CC BY
49
Инфекционные болезни,
иммунология, иммунотерапия
УДК 616.36-002.2-085.37 Л.Ф. Скляр, Е.В. Маркелова, Ю.А. Ли, И.С. Горелова
ИММУНОТРОПНЫЕ ЭФФЕКТЫ РОНКОЛЕЙКИНА НА ФОНЕ ПРОТИВОВИРУСНОЙ ТЕРАПИИ ХРОНИЧЕСКОГО ГЕПАТИТА С
Владивостокский государственный медицинский университет, 690002, пр. Острякова, д.2, тел.: 8-(423)-242-97-78, е-mail: mail@vgmu.ru, г. Владивосток
Резюме
Противовирусная терапия при хроническом вирусном гепатите С должна осуществляться с проведением имму-нореабилитационных мероприятий, направленных, в первую очередь, на стимуляцию клеточного звена иммунной системы и процессы элиминации циркулирующих иммунных комплексов. В данной работе изучалась динамика концентраций молекулярных фракций циркулирующих иммунных комплексов, содержания иммуноглобулинов и оценка показателей фагоцитоза на фоне комплексного лечения хронического вирусного гепатита С, включающего в себя традиционную противовирусную терапию в составе пролонгированных интерферонов в сочетании с рибави-рином и иммунокорригирующую терапию ронколейкином. Использование ронколейкина в составе комплексного лечения ХВГС определяет возможность создания новых оригинальных протоколов лечения.
Ключевые слова: гепатит С, ронколейкин, иммунореабилитация.
L.F. Sklyar, Е.У. Ма^^^ YA. Lie, I.S. Gorelova
IMMUNOTROPIC EFFECT OF RONKOLEUKIN AT THE BACKGROUND OF CHRONOC
HEPATITIS C THERAPY
Vladivostok State Medical university, Vladivostok Summary
Hepatitis C antiviral therapy should be followed by immune rehabilitation measures, first of all, aimed at T-cell immunity stimulation and elimination of circulating immune complexes. We studied concentration dynamics of molecular fractions of circulating immune complex, immunoglobulins and phagocytosis indices during combined hepatitis C antiviral therapy, including traditional antiviral therapy (PEG-ineterferon+ribavirin) and immunotropic component (Ronkoleukin). Ronkoleukin in combined hepatitis C antiviral therapy makes possible to work out a new original treatment protocols .
Key words: hepatitis C, ronkoleukin, immune rehabilitation.
Хроническая вирусная инфекция характеризуется постоянным наличием антигена в организме, что, соответственно, приводит к повышению образования циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК). Снижение реактивности клеточного звена адаптивного иммунитета может совпадать с понижением функциональной активности фагоцитирующих клеток, что, в свою очередь, также ведет к увеличению уровня ЦИК [8, 11]. Известно, что макрофаги и нейтрофильные гранулоциты являются ключевыми клетками, участвующими в утилизации иммунных комплексов из периферической крови [1, 11]. При Т-клеточном иммунодефиците дополнительная антигенная нагрузка может привести к активации антиген-неспецифических механизмов иммунитета (например, связанных с двойны-
ми негативными лимфоцитами), что малоэффективно для элиминации антигенов, и, с другой стороны, является основой формирования аутоиммунных реакций и лимфопролиферативных заболеваний [1, 2]. У пациентов с хроническим вирусным гепатитом (ХВГ) вторичная иммунная недостаточность характеризуется снижением относительного и абсолютного уровня CD3+, CD4+ и CD8+ клеток. При этом количество В-лимфоцитов компенсаторно повышается. Повышение содержания В-клеток сопровождается усилением их функциональной активности с гиперпродукцией иммуноглобулинов и циркулирующих иммунных комплексов, что подтверждает важную роль ЦИК в иммунопатологических процессах при ХВГ независимо от этиологического фактора [4, 10]. При выборе лечеб-
ной тактики необходимо учитывать размер ЦИК. Так, при наличии в циркуляции крупных ЦИК, необходима стимуляция фагоцитоза для их удаления. При преобладании мелких и средних патогенных ЦИК необходимы мероприятия по их укрупнению (УФ-облучение крови, плазмаферез и т.