CC BY
100
Вестник Челябинского государственного университета. 2013. № 7 (298).
Биология. Вып. 2. С. 55-57.
И. В. Грязева, О. К. Давыдова
РОЛЬ АЛКИЛОКСИБЕНЗОЛОВ В РЕГУЛЯЦИИ СТРЕССОВОГО ОТВЕТА БАКТЕРИЙ
Исследовано влияние пяти гомологов ауторегуляторных молекул из группы алкилоксибензолов (АОБ) на стрессовый ответ бактериальных клеток, оценённый на основе люминесцентного отклика биосенсоров: ibpA при температурном воздействии, recA при УФ-облучении и soxS при окислительном стрессе. Показана зависимость эффектов от структуры и концентрации использованных гомологов АОБ.
Ключевые слова: алкилоксибензолы, Escherichia coli, ген-репортер, 1их-биосенсор, стресс, белки теплового шока, SOS-система, окислитель.
Введение. Существование микроорганизмов происходит на фоне постоянных стрессовых воздействий, определяемых крайней изменчивостью условий окружения. Длительная эволюция микроорганизмов в природе способствовала формированию ряда защитных реакций, включающих индукцию транскрипции стрессовых белков, таких как белки теплового шока, функционирование систем репарации ДНК, работу ферментов антиоксидантной защиты [1].
Наряду с этим в последние годы в вопросе об адаптации бактерий к стрессу всё большее внимание уделяется низкомолекулярным, видонеспецифичным молекулам — ауторегуляторам, представленным у ряда бактерий и дрожжей ал-килоксибензолами (АОБ) [2]. Индуцируя переход микробной популяции в гипометаболическое покоящееся состояние [3], АОБ обеспечивают формирование устойчивости составляющих её клеток к широкому спектру стрессовых факторов [4]. Механизм данных защитных эффектов, с одной стороны, связывают с прямой протекцией бактериальных клеток ауторегуляторами от повреждающего воздействия [5], с другой стороны, объясняют функционированием АОБ в качестве сигналов тревоги, опосредованным через контроль экспрессии стрессовых регулонов [6]. Сказанное определило интерес к выяснению целостной картины взаимоотношений между указанными системами антистрессовой защиты клетки с уточнением роли в данном процессе АОБ.
Цель. Изучение влияния широкого ряда гомологов АОБ на стрессовый ответ бактериальных клеток при тепловом шоке, УФ-облучении и воздействии окислителей.
Материалы и методы. При проведении исследований использовали химически синтезированные аналоги ауторегуляторных факторов бактерий, представленные коммерчески доступными
препаратами С7-АОБ, С11-АОБ и С12-АОБ (Sigma, США), а также вновь синтезированными С9-АОБ и С18-АОБ (Enamine, Украина).
В качестве основного объекта использовали любезно предоставленные И. В. Мануховым (ГосНИИгенетика, Россия), сконструированные генно-инженерными методами специфические lux-биосенсоры Escherichia coli, позволяющие с высокой чувствительностью и специфичностью проводить количественную оценку функционирования стрессовых регулонов [7]. Данные штаммы характеризуются наличием клонированной полной кассеты lux-генов Photorhabdus luminescence, промоторы которых обеспечивают дифференцированную индукцию свечения при воздействиях стрессоров определённой специфичности. Используемые штаммы выращивали в течение 16-18 ч при 37 °С на LB-бульоне (Sigma, США) в присутствии 20 мкг/мл антибиотика ампициллина, являющегося селективным фактором плазмиды, несущей lux-гены. Перед постановкой эксперимента культуру дополнительно разводили той же свежей питательной средой и инкубировали ещё 3-5 ч до достижения ОП = 0,2 ед. при 640 нм. Полученную биомассу смешивали с АОБ до конечных концентраций 10-6, 10-5, 10-4 и 10-3 М, а также с использованной для их разведения дистиллированной водой (контроль) и выдерживали в течение 60 мин.
