного фермента, но в значительно более низких концентрациях [23]. В случае L. plantarum 8Р-А3 такие концентрации биназы, возможно, достигаются вследствие ограниченного проникновения фермента в бактериальные клетки. Обнаруженный эффект РНКазы на синтез NO у L. plantarum 8Р-А3 соответствует классическим представлениям токсикологии о положительном влиянии малых доз токсичных веществ. Хотя данное явление имеет место при действии химических веществ на биологические системы разных уровней организации (организменный, клеточный, субклеточный), его механизм в большинстве случаев неясен и в настоящее время четкое объяснение природы этого феномена отсутствует [1].
Рассмотрев действие ряда стрессоров химической и физической природы на биосинтез NO бактериями L. plantarum 8Р-А3, мы обнаружили, что продукция NO увеличивается только в ответ на сильное стрессовое воздействие, сопровождающееся значительным снижением жизнеспособности микробных клеток: нагревание при 70 и 80C, продолжительное культивирование, токсическое действие АОБ. Стресслимитирую-щее действие NO в организмах человека и животных
хорошо изучено [7]. В растениях, запуская неспецифические ответные реакции, NO выполняет защитную роль при ряде биотических и абиотических стрессов [16]. Ранее сообщалось об участии бактериального NO в адаптации бактерий к окислительному стрессу [21, 27]. Выявленное нами увеличение образования NO в ответ на высокотемпературный и другие типы стресса свидетельствует в пользу универсальности ключевых механизмов стресс-ответа клеток различного уровня организации и важной роли в них NO.
Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант № 09-04-97032), ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" П1275 от 09.06.2010 и ГК02.740.11.0391. Авторы выражают благодарность К. Бойерляйну (Институт фармакологии им. Рудольфа Буххайма, г. Гиссен, Германия) за помощь в проведении флюоресцентной микроскопии.
Сведения об авторах Казанский (приволжский) федеральный университет
Смоленцева Ольга Александровна - аспирант каф. микробиологии, e-mail: olgasmolentseva@mail.ru.
Яруллина Дина Рашидовна - канд. биол. наук, ассистент каф. микробиологии, e-mail: kasfes@gmail. com.
Ильинская Ольга Николаевна - проф., д-р биол. наук, зав. каф. микробиологии, e-mail: Olga.Ilinskaya@ ksu.ru.
ЛИТЕРАТУРА
1. Булатов В. В., Хохоев Т. Х., Дикий В. В. и др. // Рос. хим. журн. -2002. - Т. 46,№ 6. - С. 58-62.
2. Васильева С. В., СтупаковаМ. В., ЛобышеваИ. И. и др. // Биохимия. - 2001. - Т. 66, вып. 9. - С. 1209-1214.
3. Васильева С. В., Ступакова М. В., Лобышева И. И. // Радиац. биол. Радиоэкол. - 2003. - Т. 43, № 4. - С. 464-469.
4. Васильева С. В., Мошковская Е. Ю. // Генетика. - 2005. - Т. 41, № 5. - С. 607-613.
5. ДорошенкоЕ. В., ЛойкоН. Г., Ильинская О. Н. и др. // Микробиология. - 2001. - Т. 70, № 6. - С. 811-819.
6. Знаменская Л. В., ХаритоноваМ. А., Каюмов А. Р., Краснов С. И. // Микробиология. - 2002. - Т. 71, № 6. - С. 801-808.
7. Малышев И. Ю., МанухинаЕ. Б. // Биохимия. - 1998. - Т. 63, вып. 7. - С. 992-1006.
8. Маргулис А. Б., Ильинская О. Н., Колпаков А. И., Муфер К. // Ученые зап. Казан. ун-та. Сер.: Естеств. науки. - 2005. - Т. 147, кн. 2. - С. 108-114.
9. Маргулис А. Б., Яруллина Д. Р., Колпаков А. И., Ильинская О. Н. // Ученые зап. Казан. ун-та. Сер.: Естеств. науки. - 2010. - Т. 152, кн. 2. - С. 137-144.