п.) с последующим стимулированием систем, ответственных за клиренс ЦИК. Известно, что в запуске и координации адаптивных механизмов им-мунореактивности решающее значение имеют цито-кины, в частности, интерейкин-2 (ИЛ-2) [5]. Дефицит эндогенного ИЛ-2 может приводить к нарушениям в клеточной системе иммунитета, а также влиять на эффективность работы компонентов врожденного иммунитета [5, 6]. Восстановление Т-клеточного пула и нормального функционирования системы иммунореак-тивности в этих условиях возможно только при проведении иммунозаместительной терапии экзогенным ИЛ-2. Включение рекомбинантного ИЛ-2 (ронколейкина) в комплексное лечение ХВГ будет способствовать восстановлению иммунореактивности с последующим развитием каскада клеточно-опосредованных реакций иммунного ответа, что, возможно, приведет к снижению числа рецидивов и предотвращению прогрессирования хронического процесса с исходом в цирроз [9, 10]. Следовательно, противовирусная терапия (ПВТ) при ХВГ должна осуществляться с проведением иммунореаби-литационных мероприятий, направленных, в первую очередь, на стимуляцию клеточного звена иммунной системы и процессы элиминации ЦИК. Все вышеперечисленное является патогенетическим обоснованием для включения в программу комплексной терапии ХВГ ронколейкина. Препарат ронколейкин - рекомбинант-ный интерлейкин-2 человека - является одним из лекарственных средств, используемых при проведении цито-кинотерапии. Ронколейкин для инъекций (Яопсо1еикт, регистрационное удостоверение № 000122/01 - 2000) -лекарственная форма рекомбинантного интерлейкина-2 человека (гШ-2), выделенного и очищенного из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae, в генетический аппарат которых встроен ген человеческого ГЬ-2. Ронколейкин выпускают в ампулах в дозах по 1мг (1 000 000 МЕ), 0,5 мг (500 000 МЕ), 0,25 мг (250 000 МЕ) действующего начала гГЬ-2. Рекомбинантный интерлейкин-2 человека (гГЬ-2) - белок с молекулярной массой 15300 ± 200 Да. гГЬ-2 человека - структурный и функциональный аналог эндогенного ГЬ-2. Цитокиновые препараты обладают замещающими и регуляторными эффектами, а способность ронколейкина клонально активировать Т- и В-составляющие адаптивного иммунитета позволяет констатировать наличие у него свойств, характерных для средств активной иммунотерапии. В организме ронколейкин и подобные ему цитокиновые препараты являются средствами как замещающего (восполняющего), так и индуктивного типа действия. Целью настоящего исследования являлось изучение динамики концентраций молекулярных фракций ЦИК, содержания иммуноглобулинов и оценка показателей фагоцитоза на фоне комплексного лечения хронического вирусного гепатита С (ХВГС), включающего в себя традиционную противовирусную терапию (ПВТ) в составе пролонгированных интерферонов в сочетании с рибавирином и иммунокорригирующую терапию ронколейкином.
Материалы и методы
Проведено комплексное клинико-лабораторное обследование 41 пациента (21 женщина и 20 мужчин) с ХВГС. Основную группу составили 19 больных, которым проводили ПВТ с ронколейкином. В группе сравнения находились пациенты (22 чел.) только с ПВТ без включения ронколейкина. Группы были сопоставимы по возрасту, полу, длительности хронического заболевания и компонентам ПВТ (пегинтерферон-а2 и риба-вирин). Ронколейкин в основной группе вводили по 500 000 ЕД подкожно в плечо два раза в неделю одновременно с ПВТ курсом 8 нед. (2 мес.). Курсовая доза составила 16 инъекций. Все пациенты находились в периоде репликативной вирусной активности, установленной методом ПЦР (АмплиСенс монитор ГЯТ, аналитическая чувствительность 300 МЕ/мл), и обследованы в соответствии с общепринятым клинико-лабораторным стандартом, включая биохимические тесты, инструментальное обследование в виде УЗИ гепатобилиарного тракта и биопсии и/или фиброска-нирования печени. В качестве контроля обследовали 14 практически здоровых добровольцев. Содержание иммуноглобулинов классов А, М, G в сыворотке крови измеряли методом турбодиметрии на автоматическом анализаторе белков «ТигЬох» (Финляндия). Концентрацию ЦИК в сыворотке крови определяли методом селективной преципитации в полиэтиленгликоле (в модификации Ю.А. Граневич). Размер ЦИК оценивали по коэффициенту К=С1/С2, где С1 и С2 - концентрации иммунных комплексов в сыворотке больного, выделенные соответственно при преципитации 4 и 3% ПЭГ Для определения размеров ЦИК были приняты следующие критерии: комплексы считали крупными при 1<К<1,1, средними - при 1,1<К<1,5, мелкими -при К>1,5. Для оценки состояния фагоцитарной защиты использовали определение в крови фагоцитарной активности нейтрофилов с помощью фагоцитарного индекса (ФИ) и фагоцитарного числа (ФЧ), бактерицидной активности лейкоцитов методом базального и стимулированного НСТ-теста по индексу активности нейтрофилов (ИАН). Результаты исследований рассчитывали, используя оценку среднего значения, его ошибки, коэффициент корреляции (г), критерий Спирмена (Я) и Крускала-Уоллиса (кКЖ), достоверность статистических показателей (р) - при помощи программы Statistica7.0 (StatSoftInc., 2004).