Температурное воздействие осуществляли путём инкубации аликвот суспензий по 300 мкл в твёрдотельном термостате «Термит» («ДНК-Технология», Россия) при 55 °С в течение 5 мин. УФ-облучение клеток в объёме 1 мл осуществлялось с использованием широкополосной ртутнокварцевой лампы (Osram, Германия) с расстояния 10 см через интерференционный светофильтр с максимумом пропускания в области 254 нм, обеспечивающей преимущественное повреждение
ДНК бактериальных клеток. Окисление осуществлялось путём инкубации аликвот суспензий по 300 мкл в присутствии индуктора окислительного стресса параквата (Sigma Chemical Co, США) в концентрации 4 • 10-3 М в течение 10 мин. Отбор проб после стрессового воздействия проводился в объёме 100 мкл, интенсивность биолюминесценции измеряли с использованием микроплан-шетного биолюминометра LM 01T (Immunotech, Чехия).
Количественную оценку индукции биолюминесценции проводили по формуле
luxAi ■ B0 i — , luxAo ■ Bi
где luxA0 — световая эмиссия суспензии клеток до стрессового воздействия; luxA. — световая эмиссия суспензии клеток непосредственно после стрессового воздействия; В0 — количество жизнеспособных клеток до стрессового воздействия; В — количество жизнеспособных клеток после
I
стрессового воздействия.
Параллельно измерению интенсивности биолюминесценции проводили учёт жизнеспособных клеток, высевая аликвоты по 10 мкл на поверхность LB-агара с последующей инкубацией в течение 24 ч при 37 °С и подсчётом количества колониеобразующих единиц (КОЕ).
Результаты и обсуждение. Предметом первого фрагмента проведённых экспериментальных исследований явилось изучение роли АОБ в ответе бактериальных клеток на температурное воздействие, оцениваемое по уровню биолюминес-центного отклика E. coli ibpA’::lux, соответствующего индукции белков теплового шока (в частности, белка-шаперона IbpA). Проведение предварительного эксперимента, направленного на выявление собственного влияния АОБ в отношении штамма E. coli ibpA ’::lux, позволило обнаружить дозозависимые эффекты на уровень свечения и ростовую способность клеток. Основанный на этих данных расчёт фактора индукции биолюминесценции (F) позволил выявить зависимость экспрессии стрессовых регулонов от концентрации АОБ, выраженную в слабой индукции гена ibpA малыми концентрациями ауторегуляторов, но в значительной репрессии указанного гена при увеличении присутствия данных молекул до концентрации 10-3 М.
Регистрация исследуемых параметров при нагревании клеток, предварительно инкубированных с различными гомологами АОБ, позволила
выявить ряд взаимосвязанных эффектов, определяемых как концентрацией, так и строением АОБ, а именно длинной алкильного радикала. Так, было обнаружено, что короткоцепочечные АОБ (С7-, С9-АОБ), обусловливая подавление синтеза белков теплового шока, ведут к формированию повышенной терморезистентности клеток, что подтверждается данными их ростовой способности. В свою очередь, длинноцепочечные АОБ (С11-, С12-, С18-АОБ) в низких концентрациях вызывают умеренную индукцию шаперонов, защищая клетки от последующего нагревания, а в высоких — обусловливают выраженную репрессию их синтеза, что в последующем ведёт к повышению чувствительности клеток к нагреванию (рисунок, а).
Второй блок исследований был посвящён изучению роли АОБ в ответе бактериальных клеток на УФ-облучение, оцениваемое по уровню биолюминесцентного отклика E. coli recA‘::lux, соответствующего индукции гена recA, вовлечённого в систему SOS-ответа. Анализ собственных эффектов АОБ в отношении данного штамма продемонстрировал сходный с предыдущим штаммом характер влияния, заключающийся в снижении абсолютных значений биолюминесценции, а также уменьшении оцениваемого количества КОЕ.
Проведённое комплексное исследование эффектов АОБ на уровень активации SOS-системы при воздействии УФ-излучения позволило обнаружить существенную репрессию SOS-ответа, прогрессирующую с увеличением длины алкильного радикала, а следовательно, и гидрофобности молекулы. Результаты свидетельствуют о преимущественно ингибирующем характере влияния АОБ на SOS-ответ клеток при их облучении летальной интенсивности на фоне сохранения исходного количества жизнеспособных клеток (рисунок, б).
