CC BY
6
160
МАТЕРИАЛЫ V НАЦИОНАЛЬНОГО КОНГРЕССА ПО РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЕ
КОЛЛАГЕНЫ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ В КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЯХ
Ю.А. Нащекина, М.С. Сироткина, Н.А. Михайлова
Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия e-mail: nashchekina.yu@mail.ru
Ключевые слова: коллагены I, IV, V типов, кислотная и ферментативная экстракция, коллагеновые носители для культивирования клеток.
Роль внеклеточного матрикса для решения актуальных задач клеточной терапии и регенеративной медицины сложно переоценить. Выделенные из тканей клетки, даже на ранних пассажах культивирования на культуральном пластике, существенно меняют свои функциональные свойства и фенотип. Такие изменения, прежде всего, обусловлены потерей естественного клеточного окружения при переводе клеток из нативной ткани в условия in vitro, в связи с чем, воссоздание естественного микроокружения клеток in vitro является важной задачей современной клеточной биологии и регенеративной медицины.
Коллаген является преобладающим компонентом внеклеточного матрикса и выполняет не только структурную, но и функциональную роль в соединительной ткани. На сегодняшний день известно около 30 различных типов коллагенов, которые обнаружены практически во всех видах соединительной ткани, где они выполняют конкретные функции. В зависимости от типа клеток, выделенных из определенной ткани, требуется создать носитель на основе коллагена соответствующего типа или сочетания коллагенов разных типов. Являясь фибрил-лобразующим, коллаген I типа входит в состав покровных тканей в виде композитных структур с коллагеном IV типа, а в роговице — с коллагеном V типа.
Целью данной работы было выделение коллагенов трех типов и разработка на их основе носителей, воспроизводящих нативную структуру клеточного матрикса покровных тканей и роговицы, и предназначенных для культивирования и трансплантации клеток.
Коллаген I типа был экстрагирован методом кислотной экстракции из сухожилий крысиных хвостов, коллагены IV и V типов получены методом ферментативной экстракции из плаценты человека. Все белки были охарактеризованы методом иммуноблотинга и ИК-Фурье спектроскопии. Показано, что степень чистоты получаемых коллагенов превышает 99%. На основе коллагенов трех типов были сформированы композитные носители в виде пленок и гелей. Структуру полученных субстратов анализировали с помощью методов атомно-силовой, сканирующей электронной и иммунофлуоресцентной микроскопии. В результате работы получены субстраты на основе фибриллярных структур коллагена. При анализе композитных структур на основе коллагенов I и IV типов, а также I и V типов показано, что способность коллагена I типа формировать in vitro нативные фибриллы в присутствии коллагенов других типов не теряется. В то же время, при добавлении к коллагену I типа коллагена V типа, диаметр фибрилл уменьшается, что согласуется с опубликованными ранее данными по исследованию нативной роговицы.
На полученных субстратах культивировали клетки ме-зенхимного и эпителиального происхождения. Методом МТТ анализа и флуоресцентной микроскопии продемонстрированы не только отсутствие цитотоксичности, но и высокий адгезивный и пролиферативный потенциал клеток, культивируемых на композитных коллагеновых субстратах. Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 20-03-00400 А.
IN VITRO ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ ГЕН-
АКТИВИРОВАННЫХ МАТРИКСОВ НА ОСНОВЕ
КОЛЛАГЕНА И ФИБРИНА
И.А. Недорубова1, В.О. Мокроусова1, 2,
А.Ю. Меглей2, В.П. Басина3,
Т.Б. Бухарова1, Д.В. Гольдштейн1
1 ФГБНУ Медико-генетический научный центр им. академика Н.П. Бочкова, Москва, Россия
2 ФГБУ НМИЦ ЦНИИСиЧЛХ Минздрава России, Москва, Россия
3 ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, Москва, Россия
e-mail: nedorubova.ia@gmail.com
Ключевые слова: ген-активированные матриксы, плазмид-
ная ДНК, BMP-2, коллаген, PRP.
В настоящее время в регенеративной медицине для замещения дефектов костной ткани особенно актуальна разработка биосовместимых биорезорбируемых ма-триксов, содержащих плазмидные конструкции с генами остеоиндукторов. Цель данной работы — in vitro исследование свойств ген-активированных матриксов на основе коллагена и фибрина, импрегнированных полиплексами с геном костного морфогенетического белка 2 (BMP2).