Результаты и обсуждение
До начала лечения в обеих группах обследованных больных отмечалось повышение количества ЦИК, в среднем в 1,7 раза по отношению к норме (р<0,01), что согласуется с литературными данными большинства исследователей (табл. 1) [1, 7, 11]. Однако наличие повышенной концентрации ЦИК в сыворотке крови больных еще не означает их участие в патогенезе заболевания. В значительной степени это зависит от размеров образующихся иммунных комплексов, определяющих дальнейшую направленность их преобразования в организме. Это повышение имело место, главным образом, за счет увеличения количества среднемоле-кулярных иммунных комплексов, количество которых возрастало в абсолютном исчислении в 2,2 раза по
отношению к соответствующему показателю нормы (р<0,01). Количество мелкомолекулярных иммунных комплексов в абсолютном исчислении возрастало в 2,2 раза, в то время как абсолютное содержание крупномолекулярных комплексов практически не менялось. Суммарно содержание средне- и мелкомолекулярной фракций ЦИК составляло до лечения в основной группе 320,8±44,5 у.е., а в группе сравнения - 337,1±58,6 у.е. при норме 158,0±26,4 у.е. (р<0,01). После завершения лечения в основной группе больных, получавших на фоне ПВТ иммунотропную терапию ронколейки-ном, определено снижение уровня ЦИК до верхней границы нормы, уменьшение содержания в их составе наиболее патогенной среднемолекулярной фракции (1^ - 19S). При этом содержание среднемолекуляр-ных ЦИК в основной группе снизилось с 112,7±11,3 до 83,1±8,4 у.е. (р<0,01). В группе сравнения также имело место некоторое снижение уровня ЦИК, однако гораздо менее выраженное, чем в основной группе. Поэтому, в целом, уровень ЦИК в группе сравнения оставался после лечения в 1,4 раза выше нормы (р<0,01), а содержание наиболее патогенных среднемолекулярных комплексов - в 1,5 раза. Таким образом, использование ронколейкина в составе ПВТ ХВГС способствует нормализации общего количества ЦИК и их молекулярного состава, в то время как в группе больных, получавших только общепринятое лечение, сохранялись существенные сдвиги данных показателей, а именно повышенный уровень ЦИК, преимущественно за счет наиболее патогенной среднемолекулярной фракции.
В сыворотке крови обследованных больных в обеих группах до лечения достоверно увеличивалось содержание всех трех классов иммуноглобулинов (табл. 2). Более чем в 2 раза при оценке «средних» значений уровень иммуноглобулина класса М превышал показатели «средней» контрольной группы (р<0,001). Установлено достоверное повышение уровня IgG. Наибольшей выраженности у наблюдаемых больных достигала продукция ^А (р<0,001). Полученные результаты согласуются с литературными данными отечественных и зарубежных авторов и свидетельствуют об активации гуморального звена иммунитета у исследуемой группы пациентов [6, 7]. При проведении корреляционного анализа была установлена обратная взаимосвязь между уровнем крупномолекулярной фракции ЦИК и концентрацией ^А (-0,65, р<0,001) при меньшей зависимости образования указанной фракции ЦИК от содержания ^М (-0,26) и IgG (-0,32). Выявленная активация гуморального иммунитета при хронической инфекции, по-видимому, отражает особенности взаимодействия макроорганизма с антигеном, характеризующимся слабовыраженной иммуно-генностью. Данное положение легло в основу для проведения иммунореабилитации на фоне этио-тропной терапии интерферонами ХВГС. Изменений концентрации IgG после лечения в обеих группах выявлено не было. Так, уровень IgG в сыворотке крови пациентов основной группы до начала лечения составил 12,90±0,50 г/л, что превышало уровень средненормальных показателей (10,00±0,27 г/л, р<0,001). После применения ронколейкина с противовирусным лечением исследуемый показатель значимо не менялся и составил 13,90±0,60 г/л (р>0,05). Однако наблюдалась обратная взаимосвязь уровня IgG в сыворотке крови от содержания ЦИК патогенной среднемолекулярной фракции (-0,45; р<0,001). У пациентов основной группы выявлена нормализация концентрации ^А с 2,60±0,30 до 1,08±0,09 г/л (р<0,001) и тенденция к снижению концентрации ^М в сыворотке крови, при этом нормальные значения достигнуты не были.
