CC BY
90
УДК 616-008.87-07.097.931
E.A. Шмелева С.М. Попкова 2, С.И. Макарова 2, И.Г. Батурина 2
ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ АНТРОПОГЕННОГО ОТВЕТА НА АНТИГЕНЫ СИМБИОНТНЫХ НЕТОКСИГЕННЫХ КОРИНЕБАКТЕРИЙ ДИФТЕРИИ
1 ГУ «Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» (Москва) 2 Институт эпидемиологии и микробиологии НЦ МЭ ВСНЦ СО РАМН (Иркутск)
Рассмотрена экосистемная связь между антигенами симбионтных нетоксигенных коринебактерий дифтерии и. иммунным, ответом, макроорганизма. Приведены, показатели, клеточного и. гуморального иммунитета индуцированного в популяции людей циркулирующими симбионтными C. diphtheriae tox- и введением препарата Кодивак.
Показана эффективность использования. Кодивак для. коррекции микробных дисбиозов и. иммунорезистентности организма.
Ключевые слова: нетоксигенные коринебактерии дифтерии, антигены, микробиоценоз, иммунореактивность
IMMUNOLOGIC ASPECTS OF ANTHROPOGENIC RESPONSE TO SUMBIOTIC NONTOXIGENIC CORINEBACTERIAE DIPHTHERIAE ANTIGENES
E.A. Shmeleva ', S.M. Popkova 2, S.I. Makarova 2, I.G. Baturina 2
1 G.N. Gabrichevsky Moscow Science Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Moscow
2 Institute of epidemiology and Microbiology SC ME ESSC SB RAMS, Irkutsk
There has been examined ecosystem, link between the antigens of symbiotic nontoxigenic Corynebacteriae diphtheriae and the immune response of the macroorganism.. There have been given data of cell and humoral immunity induced, in human population, by circling symbiotic C. diphtheriae tox- and. introducing Codivac drug. There has been shown an efficiency of using Codivac for correcting microbe disbiose and. the organ-izm's immunoresistance.
Key words: nontoxigenic corynebacteriae diphtheria, microbiocenosis, antigens, immune resistance
В последнее время отмечается прогресс в понимании важности симбиотических микроассоциаций. Сформировавшиеся в них в процессе эволюции симбиотические типы отношений менее напряжены и более благоприятны для сосуществования как микроценозов, так и для макроорганизма [1, 6, 7].
Изменения условий внешней среды, вызванные антропогенно-техногенным прессингом (химическое и радиационное загрязнение воздуха, воды, почвы, пищи, психоэмоциональные перегрузки и т.д.) как непосредственно, так и опосредованно влияют на здоровье человека. Вследствие экологической катастрофы возникают микроэкологические изменения, которые обусловливают формирование микробных дисбиозов [6, 9, 10]. Необходимость сохранения нормальной микрофлоры как компонента биоценозов здоровых людей, определяет дальнейшие разработки в области пробиотиков, конст-
руирование новых лечебно-профилактических препаратов разнообразных по направленности действия, создаваемых на основе не только целых клеток, но и их компонентов или метаболитов.
Биоценоз открытых внешней среде полостей тела человека представляет собой совокупность множества микробных ассоциаций. Изучение микрофлоры ротоглотки, других слизистых и кожи показало, что здесь функционирует значительное количество как аэробных, так и анаэробных микроорганизмов, среди которых коринебактерии занимают значительное место. Коринебактерии вместе с сопутствующей микрофлорой, в том числе со стафилококками, стрептококками, нейссериями и др. колонизируют носоглотку, уши, кожу, гениталии и другие органы. Плотность популяции кори-небактерий резко возрастает у людей с патологическим состоянием верхних дыхательных путей: у больных ангинами, назофарингитами, отитами, с
патологией кожи и половых органов и т.д. Широко распространенным состоянием при дисбактериозах является длительное носительство. Примером длительного носительства служит носительство токсигенных коринебактерий дифтерии, протекающее, как правило, в иммунных (привитых дифтерийным анатоксином) коллективах и характерное для лиц с патологией ротоглотки, т.е. при ротоглоточном дисбактериозе [9, 11, 12].
