CC BY
44
Медицинская Иммунология 2004, Т.6, № 1-2, стр 113-116 © 2004, СПбРОРААКИ
Краткие сообщения
ИММУНОТЕРАПИЯ ОСТРОЙ СИНЕГНОЙНОЙ ПНЕВМОНИИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
Нуриддинова Н.Р., Гариб Ф.Ю.
Ташкентский НИИ вакцин и сывороток ГАК «Узфармпром», Узбекистан
Резюме. Интраназальным введением культуры P.aeruginosa мышам вызывали острую синегнойную пневмонию. Она индуцировала продукцию антисинегнойных антител и вызывала гибель животных. Культура P.aeruginosa выделялась из ткани легких мышей. Инфекция сопровождалась подавлением иммунного ответа к эритроцитам барана и снижением фагоцитарной активности макрофагов. Лечение острой синег-нойной инфекции антисинегнойным иммуноглобулином и синегнойной вакциной способствовало нормализации показателей иммунной системы и индукцию антисинегнойных антител в высоких титрах. Антиси-негнойный иммуноглобулин и синегнойная вакцина эффективно защищали мышей от экспериментальной острой синегнойной пневмонии в тестах активной и пассивной защиты. Сочетанное применение иммунопрепаратов усиливает их защитный эффект.
Ключевые слова: иммунотерапия, вакцина, иммуноглобулин, синегнойная пневмония.
Nuriddinova N.R., Garib F.Yu.
IMMUNNOTHERAPY OF ACUTE PSEUDOMONAS AERUGINOSA PNEUMONIA IN EXPERIMENT Abstract. Intranazal introduction of Pseudomonas aeruginosa culture to mice, caused acute pseudomonas pneumonia. It caused an induction of antipseudomonas antibodies, the death of animals, and P. aeruginosa culture was taken from lung tissue. The infection was accompanied by suppression of the immune response to sheep erythrocytes and by decreased phagocytic activity of macrophages.
Application of antipseudomonas immunoglobulin and pseudomonas vaccines promoted a normalization of the immune system parameters and an induction of antibodies in high titres.
Antipseudomonas immunoglobulin and pseudomonas vaccine effectively protected mice from experimental acute pseudomonas pneumonia of parameters in tests of active and passive protection. (Med.Immunol., 2004, vol. 6, № 1-2,pp 113-116)
Заболевания, вызываемые Pseudomonas aeruginosa трудно поддаются лечению из-за высокой природной антибиотикоустойчивости микроорганизмов и часто приводят к летальному исходу [2].
Среди перспективных методов лечения и профилактики синегнойной инфекции важное место отводится специфической терапии [7].
В Ташкентском НИИ вакцин и сывороток в течение ряда лет проводятся исследования по созда-
Адрес для переписки:
Нуриддинова Нозима Рамизовна -км.п., заведующая лабораторией бактериальных препаратов Ташкентского НИИ вакцин и сывороток.
700084, г.Ташкент, улМавлянова, д. 37,
ТашНИИ вакцин и сывороток.
Тел/факс: (8 10998712)34-77-22.
E-mail: niivs@uzsci.net
нию вакцины и серопрепаратов для лечения синегнойной инфекции.
Разработана синегнойпая вакцина (СВ) на основе антигенов внеклеточной слизи P.aeruginosa, выделенной из биомассы, накопленной на новой питательной среде К-4 [5].
Приготовлен антисинегнойный иммуноглобулин (АИГ) человека, представляющий иммунологически активную белковую фракцию, выделенную из сыворотки крови человека, содержащую превентивные антитела против P.aeniginosa [4]. Показана эффективность разработанных препаратов при лечении генерализованной формы экспериментальной синегнойной инфекции.
Учитывая широкое распространение заболеваний бронхо-легочной системы синегнойной этиологии [8], данная работа посвящена изучению эффективности СВ и АИГ при лечении синегнойной инфекции на модели острой пневмонии у животных.
ИЗ
Материалы и методы
Синегнойная вакцина изготовлена из антигена внеклеточной слизи штамма P.aeruginosa № 263 из коллекции ТашНИИВС. Вакцина разлита в ампулы по 1,0 мл в дозе 0,1 мг/мл. Антисигенойный иммуноглобулин приготовлен по общепринятому методу Кона из сывороток крови человека, предварительно оттитрованных на наличие антисинегнойных антител. При отборе сырья для получения АИГ и для определения титра антисинегнойных антител в крови экспериментальных животных в реакции пассивной гемагглютинации использован эритроцитарный диагностикум производства ТашНИИВС.
Для заражения опытных групп мышей использован вирулентный штамм Р.аетфпо.т № 8 (серогруп-па 02), полученный из коллекции НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН. Заражение животных проводилось интраназально в дозах от 1,5 х 105 до 2,5 х 106 микробных клеток в 50 мкл суспензии после их усыпления внутрибрюшииным введением нембутала в дозе 50 мг/кг массы тела.