Таблица 1
Концентрация молекулярных фракций ЦИК при ХВГС с учетом лечения (M±m)
ЦИК (у.е.оп.) Контроль (n=14) Основная группа (n=19) Группа сравнения (n=22) Р
Крупные 18,5±7,8 22,1±6,5 25,7±6,8 >0,1
16,5±5,0 30,1±7,5 >0,1
Средние 53,5±9,3 112,7±11,3 121,2±10,5 >0,1
60,1±8,4 88,8±9,7 <0,05
Мелкие 104,5±17,1 208,1±33,2 215,9±48,1 >0,1
240,0±36,1 320,7±31,5 <0,01
Примечание. В числителе - показатели до начала лечения, в знаменателе - после его завершения; «р» вычислен между аналогичными показателями основной группы и группы сравнения.
Показатель Контроль (n=14) Основная группа (n=19) Группа сравнения (n=22)
До лечения После лечения До лечения После лечения
ч/з 2 нед. ч/з 3 мес. ч/з 2 нед. ч/з 3 мес.
Ig M, г/л 1,04 ± 0,02 1,78 ± 0,09 p < 0,001 2,09±0,11 p < 0,001 p1 > 0,05 1,3±0,14 p < 0,05 pt< 0,001 1,80±0,08 p < 0,001 2,01±0,11 p < 0,001 pj> 0,05 p2 > 0,05 2,01±0,24 p < 0,001 p1 > 0,05 p2< 0,001
Ig A, г/л 1,08 ± 0,02 2,60 ± 0,20 p < 0,001 2,60±0,30 p < 0,001 p1 > 0,05 1,08±0,09 p > 0,05 pt< 0,001 2,90±0,20 p < 0,001 3,10±0,31 p < 0,001 p1 > 0,05 p2 > 0,05 2,60±0,40 p < 0,001 p1 > 0,05 p2< 0,001
Ig G, г/л 10,00 ± 0,27 12,90±0,50 p < 0,001 13,90±0,60 p < 0,001 p1 > 0,05 14,40±0,90 p < 0,001 pj> 0,05 12,60±0,30 p < 0,001 12,80±0,80 p < 0,001 p1 > 0,05 p1 > 0,05 9,80±0,60 p < 0,001 p1< 0,001 p^ 0,001
ЦИК (у.е.оп.) 61,0 ± 2,6 106,1±5,9 p <0,05 104,5±6,3 p <0,05 pt>0,05 105,6±8,6 p <0,05 pt>0,05 105,7±6,1 p <0,05 138,7±8,8 p <0,001 p1< 0,001 p^ 0,001 250,3±9,1 p < 0,001 p1< 0,001 p^ 0,001
Примечания. р -различия с контролем; р1 - различия до и после лечения; р2 - различия после лечения между группами.
Таблица 2
Содержание иммуноглобулинов и концентрация ЦИК при ХВГС в зависимости от лечения (M±m)
Таблица 3
Состояние некоторых показателей врожденного иммунитета при ХВГС на фоне лечения (M±m)
Показатель Основная группа (n=19) Группа сравнения (n=22) Р
Фагоцитарная активность нейтрофилов, % 48,01±3,00 50,70±3,52 >0,1
51,01±2,82 52,40±3,14 >0,1
Фагоцитарный резерв, у. е. 0,98±0,12 0,97±0,18 >0,1
1,53±0,09 0,99±0,19 <0,05
НСТ-тест, % 7,30±0,09 7,50±0,18 >0,1
10,00±0,50 6,50±0,89 <0,01
Резерв НСТ-теста, у.е. 1,90±0,05 1,79±0,11 >0,1
2,60±0,02 1,60±0,33 <0,01
Индекс активации нейтрофилов, у.е. 2,11±0,04 2,06±0,09 >0,1
3,10±0,02 2,10±0,06 <0,05
Примечание. В числителе - показатели до начала лечения, в знаменателе - после его завершения; «р» вычислен между аналогичными показателями основной группы и группы сравнения.