В Московском НИИЭМ им. Г.Н. Габричевского разработан препарат Кодивак, представляющий собой антигены клеточных стенок симбионтного нетоксигенного штамма коринебактерий дифтерии. В экспериментах на животных и в клинических испытаниях на людях было показано, что этот препарат обладает иммуномодулирующей активностью. Препарат прошел государственные испытания в ИКБ № 1 г. Москвы, имеется разрешение КМИБП на его внедрение в практику здравоохранения, утверждена Фармстатья, инструкция по применению, изготовлено несколько экспериментально-производственных серий.
Целью настоящей работы явилось выявление экосистемной связи между антигенами симбион-тных нетоксигенных коринебактерий дифтерии и иммунореактивностью макроорганизма.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Препарат Кодивак — вакцина бактериальная субклеточная.
Иммунологическое обследование прошли 40 взрослых лиц — длительных носителей возбудителя дифтерии, а также 21 человек с цитомегало-вирусной и герпесвирусной инфекциями, прошедшие курс лечения Кодивак с положительным эффектом. Определение численности субпопуляций лимфоцитов проводили методом непрямой иммунофлюоресценции с моноклональными антителами фирмы Сорбент ltd. Антибактериальные антитела к антигенам нетоксигенного штамма коринебактерий дифтерии (Кодивак) выявляли с помо-
щью твердофазного анализа (ИФА). Количество антител каждого класса определяли, используя соответствующие конъюгаты, по стандартной кривой и выражали в условных единицах относительно стандарта, которым служил пул сывороток от здоровых лиц 18 — 20 лет. С помощью ИФА изучены сыворотки здоровых лиц в возрасте 18 — 20 лет (100 человек), здоровых детей 10—11 лет (50 человек), пациентов психиатрического стационара из очага носительства 20 — 60 лет (50 человек).
Суммарные естественные антитела к антигенам Кодивак у жителей читинской области: дети из г. Краснокаменск — 5—10 лет (78 человек), дети из г. Балей — 5 — 10 лет (100 человек), дети из Иркутской области — 5—10 лет (48 человек), 11—15 лет (137 человек), 16 — 23 года (94 человека), взрослые — 50 и более лет (51 человек) определяли в РПГА с помощью эритроцитарного диагностику-ма, сконструированного с использованием поли-метакриловой кислоты [5].
Вирусологический контроль больных цитоме-галовирусной и герпесвирусной инфекциями (21 пациент) на наличие вирусных антигенов в культуре ткани, крови и моче осуществляли методом иммунофлюоресценции [3].
Распределение показателей антител к антигенам Кодивак в популяциях людей вычисляли с помощью биномиального вариационного ряда распределения признаков [7]. Дополнительно с учетом модального распределения проводилась статистическая обработка по программе «Вычисление среднего значения и стандартной ошибки» (Л.В. Козлов).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Иммунологическое исследование взрослых людей, длительных носителей возбудителя дифтерии, прошедших курс лечения препаратом Кодивак, показало, что количественные показатели содержания лимфоцитов в крови длительных носителей C. diphtheriae tox+ до и после курса лечения Кодивак изменялись (табл. 1).