10. Мулюкин А. Л., Козлова А. Н., Капрельянц А. С., Эль-Регистан Г. И. // Микробиология. - 1998. - Т. 65, № 1. - С. 20-25.
11. Мулюкин А. Л., Филиппова С. Н., Козлова А. Н. и др. // Микробиология. - 2006. - Т. 75, № 4. - С. 472-482.
12. Яруллина Д. Р., Ильинская О. Н., Аганов А. В. и др. // Микробиология. - 2006. - Т. 75, № 6. - С. 731-736.
13. Яруллина Д. Р., Ильинская О. Н. // Молекул. биол. - 2007. - Т. 41, № 5. - С. 900-907.
14. Яруллина Д. Р., Ильинская О. Н. // Микробиология. - 2007. - Т. 76, № 4. - С. 570-572.
15. Alderton W. K., Cooper C. E., KnowlesR. G. // Biochem. J. - 2001.
- Vol. 357. - P. 593-615.
16. ArasimowiczaM., Floryszak-Wieczorek J. // Plant. Sci. - 2007. - Vol. 172. - P. 876-887.
17. CraneB. R., Sudhamsu J., PatelB. A. // Annu. Rev. Biochem. - 2010.
- Vol. 79. - P. 445-470.
18. De Angelis M., Di Cagno R., Huet C. et al. // Appl. Environ. Microbiol. - 2004. - Vol. 70, N 3. - P. 1336-1346.
19. Demple B. // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. - 1999. - Vol. 26. - P. 64-68.
20. Di Cagno R., Buchin S., de Candia S. et al. // J. Dairy Sci. - 2006. -Vol. 90. - P. 2689-2704.
21. Gusarov I., Nudler E. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2005. - Vol. 102, N 39. - P. 13855-13860.
22. Ilinskaya O. N., Zelenikhin P. V., Petrushanko I. Y. et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2007. - Vol. 361, N 4. - P. 1000-1005.
23. Leschinskaya I. B., Kupriyanova F. G., Yakovlev G. I. et al. // Karadeniz J. Med. Sci. - 1995. - Vol. 8, N 4. - P. 218-219.
24. Makarov A. A., Kolchinsky A., Ilinskaya O. N. // BioEssays. - 2008. - Vol. 30. - P. 781-790.
25. MalyshevI. Yu., Malugin A. V, GolubevaL. Yu. et al. // FEBS Lett. -1996. - Vol. 391. - P. 21-23.
26. MayerM. P., BukauB. // Cell Mol. Life Sci. - 2005. - Vol. 62. - P. 670-684.
27. Shatalin K., Gusarov I., Avetissova E. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2008. - Vol. 105. - P. 1009-1013.
28. SikoraA., GrzesiukE. // J. Physiol. Pharmacol. - 2007. - Vol. 58. - P. 43-62.
Поступила 09.06.11
INDUCTION OF THE NO SYNTHESIS IN LACTOBACILLI UNDER STRESS CONDITIONS
O. A. Smolentseva, D. R. Yarullina, O. N. Ilinskaya Kazan (Volga Region) Federal University, Kazan, Russia
An increase in the nitric oxide (NO) biosynthesis in Lactobacillus plantarum 8Р-А3 cells takes place under strong stress influence, which leads to a considerable decrease in the microbial cell viability: heating at 70оС and 80оС, prolonged cultivation, toxic effect of hexylresorcinol. The factors, which do not lead to cell death, such as heating at 60оС, 50 ^g/ml homoserine lactone, Bacillus intermedius 7P ribonuclease (binase) in concentrations up to 300 ^g/ml, do not induce NO synthesis. The activation of the NO biosynthesis in response to stress treatment evidences to universality of key-mechanisms of stress response in cells differing in the level of their organization as well as to important role of nitric oxide in them.
Key words: nitric oxide (NO), Lactobacillus plantarum, high-temperature stress, homoserine lactone, hexylresorcinol, ribonuclease Bacillus intermedius 7P (binase).