При изучении фагоцитарной активности нейтро-филов достоверных различий до и после лечения ронколейкином выявлено не было (табл. 3). По современным данным, сведения о спонтанном и стимулированном НСТ-тесте, а также характеристиках
фагоцитарного резерва являются одними из наиболее важных показателей состояния врожденного иммунитета, в частности, функциональной активности и резервного потенциала фагоцитов. Наши исследования показали, что отмечено иммуномодулирующее влияние ронколейкина на фагоцитарное звено у пациентов с ХВГС (достоверно увеличился резерв нейтрофилов). Наблюдалось увеличение резерва НСТ (p<0,01) и индекса активации нейтрофилов (p<0,05) у пациентов на фоне лечения ронколейкином, что указывает на повышение резервных метаболических возможностей ней-трофильных гранулоцитов и усиление микробоцидной активности внутриклеточных процессов.
Выводы
Таким образом, применение иммунокоррекции с использованием ронколейкина в сочетании с противовирусным лечением ХВГС патогенетически обосновано и должно способствовать в дальнейшем повышению эффективности противовирусной терапии, что является целью нашего исследования в перспективе. Использование ронколейкина в составе комплексного лечения ХВГС определяет возможность создания новых оригинальных протоколов лечения.
Литература
1. Агапитова С.В., Черных Е.Р., Леплина О.Ю. и др. Характеристика иммунных дисфункций у пациентов с хроническими вирусными гепатитами и циррозом печени // Сибирский мед. журнал. - 2008. - Т. 2, № 3. - С.79
2. Арямкина О.Л. Хроническая ЫБУ- и ЫСУ- инфекция и рак печени: клинико-эпидемиологические и дифференциально-диагностические параллели // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2006. - № 2. -С. 36-39.
3. Ивашкин В.Т. Механизмы иммунной толерантности и патологии печени // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатотол., колопроктол. - 2009. - № 2. - С. 8 - 13.
4. Каминский Ю.В., Скляр Л.Ф., Маркелова Е.В. Клинико-морфологические и иммунологические параллели при хронических вирусных гепатитах // Тихоокеанский мед. журнал. - 2005. - № 1. - С. 17-20.
5. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С. Цитокины. -СПб.: Фолиант, 2008. - С. 375
6. Малый В.П., Гололобова О.В. Особенности функционирования иммунной системы при хроническом гепатите С // Международный мед. журнал. -2007. - № 2. - С. 58-62.
7. Нагоев Б.С., Понежева Ж.Б. Некоторые аспекты иммунопатологии при хронических гепатитах // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2009. -С. 45-49.
8. Плехова Н.Г., Сомова Л.М. Роль моноцитов/макрофагов в патогенезе вирусных инфекций // Тихоокеанский мед. журнал. - 2010. - № 3. - С. 5-9.
9. Скляр Л.Ф., Маркелова Е.В., Полушин О.Г. и др. Хроническая ЫС^инфекция: современные имму-номорфологические аспекты: монография [под ред. Ю.В. Каминского] - М.: РУДН, 2006. - С. 213.
10. Соболевская О.Л., Корочкина О.В. Клиническое значение Т-клеточной реакции лимфоцитов на антигены вирусов гепатита В и С и уровня цитокинов при противовирусной терапии больных гепатитом С и микст-инфекцией (В+С) // Клин. медицина. - 2007. -№ 7. - С. 63-66.
11. Собчак Д.М., Корочкина О.В. Оценка показателей Т-клеточного иммунитета и медиаторов иммунного ответа у больных хроническим гепатитом С // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2007. - № 2. - С. 37-42.
Координаты для связи с авторами: Скляр Лидия Федоровна - доктор мед. наук, доцент кафедры инфекционных болезней ВГМУ, тел.: +7-914-791-65-76, e-mail: lidiya.sklyar@hotmail.com; Маркелова Елена Владимировна - доктор мед. наук, профессор, зав. кафедрой патологической физиологии ВГМУ, тел.: +7-914-707-85-59, e-mail: patphis-vl@mail.ru; Ли Юлия Александровна - ассистент кафедры инфекционных болезней ВГМУ, тел.: +7-914-976-59-36, e-mail: julianochka-li@rambler.ru; Горелова Ирина Сергеевна - ассистент кафедры инфекционных болезней ВГМУ, тел.: +7-908-446-04-53, e-mail: gorelova_ira@mail.ru.
□□□