Таблица 1
Численность субпопуляций лимфоцитов у длительных носителей возбудителя дифтерии до и после
вакцинации Кодивак
Группы Субпопуляции лимфоцитов (% в 1мл крови)
со о C C D ■t. CDs CD4 I CDs CD16 CD19
Т-клетки Т-хелперы Т-супрессоры Тх I Tc НК-клетки В-клетки
Здоровые,норма 67,1 і 1,7 44,5 і 1,2 25,7 і 2,1 1,73 і 0,12 15,0 і 1,0 11,8 і 1,3
1 Исходные показатели ниже нормы до после 55,7 і 2,3** 67,6 і 3,0 n = 11 34,3 і 0,9*** 36,2 і 1,5*** n = 28 18,7 і 0,8** 23,5 і 1,2 n = 20 1,37 і 0,06* 1,62 і 0,08 n = 17 8,5 і 0,8*** 10,1 і 1,3** n = 21 8,5 і 0,6 15,8 і 2,3 n = 4
2 Исходные показатели выше нормы до после 75,7 і 1,9** 68,6 і 2,0 n = 13 54,0 і 1,9** 39,4 і 2,3 n = 7 29.4 і 0,8* 22.4 і 1.1 n = 10 2,52 і 0,17** 1,63 і 0,08 n = 12 23,3 і 1,8** 15,3 і 1,7 n = 12 24,6 і 1,3*** 17,0 і 1,1** n = 26
3 Исходные показатели соответствуют норме до после 66,5 і 0,4 64,1 і 2,9 n = 14 44,0 і 0,0 38,5 і 3,2 n = 4 26,0 і 0,4 22,19 і 1,0 n = 16 1,71 і 0,03 1,84 і 0,2 n = 11 15,1 і 0,4 12,3 і 1,5 n = 7 12,0 і 0,0 19,3 і 0,8 n = 3
Примечание: п - число обследованных, * - отличие от нормы значимо при p < 0,05; ** - отличие от нормы значимо при p < 0,01; *** - отличие от нормы значимо при p < 0,001.
Так, до введения препарата регистрировались индивидуальные отклонения в содержании лимфоцитов по сравнению с содержанием популяций этих же клеток в крови здоровых лиц (возрастная норма). Поэтому обследованные пациенты в зависимости от исходных показателей были разделены на три группы. В первую группу вошли носители с низким исходным содержанием определяемых лимфоцитов, во вторую — с высоким содержанием, и в третью — с показателями содержания лимфоцитов, соответствовавших норме. Перед введением Кодивак у 11 пациентов отмечено низкое содержание лимфоцитов с маркерами CD3, у 28 — CD4, у 20 — CD8, у 17 регистрировались низкие показатели соотношения CD4 /CD8, у 21 — CD16 и у 4 — CD19. У всех лиц первой группы показатели содержания лимфоцитов достоверно ниже, чем в контрольной группе (исключение — показатели лимфоцитов с маркерами CD19). После проведения курса лечения препаратом Кодивак содержание лимфоцитов увеличилось, приближаясь к показателям нормы.
В группу носителей с высоким содержанием лимфоцитов в крови попало 13 человек с маркерами CD3, 7 - CD4, 10 - CD8, 12 - CD4 / CD8, 12 -CD16 и 26 человек - CD19. После курса лечения Кодивак содержание лимфоцитов в крови лиц снизилось, стремясь к показателям их содержания у лиц контрольной группы. У носителей третьей группы, в крови которых исходное содержание лимфоцитов соответствовало норме, после вакцинации Кодивак количество лимфоцитов в крови осталось прежним, т.е. колебалось в пределах верхней и нижней границ нормы.
Полученные данные свидетельствуют об избирательном воздействии Кодивак на иммунную систему человека. Поствакцинальные показатели содержания лимфоцитов находятся в прямой зависимости от исходного иммунологического статуса. При низкой исходной концентрации наблюдается стимуляция их содержания, при высокой -снижение, при концентрации, соответствующей норме, их содержание не меняется. Следовательно, можно говорить об иммунокоррегирующих свойствах препарата из симбионтных нетоксиген-ных коринебактерий.
После курса лечения Кодивак у длительных носителей было отмечено прекращение выделения токсигенных коринебактерий дифтерии. Это явление коррелировало с изменением количественного состава иммунокомпетентных клеток в сторону физиологического оптимума, что предполагает возможность использования препарата в качестве неспецифического средства для восстановления иммунологической реактивности организма.