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 579.841.31:579.25].083.1
Ан. Х. Баймиев1, Е. С. Иванова1, К. Г. Птицын1, А. А. Белимов2, В. И. Сафронова2,
Ал. Х. Баймиев1
генетическая характеристика клубеньковых бактерий дикорастущих бобовых южного урала
1Лаборатория молекулярной биологии и нанобиотехнологии Учреждения Российской академии наук Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН; Лаборатория ризосферных микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии Российской академии
сельскохозяйственных наук, ГНУ, г Пушкин
Исследованы генетическое разнообразие и филогения клубеньковых бактерий, вступающих в симбиоз с 18 видами дикорастущих бобовых растений Южного Урала из 8 родов, принадлежащих 4 трибам: Loteae, Genisteae, Galegeae, Hedysareae. Показано, что для дикорастущих видов триб Galegeae и Hedysareae характерно симбиотическое взаимодействие с различными штаммами клубеньковых бактерий, филогенетически близких бактериям рода Mesorhizobium, для видов трибы Genisteae - бактериям рода Bradyrhizobium. Из трибы Loteae у Lotus ucrainicus в клубеньках обнаружены ризобии, филогенетически близкие бактериям рода Mesorhizobium, а у Coronilla varia полученные нами штаммы были близки по последовательности гена 165 рРНК к Rhizobium sp. В клубеньках некоторых видов исследованных растений обнаружены также минорные виды ризобий, на состав которых большое влияние имеет условие произрастания хозяйского растения.
Ключевые слова: ризобии, клубеньковые бактерии, бобовые растения, симбиоз, филогения, генетическое разнообразие
Бобовые растения в природных экосистемах играют огромную роль. За счет своей уникальной способности вступать в симбиоз с азотфиксирующими клубеньковыми бактериями они имеют возможность обеспечивать азотом не только себя, но и обогащать им почву, на которой они произрастают, и тем самым влиять на ее плодородие. Продуктивность бобовых культур, их урожай, накопление ими биологического азота в значительной степени зависят от характера взаимоотношений макро- и микросимбионтов. Зависимость бобовых растений, особенно дикорастущих, от клубеньковых бактерий велика, поскольку мутуалистический симбиоз с микроорганизмами предоставляет им дополнительные возможности для выживания в условиях дефицита азота. В то же время симбиотрофные бактерии также получают преимущество над свободно-живущими бактериями, так как в обмен на доступный
азот растение предоставляет им продукты фотосинтеза и экологическую нишу. Образование взаимовыгодного симбиоза приводит к приобретению симбиотической системой новых адаптивных свойств, которыми не обладают симбионты по отдельности [6].
В ходе длительной совместной эволюции бобовых растений и клубеньковых бактерий возникла система сигнального взаимодействия между симбионтами, обеспечивающая специфическое узнавание партнеров и ведущая к их генетической интеграции [8]. Уровень специфичности взаимодействия бобовых с ризобиями у разных видов различается. Для примитивных тропических бобовых характерна низкая специфичность, тогда как эволюционно молодые бобовые умеренного климата проявляют высокую избирательность при выборе сим-биотических партнеров, вплоть до абсолютно строгой специфичности для некоторых из них, проявляющейся в способности вступать в симбиоз только с определенными видами клубеньковых бактерий. Классическим примером такого взаимодействия является симбиоз козлятника восточного Galega orientalis с Rhizobium galegae.
Ареал распространения дикорастущих бобовых умеренной зоны в связи с их тесной взаимосвязью с клубеньковыми бактериями и относительно высокой специфичностью их взаимодействия определяется не только подходящими условиями существования для растений, но и наличием в данной почве "подходящих" ризобий.
Мы исследовали генетическое разнообразие и филогению клубеньковых бактерий 18 видов дикорастущих бобовых Южного Урала, относящихся к 4 трибам (8 родам), собранных с клубеньков растений, которые произрастают в своих естественных ареалах.