Для подтверждения острой синегнойной пневмонии (ОСП), из легких зараженных мышей выделяли культуры P.aeruginosa с определением числа колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 г ткани легких. Выделенные культуры типировали с помощью 0-групповых и 0-факторных сывороток производства Днепропетровского предприятия по производству бактерийных препаратов.
Влияние иммунотерапии и острой синегиойной пневмонии (ОСП) на показатели иммунной систе-
мы оценили путем определения числа антителообразующих клеток (АОК) к эритроцитам барана (ЭБ) и фагоцитарного показателя и числа макрофагов перитонеального экссудата мышей [3].
Определение защитной активности СВ или АИГ проводили в тестах активной или пассивной защиты, соответственно. Иммунизированных СВ в дозе 1,0 мл животных через 12 сут. заражали интраназально разными дозами штамма 8. В других экспериментах АИГ в разведении 1:10 вводили животным внут-рибрюшинно в объеме 1,0 мл за 2, 24, 48 часов до интраназального заражения разными дозами штамма 8. Гибель животных в обоих вариантах экспериментов учитывали в течение 7 суток с определением ЛД по [1]. Также определяли ЛД^ штамма 8 для контрольных животных, которым вводили только P.aeruginosa. Отношение ЛДи опыта к ЛДг контроля составляло величину индекса эффективности (ИЭ). Иммунный антительный ответ на эритроциты барана (ЭБ) определяли по количеству антителообразующих клеток (АОК) в селезенке иммунизированных мышей [6].
Статистическую обработку проводили методом вариационной статистики с использованием критерия Стыодента (t).
Результаты и обсуждение
При разработке экспериментальной модели, оптимальную дозу интраназального инфицирования мышей с целью создания у них ОСП подбирали на основании гибели зараженных животных
Табл. 1. ВЛИЯНИЕ СИНЕГНОЙНОЙ ВАКЦИНЫ И АНТИСИНЕГНОЙНОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА НА ФАГОЦИТОЗ И АНТИТЕЛ00БРА30ВАНИЕ У ЖИВОТНЫХ С ОСТРОЙ СИНЕГНОЙНОЙ ПНЕВМОНИЕЙ
Группа животных Фагоцитарная активность нейтрофилов
Фагоцитарный показатель,% Фагоцитарное число в селезенке (М±1р)
Зараженные (модель ОСП) 14,2±1,3* 1,1±0,06* 14241 (12382,4+16129,6)*
Вакцинированные (модель ОСП) 21,2±2,3 1,8±0,2 27730,0 (23885,0+31575,0)
Получившие АИГ (модель ОСП) 19,9±1,8 1,4 ±0,2 24300,0 (18455,0+30145,0)
Контроль (без препаратов) 23,4±1,2 1,7±0,1 25927,8 (18120,2+33735,6)
Примечание: '-достоверное различие по сравнению с аналогичным показателем в контроле при р< 0,05.
Табл. 2. ЭФФЕКТИВНОСТЬ СИНЕГНОЙНОЙ ВАКЦИНЫ И АНТИСИНЕГНОЙНОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА ПРИ ЛЕЧЕНИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ОСТРОЙ СИНЕГНОЙНОЙ ПНЕВМОНИИ (М±т)
Препарат Срок введения до заражения ЛД50 х 106 микроб.клеток ИЭ Значимость различий, Р
2ч 2,1±0,1 3,5 <0,05
АИГ 24 ч 7,5±0,2 12,5 <0,05
48 ч 3,7±0,1 5.2 <0,05
СВ 12 сут. 5,4±0,2 9 <0,05
СВ + АИГ 12 сут., 24 ч 14,1 ±0,7 23,5 <0,05
Контроль (без препаратов) - 0,6±0,07 -
2004, Т. 6, № 1-2
Иммунотерапия синегнойной пневмонии
с определением ЛД , наличием возбудителя в их легких и динамики увеличения титров антисинег-нойных антител в крови животных.Оценка патологического процесса проводилась по результатам количественных высевов возбудителя через
3, 7 и 10 сут. после заражения. При интраназаль-ном заражении у инфицированных регистрировалась 100% высеваемость возбудителя из легких мышей. КОЕ культуры P.aeruginosa в 1 г легкого через 3 сут. после заражения составило 6,7±0,2, через 7 сут. - 2,5±0,1, через 10 сут. - 0,01±
0,003 млрд. микробных клеток. Все изолированные культуры принадлежали к одной 02-серог-руппе, как и исходный штамм.
В отдельных сериях опытов было изучено влияние воспроизведенной нами ОСП на иммунореактивность организма подопытных мышей.
Для иммунологической перестройки при экспериментальной ОСП характерно развитие иммуио-супрессии.