Ранее в работах В.С. Гевондяна было продемонстрировано, что антибактериальные антитела против коринебактерий являются индикаторным критерием резистентности организма животных и отражением нормального функционирования микроэкологических систем [2]. Уровень образующихся естественным путем нормальных антител
к нетоксигенным коринебактериям дифтерии является как бы «иммунологическим зеркалом», отражающим неспецифическую резистентность как у отдельных лиц, так и в популяции в целом. Так, у некоторых онкобольных в организме наблюдается повышенная концентрация коринеформных бактерий. Аутовакцины из этих штаммов улучшала состояние этих больных.
Нами при изучении содержания антибактериальных антител разных классов в сыворотках крови различных контингентов людей был использован метод ИФА и популяционного анализа, позволяющие увидеть профили количественного распределения антител в популяции людей [11]. Анализ сывороток здоровых людей выявил, что распределение показателей антибактериальных антител IgG, IgM, IgA соответствовал бимодальному (2 пика). Большее количество лиц (60-70 %) в этой группе обладали низкой концентраций антител (1 модальный пик). У меньшего количества лиц (30-40 %) содержание антибактериальных антител регистрировалось в более высоких концентрациях (2 модальный пик). Каждый пик включает биномиальное распределение показателей концентрации антител, которое подчиняется закономерному проявлению эволюционно закрепленных биологических признаков (рис. 1).
Результаты определения антибактериальных антител в сыворотках коллектива детей (г. Москва) показали, что распределение иммуноглобулинов G, M, A соответствовало мономодальному (первый пик с низкими показателями их концентрации в крови). В популяции детей 2 пик распределения с высокими показателями концентраций этих антител отсутствовал. Пороговые концентрации антител были в несколько раз ниже, чем у взрослых (рис. 2).
Полученные данные подтверждают положение о том, что степень иммунного ответа, будучи филогенетически обусловленной, меняется в процессе онтогенеза и, следовательно, подвержена возрастным колебаниям. Иммуногенез в отношении антибактериальных антител достигает к периоду репродуктивного возраста оптимального своего проявления. Это своеобразие иммунологического ответа на бактериальные антигены коринебактерий дифтерии, в известной мере, может объяснить частоту заболеваний детей дифтерией в условиях естественного развития эпидпроцесса в допрививочный период.
Изучение сывороток пациентов психиатрической больницы было обусловлено периодически возникающими там вспышками носительства возбудителя дифтерии. Изучение такого контингента интересно тем, в частности, что у больных шизофренией наблюдается широкий спектр изменений различных звеньев иммунной системы [4]. Выяснилось, что соотношение антибактериальных антител у этих пациентов отличалось от здоровой группы (рис. 3). Так для показателей IgM антител распределение было мономодальным, для IgA -тримодальным. Антитела IgG распределялись по
Рис. 1. Профили вариационных рядов распределения показателей концентрации антибактериальных антител в сыворотках крови здоровых лиц (18-20 лет) к антигенам Кодивак.
Рис. 2. Вариационный ряд распределения показателей концентрации антибактериальных антител в сыворотках крови группы школьников 10-11 лет к антигенам Кодивак.
Рис. 3. Профили вариационных рядов распределения показателей антибактериальных антител в сыворотках крови пациентов психиатрического стационара.
двум пикам, но показатели их концентрации превышали показатели этих антител в здоровой группе в 3 — 4 раза. Концентрация IgA в третьем пике превышала норму в 4 — 5 раз. Отсутствие второго модального пика распределения с высокой концентрацией IgM в сыворотках крови можно считать прогностическим. Мономодальное распределение антибактериальных IgM в коллективе предполагает прямую функциональную связь между их содержанием и формированием носительства коринебактерий. Это явление было подтверждено и
при анализе сывороток носителей, госпитализированных в инфекционную больницу г. Москвы. В сыворотках их крови были выявлены высокие концентрации иммуноглобулинов всех изотипов, превышающие аналогичные показатели у здоровых людей в 2 — 4 раза. Распределение IgM было моно-модальным (1 пик), 2-й пик, характеризующийся повышенными концентрациями, отсутствовал.