Третий фрагмент работы был направлен на выявление роли АОБ в ответе бактериальных клеток на воздействие окислителя — параквата, оцениваемом по уровню отклика E. coli soxS’::lux, соответствующего индукции гена soxS, являющегося транскрипционным активатором ряда генов, обеспечивающих ответ клетки на присутствие окислителя. Исследование собственных эффектов АОБ позволило констатировать аналогичную зависимость от особенностей химического строения используемых гомологов и их концентрации.
Исследование влияние АОБ на уровень индук-
F , %
F , %
F , %
CV-АОБ C9-АОБ і Cii-АОБ
И2-АОБ
CiS-АОБ
б
а
в
4
Значения фактора индукции биолюминесценции (ось ординат) биосенсоров при соответствующем стрессовом воздействии после предварительной инкубации с АОБ в различных концентрациях (ось абсцисс)' а) E. coli ibpA ’''lux; б) E. coli recA ‘''lux; в) E. coli soxS’r.lux
ции гена soxS в присутствии параквата позволило обнаружить разнонаправленные эффекты (рисунок, в). Длинноцепочечные гомологи в небольших концентрациях (10-6 и 10-5 М) индуцируют активацию SoxS-регулона, в концентрации 10-4 М демонстрируют антиоксидантные эффекты, снижая уровень биолюминесценции ниже контрольных значений, и при увеличении их присутствия до 10-3 М приводят к отключению стрессового ре-гулона. Короткоцепочечные АОБ блокируют активацию регулона с одновременным снижением чувствительности бактериальных клеток к воздействию окислителя, что выражается в сохранении большего количества жизнеспособных клеток; защитный эффект возрастает с увеличением концентрации АОБ.
В целом результаты проведённого исследования позволяют определить потенциальные мишени АОБ, задействованные в развитии позитивной и негативной регуляции стрессовых генов, что представляет большой интерес для дальнейшего практического использования в экологии, биотехнологии, медицине и ветеринарии.
Список литературы
1. Ткаченко, А. Г Молекулярные механизмы стрессорных ответов у микроорганизмов. Екатеринбург : УрО РАН, 2012. 265 с.
2. Эль-Регистан, Г И. Адаптогенные функции внеклеточных ауторегуляторов микроорганизмов
/ Г. И. Эль-Регистан, А. Л. Мулюкин, Ю. А. Николаев, Н. Е. Сузина, В. Ф. Г альченко, В. И. Дуда // Микробиология. 2006. Т. У5, № 4. С. 446-456.
3. Mulyukin, A. L. Formation of resting cell by non-spore-forming microorganisms as a strategy of long-term survival in the environment / A. L. Mu-lyukin, V. S. Soina, E. V. Demkina, A. N. Kozlova, N. E. Suzina, V. V. Dmitriev, V. I. Duda, G. I. El-Registan // Proc. SPIE. 2003. Vol. 4939. P. 208-2i8.
4. Николаев, Ю. А. Роль алкилоксибензолов в адаптации бактерий к неблагоприятным условиям роста / Ю. А. Николаев, А. Л. Тарасов, И. А. Борзенков, В. Ф. Г альченко, Г. И. Эль-Регистан // Микробиология. 20i0. Т. У9, № 6. С. У60-У66.
5. Капрельянц, А. С. Структурно-функциональные изменения в бактериальных и модельных мембранах под действием фенольных липидов /
A. С. Капрельянц, М. К. Сулейменов, А. Д. Сорокина // Биол. мембраны. 198У. Т. 4, № 3. С. 254-26i.
6. Голод, Н. А. Роль микробных ауторегуляторов — алкилоксибензолов в контроле экспрессии стрессовых регулонов / Н. А. Голод, Н. Г. Лой-ко, К. В. Лобанов, А. С. Миронов, Т. А. Воейкова,
B. Ф. Гальченко, Ю. А. Николаев, Г. И. Эль-Регистан // Микробиология. 2009. Т. У8, № 6. С. У31-У41.
У. Манухов, И. В. Lux-биосенсоры для детекции SOS-ответа, теплового шока и окислительного стресса / И. В. Манухов, В. Ю. Котова, Г. Б. Завильгельский // Биотехнология. 2009. № 6.
C. i6-25.