Материалы и методы. Были сформированы матриксы, состоящие из гидрогелей коллагена I типа и фибрина, полученного на основе обогащенной тромбоцитами плазмы (Platelet Rich Plasma, PRP), в соотношении 1:2 по объемным долям. Исследование проводили на культурах мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (MMCK) жировой ткани крыс. Цитотоксичность матриксов исследовали в течение 7 суток методом МТТ-теста и с помощью флуоресцентной микроскопии: все клетки были окрашены PKH-26, живые клетки окрашивались кальцеином АМ, а мертвые клетки — DAPI. В качестве трансфицирующего агента для формирования полиплексов использовали Turbofect. Эффективность трансфекции при использовании матриксов, импрегнированных полиплексами с геном усиленного зеленого флуоресцентного белка (EGFP), оценивали по наличию клеток, содержащих флуоресцентный белок GFP, их количество определяли методом проточной цитофлуориметрии в течение 14 суток. Уровень трансфекции при использовании полиплек-сов с геном BMP2, оценивали по уровню экспрессии данного гена методом ПЦР-РВ и наличию белка BMP-2 с помощью иммуноферментного анализа. Для оценки остеогенных свойств этих матриксов проводили окрашивание ализариновым красным минерализованного внеклеточного матрикса (ВКМ).
Результаты. Показано, что полученные матриксы на основе коллагена и PRP обладают высокой цито-совместимостью. Кроме того, входящие в состав PRP ростовые факторы способствуют лучшему делению клеток, и через 7 суток относительная жизнеспособность клеток в присутствии матриксов составляла 153,2 ± 16,6% по сравнению с контролем. Показано, что полиплексы с геном EGFP высвобождаются из ма-трикса и эффективно трансфицируют клетки на протяжении 14 суток. Культивирование ММСК в присутствии ген-активированных матриксов, импрегнированных по-липлексами с геном BMP2, через 21 сутки приводит к увеличению экспрессии гена BMP2 в 2727 ± 84 раз, повышению продукции белка BMP-2 в 24,5 ± 0,3 раза по сравнению с контролем, а также к усилению минерализации ВКМ.
МАТЕРИАЛЫ V НАЦИОНАЛЬНОГО КОНГРЕССА ПО РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЕ
1B1
Разработанные ген-активированные матриксы на основе коллагена и PRP, импрегнированные полиплексами с геном BMP2, обладают высокой цитосовместимостью, обеспечивают высокий уровень трансфекции культур ММСК и оказывают остеоиндуктивное действие in vitro, что позволяет рассматривать данные матриксы как перспективный материал для регенерации костной ткани. Работа выполнена в рамках государственного задания Минобрнауки России для ФГБНУ «МГНЦ».
ВЛИЯНИЕ ТРИПЕПТИДА PRO-GLY-PRO НА РЕГЕНЕРАЦИЮ НЕЙРОНАЛЬНОЙ КУЛЬТУРЫ ПРИ МЕХАНИЧЕСКОЙ ТРАВМЕ IN VITRO
A.А. Некрасова1, А.Е. Згодова1, М.М. Гончаров2,
B.Г. Пинелис1, С.Е. Бадмаева3, З.В. Бакаева1, 3
1 НМИЦ здоровья детей, Москва, Россия
2 Сколковский институт науки и технологий, Москва, Россия
3 Калмыцкий государственный университет им. Б.Б. Городовикова, Элиста, Россия
e-mail: nekrasovanas@gmail.com
Ключевые слова: первичная нейроглиальная культура, черепно-мозговая травма, глутаматная эксайтотоксичность, отсроченная кальциевая дизрегуляция, митохондриальный потенциал, Pro-Gly-Pro, нейропротекторный эффект.
Черепно-мозговая травма (ЧМТ) является ведущей причиной смерти и инвалидности в детском возрасте. В среднем число случаев ЧМТ составляет 0,3% численности детской популяции и сопровождается высоким уровнем смертности [1]. Исходя из патогенеза развития ЧМТ, активные вещества, действующие сразу после развития патологических процессов и способные влиять на несколько механизмов клеточной защиты, оставаясь при этом безвредными на системном уровне, имеют терапевтический потенциал для снижения объемов повреждения вследствие ЧМТ.
Ранее нами была разработана модель механической нейротравмы in vitro [2], позволяющая посредством одновременного измерения динамики [Ca2+]i и ATm отслеживать как острые, так и отставленные во времени эффекты механической травмы. Экспериментальная модель основана на том, что травма мозга сопровождается глутаматной эксайтотоксичностью, нарушением кальциевого гомеостаза и митохондриального потенциала.