Показатели клеточного и гуморального иммунитета у детей из районов Восточной Сибири (Читинская область) с высоким уровнем радиации и
химического загрязнения отличались от аналогичных среднерегиональных значений (Иркутская область, рис. 4). Иммунограммы детей в возрасте 5—10 лет (78 человек из Краснокаменска и 100 человек из г. Балей) отражали разительные отличия от аналогичных показателей у детей Иркутской области (48 человек), где окружающие условия лучше. Наибольшие отличия, характеризующие глубокую супрессию иммунитета практически по всем показателям, отмечены у детей г. Балей: низкий уровень содержания Т-лимфоцитов, сниженная фагоцитарная активность нейтрофилов, рез-
ко повышенный уровень В-лимфоцитов, снижение уровня IgG, 1дМ, 1дА. На иммунограмме у детей г. Краснокаменска эти отличия выражены менее сильно. Крайне неблагополучная экологическая обстановка (высокий уровень радиации и концентрации химических веществ в атмосфере) коррелировала с высоким уровнем вторичных иммунодефицитов и широким распространением инфекционной и неинфекционной патологии.
Определение в РПГА антибактериальных антител в сыворотках детей (та же группа 5—10 лет), а также подростков и взрослых выявило, что содер-
Содержание естественных антител к коринебактериям дифтерии
4
3,5
3
Р 2
О)
о 1,5 1
0,5
0
5-10 лет 11-15 лет 16-23 >50
В Иркутск в Краснокаменск 0 Балей
Тл
Сдвиги показателей иммунитета у детей (5-10 лет)
г. Балей
Тл
Сдвиги показателей иммунитета у детей (5-10 лет)
г. Краснокаменск
ар 2,5
Рис. 4. Характеристики иммунологической реактивности населения городов Восточной Сибири.
Таблица 2
Динамика сохранения маркеров ЦМВ и герпес-вирусной инфекции до и после лечения препаратом
Кодивак
Маркеры ЦМВ и герпес-вирусной инфекции До лечения После лечения
сохранились исчезли появились
IgG-анти-ЦМВ 14 13 1 0
IgM-анти-ЦМВ 10 0 10 0
Ag ЦМВ в крови 9 0 9 0
Ag ЦМВ в моче 10 1 9 0
IgG-Herpes I, II 7 7 0 0
IgM-Herpes I, II 7 0 7 0
жание суммарных антител к коринебактериям в сыворотках детей из г.г. Краснокаменск и Балей достоверно ниже, чем в сыворотках детей того же возраста из Иркутской области (рис. 4). Следовательно, показатели уровней нормальных антибактериальных антител к нетоксигенным коринебактериям в сыворотках крови людей тесно связаны с показателями их иммунологической резистентности.
Острые респираторные вирусные инфекции занимают значительное место в инфекционной патологии как среди детей, так и среди взрослых. Поиск эффективных медикаментозных средств, оказывающих позитивное влияние на ОРВЗ, остается актуальным. Проведенное в ИКБ № 1 г. Москвы изучение клинической эффективности Кодивак при цитомегаловирусной (ЦМВ) и герпесвирусной инфекциях показало его эффективность [4]. У этих больных выявлены маркеры, свидетельствующие о реактивированной форме заболевания (обнаружены анти-ЦМВ-1дМ и антигенов ЦМВ и герпес-вируса). У большинства больных преобладали длительный субфебрилитет, гепато-минальный синдром, общее недомогание, лимфа-денопатия, отягощенный акушерский анамнез у женщин (недонашивание беременности, мертво-рождение, бесплодие). При исследовании Т-кле-точного и гуморального иммунитета у 17 (80 %) больных выявлен дисбаланс иммунорегуляторных клеток, характеризующийся повышенным содержанием Т-супрессоров и низким хелперно-суп-рессорным соотношением (CD4/CD8 < 1,5).