Супрессия иммунного ответа у мышей на фоне ОСП выражалась в снижении количества АОК на 5-е сутки после иммунизации их ЭБ (табл. 1). Экспериментальная ОСП вызывала подавление фагоцитарной активности макрофагов (табл.1). При этом необходимо отметить, что выявлена постепенная индукция антисинегнойных антител у зараженных культурой P.aeruginosa животных. Так, в крови мышей через 7 суток после заражения обратный титр антисинегнойных антител составлял 7,9±1,0. Только на 14 сутки после заражения их титр повышался до 158,4±1,7.
Было изучено влияние иммунотерапии с помощью АИГ и СВ на иммунную систему при формировании инфекционного процесса. АИГ мышам вводили за 24 часа до заражения. Иммунизацию их СВ проводили за 12 сут. до заражения.
Как видно из таблицы 1, на фоне АИГ и СВ, характерного для инфекционного процесса снижения количества АОК на ЭБ и показателей фагоцитоза не наблюдались.
Через 14 суток после заражения содержание антисинегнойных антител в крови мышей, получивших АИГ до заражения составило 200± 17, а в другой группе мышей, получивших СВ, титры антител были вдвое выше и составили 398,1 ±21,0.
Следовательно, разработанные нами АИГ и СВ эффективно защищают мышей от экспериментальной ОСП.
Индекс эффективности защиты животных от инфекции зависел от сроков введения иммунопрепаратов (табл. 2). При применении АИГ для лечения ОСП наиболее эффективные результаты получены при введении препарата за 24 ч до заражения.
Используя сочетанное применение иммунопрепаратов, удалось получить высокую защиту от инфекции зараженных культурой P.aeruginosa живот-
ных. Наибольшая защищенность животных при иммунотерапии, включающей инъекции АИГ и СВ, согласовывалась с данными бактериовыделе-ния. В этой группе зараженных мышей в отличие от остальных групп, культура P.aeruginosa не обнаруживалась в тканях легких через 7 сут после заражения.
Вероятно, сочетанное применение иммунопрепаратов создавало наиболее оптимальные условия для санации организма от возбудителя P.aeruginosa, локализованного в тканях легких подопытных животных, поскольку вакцинация индуцировала синтез повышенного количества антисинегнойных антител, которые нейтрализовали бактерии и их продукты, а также стимулировали фагоцитоз за счет опсонизации. Кроме того, введенный в организм мышей человеческий иммуноглобулин, содержащий аптисинегнойные антитела, мог воздействовать аналогичным образом, но короткий период, поскольку ксеногенные иммуноглобулины катаболизируются. Уместно вспомнить, что Fc-фрагменты стимулируют неспецифические факторы защиты, а тафцьш, расположенный между Fc- и Fab- фрагментами, является активатором иммунных процессов.
Разработанный нами антисинегнойный иммуноглобулин человека получил разрешение Фармкоми-тета Узбекистана на клиническое применение у больных с хирургической инфекцией. Другой препарат
- синегнойная вакцина находится на стадии доклинических исследований.
Полученные нами экспериментальные данные по эффективности антиген- и антителосодержащих антисинегнойных препаратов могут быть использованы при разработке специфических методов иммунопрофилактики и иммунотерапии внутригоспиталь-ной сииегнойной хирургической инфекции, которая часто приводит к летальному исходу.
Список литературы
1. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. - Л., 1962.-182с.
2. Внутрибольничные инфекции: (пер. с анг.) / Под ред. Р.П. Венцела. - М.: Медицина, 1990. - 656с.
3. Доклинические испытания новых медицинских иммунобиологических препаратов. Основные положения. - РД 42-28-8-89. - М., 1989. - 31с.
4. Нуриддинова Н.Р., Гариб Ф.Ю., Касымов Ш.К., Мирзабаева М.Н. Антиисинегиойный иммуноглобулин человека - новый иммунопрепарат, разработанный в Республике Узбекистан // Журн. инфекция, иммунитет и фармакология. - 2000. -№3. - С.50-52.
5. Нуриддинова Н.Р., Иванова Л.Е., Шереметьев Н.Н., Гариб Ф.Ю. Синегнойная вакцина на основе
антигенов, выделенных из супернатанта среды культивирования К-4 // Журн. микробиол. - 2002. - №
4. - С.40-43.
6. Jerne N.K., Nordin A. A. Plague-formation in ager by single antibody-producing cells // Science. - 1963.
- Vol. 140. - P.465-467.
7. Stanislavsky E.S., Lam J.S. Pseudomonas aeruginosa antigens as potential vaccines // FEMS Microbi-
ol. Rev. - 1997. - Vol.21.- P.243-277.
8. Wiblin R.T. Nosocominal pneumonia // Prevention and control of nosocominal infections / ed. Wenzel R.P. ~ Baltimore: Williams and Wilkins, 1997. - P.807-819.
поступила в редакцию 29.11.2003 отправлена на доработку 20.01.2004 принята к печати 26.02.2004