Было показано, что эндогенный трипептид Pro-Gly-Pro (PGP), в экспериментах на первичной нейроглиаль-ной культуре [3] уменьшает нарушение кальциевого гомеостаза и оказывает нейропротекторный эффект в условиях глутаматной эксайтотоксичности.
В данной работе мы исследовали влияние PGP на выживаемость нейронов и изменения [Ca2+]i и ATm клеток первичной нейроглиальной культуры коры головного мозга после механического нарушения ее целостности in vitro.
Результаты показали, что при длительном воздействии на клеточную культуру PGP (10 рМ в течение 7 дней) увеличивает lag-период развития отсроченной кальциевой дизрегуляции (ОКД), способствует более быстрому наступлению реполяризации митохондрий и восстановлению исходно низких значений [Ca2+] i в нейронах после воздействия субтоксических (33 рМ) и токсических доз Glu (100 рМ). Другим аспектом его пролонгированного влияния на травмированные культуры
является увеличение выживаемости клеток, а также усиление их способности к миграции в повреждённую область. При однократном введении PGP (10 рМ) снижает амплитуду флуктуаций [Ca2+]i, индуцируемых механической травмой.
Таким образом, PGP, предотвращая развитие кальциевой дизрегуляции и митохондриальной дисфункции, защищает нейроны от гибели, вызванной механической травмой в модели in vitro. Полученные данные указывают на перспективность его использования для ограничения патологических процессов в посттравматический период. Исследование выполнено при финансовой поддержке Минздрава России, проект № ААААА19-119012590191-3, грантов Минобрнауки России, № ФГФУ-2022-0012.
Литература:
1. Сабиров Д.М., Росстальная А.Л., Махмудов М.А. Вестник экстренной медицины. 2019. № 2.
2. Bakaeva Z.V., Surin A.M., Pinelis V.G. et al. Dokl. Biochem. Bio-phys. 2020. V. 491(1).
3. Bakaeva Z., Goncharov M., Krasilnikova I. et al. Int. J. Mol. Sci. 2022. V. 23. P. 3858.
ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ РЕЦЕПТОРОВ
NOD-1, TLR8, ZBP-1, RIG-1 В МИОМЕТРИИ
ПРИ ПРЕЭКЛАМПСИИ
Н.В. Низяева1, Э.Ю. Амирасланов2,
К.А. Артемьева1, И.А. Степанова1,
М.В. Шамаракова3, Н.Б. Тихонова1
1 НИИМЧ им. А.П. Авцына ФГБНУ РНЦХ им. Б.В. Петровского, Москва, Россия
2 ФГБУ НМИЦ акушерства, гинекологии
и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздрава РФ, Москва, Россия
3 Центр Планирования семьи и Репродукции (ЦпСиР), Москва, Россия
e-mail: sunset_whitch@mail.ru
Ключевые слова: преэклампсия, миометрий, паттерн-рас-
познающие рецепторы.
Патогенез ПЭ связывают с неполноценностью тро-фобласта и недостаточной трансформацией спиральных артерий [1]. Экспрессия паттерн-распознающих рецепторов (ПРР) в миометрии при ПЭ практически не изучена.
Работа выполнена на образцах миометрия 22 женщин 18-43 лет, на сроке 27-39 недель гестации. У 12 пациенток диагностировали ПЭ (6 — тяжелое течение, 6 — умеренное), группу контроля составили 10 женщин с не-осложнённой доношенной беременностью. Этическая экспертиза: протокол заседания комитета по этике биомедицинских исследований ФГБУ «НМИЦАГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России № 6 от 09.06.2016. Все женщины подписали добровольное информированное согласие на участие в исследовании. Фрагменты миометрия размерами 1 х0,5-0,7х0,3 см получали во время кесарева сечения с передней стенки матки. На парафиновых срезах выполняли иммуногистохи-мическое (ИГХ) исследование с применением антител (АТ) к TLR (Toll-like receptor) 8, NOD (nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein)-1, RIG (retinoic acid-inducible gene)-1, ZBP (zip-code-binding protein)-1. Интенсивность ИГХ окрашивания оценивали в единицах оптической плотности с помощью микроскопа Nikon Eclipse (х400) и программного обеспечения NIS-Elements