Перед введением Кодивак все пациенты получали лечение различными широко применяемыми иммуномодуляторами (Т-активин, рибомунил и др., иммуноглобулины человека с высоким содержанием CMV-IgG, -1дМ анти-герпес IgG, -1дМ в высоких титрах антител 1: 64000, 1:80000). Кроме того, проводили терапию препаратами интерферонового ряда (виферон, неовир, циклоферон). Однако, несмотря на указанное лечение, антигены ЦМВ и гер-песвируса сохранялись длительное время. После лечения препаратом Кодивак у 19 из 21 (т.е. около 90 %) пациентов маркеры острой цитомегаловирусной и герпесвирусной инфекций исчезли (табл. 2). Итак, использование препарата Кодивак при ЦМВ и герпесвирусных инфекциях различной этиологии
сопровождается отчетливыми положительными изменениями клинических, вирусологических и иммунологических показателей.
Таким образом, препарат, состоящий из природных антигенов симбионтного штамма нетокси-генных коринебактерий дифтерии, способен корригировать нарушение не только ротоглоточного микробиоценоза, но и нарушения в составе клеточного и гуморального иммунитета. Коринебак-терии, являясь древними симбионтами открытых полостей человека, выступают в роли носителей уникальных, природой выверенных, сбалансированных иммуногенов-стимулов, поддерживающих уровень неспецифической резистентности, и осуществляют возможность формирования микроби-оценотических сообществ человека в рамках нормального биологического и физиологического явления.
Использование нового препарата Кодивак при инфекциях бактериальной и вирусной природы перспективно, что определяет его высокую практическую значимость.
ЛИТЕРАТУРА
1. Беклемишев В.Н. О классификации биоце-нологических (симфизиологических) связей /
B.Н.Беклемишев // Бюл. Моск. об-ва испыт. природы, отд. биол. — 1951. — Т. 56, №5. — С. 3 — 30.
2. Гевондян В.С. Способ определения иммунореактивности животных, инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота / В.С. Гевондян, В.П. Шишков, Е.А. Шмелева // А.С. № 13 20930 от 12.06.85.
3. Информационное письмо № 15 Комитета здравоохранения правительства Москвы / М.П. Корженкова, Р.В. Вартанян, Л.Н. Бондарева, Н.А. Малышев. — М., 2001.
4. Караулов А.В. Клиническая иммунология и аллергология: Учебное пособие / А.В. Караулов. — М., 2002.
5. Лещук С.И. Разработка оригинального эритроцитарного диагностикума для изучения противодифтерийного иммунитета / С.И. Лещук,
C.М. Попкова, Е.А. Шмелева / Матер. V объединенной научной секции НИИ и ВУЗов медико-биол. профиля. — 1993. — С. 15—16.
6. Печуркин Н.С. Популяционная микробиология / Н.С. Печуркин. — Новосибирск: Наука, 1978.
7. Пианка Э. Эволюционная экология / Э. Пи-анка. — М., 1981.
8. Плохинский Н.А. Биометрия / Н.А. Плохин-ский. — Новосибирск: Изд-во Сибирского отд. АН СССР, 1961.
9. Попкова С.М. Микробная экология человека в условиях техногенного прессинга промышленных городов Восточной Сибири: Автореф. дис. ... докт. биол. наук. — Иркутск, 2004.
10. Приобретенный иммунитет и инфекционный процесс / В.И. Покровский, М.М. Авербах, В.И. Литвинов, И.В. Дубцов. — М.: Медицина, 1979.
11. Специфические иммуноглобулины и их роль в формировании противодифтерийного иммунитета / Е.А. Шмелева, С.И. Макарова, И.Г. Батурина, М.П. Корженкова и др. // Ж. микробиол. - 2005. - № 1. - С. 38-43.
12. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание / Б.А. Шен-деров. - М.: Грант, 1998. - Т. 1.
