CC BY
58
УДК: 616-091.8
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ТИПИРОВАНИЕ ГАСТРО-ИНТЕСТИНАЛЬНОГО АМИЛОИДОЗА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАСШИРЕННОГО НАБОРА АНТИТЕЛ, НАПРАВЛЕННЫХ ПРОТИВ AL-KAPPA АМИЛОИДОЗА.
Гиоева13.В., Михалева2Л.М., Рёкен3К.
'ГБОУ ВПО Северо-Осетинская государственная медицинская академия Минздрава России, г. Владикавказ, Россия;
2Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт морфологии человека Российской академии медицинских наук» (г.Москва); 3Институт патологии университета им. Кристиана Альбрехта (г. Киль, Германия).
Аннотация. Цель: Исследование амилоидных биоптатов из различных отделов желудочно-кишечного тракта с использованием расширенной панели антител для иммуногистохимического типирования ЛЬ- амилоидоза. Материалы и методы: Материалы исследования были взяты из амилоидного регистра г. Киль (Германия). Биоп-таты фиксировались в 10% растворе нейтрального формалина и заливались в парафин. Срезы окрашивались гематоксилином и эозином и конго красным. Амилоид был классифицирован иммуногистохимически с использованием антител против амилоидного Р-компонента, АА-амилоида, аполипопротеина Л1, лизоцима, фибриногена, транстиретина, каппа и лямбда легких цепей. В работе использовались созданные нами антитела для улучшения диагностики ЛЬ-каппа амилоидоза. Результаты: Было исследовано 86 амилоидных биоптатов из различных отделов желудочно-кишечного тракта. Наибольшее число биоптатов было из толстой кишки (55,8%), в том числе из прямой кишки - 17,4%. Биопсии из желудка составили 22,1%, из двенадцатиперстной кишки - 16,2%. Биоп-таты из тощей или подвздошной кишок составили 4,7%. Всего один биоптат был из полости рта (1,2%). В результате иммуногистохимического исследования, ЛЬ- каппа амилоидоз был диагностирован в 40% случаев, ЛЬ-лямбда амилоид в 20%, ЛЛ-амилоидоз - в 30%, а транстирретиновый амилоидоз у 10% пациентов. Иммуногистохимическое окрашивание биоптатов синтезированными нами антителами ЛК1, ЛК2, ЛК3 и ЛК4, направленными против каппа легких цепей, показало, что данные антитела являются высокоспецифичными для ЛЬ-каппа амилоидоза и неспецифичными для других типов амилоидоза (ЛЬ- лямбда, АА-, ЛТЖ- амилоидоза). Заключение: Проведенное исследование показало, что наиболее частым видом амилоидоза в желудочно-кишечном тракте является ЛЬ- амилоидоз. Созданные нами поликлональные антитела, направленные против вариабельного и константного регионов каппа легких цепей, способны улучшить иммуногистохимическую классификацию амилоидоза.
Ключевые слова: амилоидоз, желудочно-кишечный тракт, иммуногистохимия, антитела, ЛЬ-каппа амилоидоз.
Амилоидоз является патологическим процессом, который характеризуется внеклеточным отложением в органах и тканях аномального фибриллярного белка амилоида, состоящего из нерастворимых фибриллярных протеиновых скоплений с широкой антипараллельной в- складчатой структурой [1]. На сегодняшний день был
идентифицирован 31 аутологичный белок, который может приводить к формированию локальных или системных амилоидных отложений [2]. Диагностика амилоидоза базируется на гистологическом исследовании биоптатов и обнаружении характерного яблочно-зеленого двойного
~ Л4 ~
лучепреломления в очагах амилоидных скоплений при исследовании в поляризованном свете после окрашивания конго красным.
Фактически каждый орган или ткань могут вовлекаться в патологический процесс. Возможно поражение почек, сердца, печени, нервной системы, желудочно-кишечного тракта. Одной из распространенных форм является гастро-интестинальный амилоидоз, который может клинически проявляться болями в животе, тошнотой, запорами, диареей, снижением веса [3-5]. Около 60 лет назад биопсия прямой кишки была введена в диагностический алгоритм для выявления амилоидоза [6]. Благодаря современным методам исследования, например, методом гибкой эндоскопии, стало известно, что амилоидные отложения могут обнаруживаться также и локально в различных отделах желудочно-кишечного тракта, а следовательно, ректальная биопсия не является абсолютно достоверным способом диагностики амилоидоза.
После гистологического подтверждения ами-лоидоза необходимо его типирование для выбора правильного метода лечения, который может состоять из химиотерапии или трансплантации органа [7-9]. Наиболее точным является им-муногистохимическое типирование с использованием моноклональных антител к белкам-предшественникам амилоида [10-12]. Среди всех видов амилоидоза, определенные трудности вызывает иммуногистохимическая диагностика случаев с AL амилоидозом. Существуют данные о том, что каждый пациент с данным видом амило-идоза имеет индивидуальные участки аминокислот в вариабельном регионе легких цепей этих иммунголобулинов, и, следовательно, использование стандартных моноклональных антител (направленных против константного региона) дает достоверный результат только в 40% случаев [13]. Для предотвращения ошибок в установлении вида AL-амилоидоза целесообразным является использование антител, направленных против вариабельного и константного регионов легких цепей, которые могут быть получены, используя в качестве иммуногена рекомбинантный пептид.
В данной работе мы исследовали амилоидные биоптаты из различных отделов желудочно-кишечного тракта с использованием расширенной панели антител для иммуногистохимического
типирования AL-амилоидоза. Также были оценены эффективность и специфичность синтезированных нами антител, направленных против вариабельного и константного регионов каппа легких цепей на примере биопсийного материала пациентов с различными типами гастроинтести-нального амилоидоза.
Материалы и методы. В работе было исследовано 86 биоптатов из различных отделов желудочно-кишечного тракта: ротовой полости, желудка, тонкой и толстой кишок, в том числе из прямой кишки. Все биоптаты были фиксированы в 10% растворе нейтрального формалина и залиты в парафин. Срезы окрашивались гематоксилином и эозином. Амилоидные отложения идентифицировались при исследовании срезов, окрашенных конго красным в поляризованном свете.
Для создания новых антител, направленных на улучшение диагностики AL-каппа амилоидоза, при помощи базы данных национального центра биотехнологической информации (NCBI) изучались все аминокислотные цепи, соответствующие критериям поиска «амилоид» и «каппа легкие цепи».
Всего было найдено 112 аминокислотных цепей, подразделенных в базе данных NCBI на 5 субклассов. Субкласс I составил 87 аминокислотных цепей, субкласс II - три цепи, III и IV субклассы по одиннадцать цепей, субкласс V состоял из одной цепи. Для дальнейших исследований нами был выбран субкласс I, так как он является самым распространенным. Все найденные аминокислотные цепи были обработаны программой TCoffe Regular. На основании полученных данных была составлена гипотетическая цепь из наиболее часто встречающихся аминокислотных остатков, которая состояла из вариабельного и константного регионов каппа легких цепей [14].
Первый антигенный эпитоп был выбран из наиболее часто встречающегося участка в вариабельном регионе гипотетической цепи и соответствовал аминокислотным позициям 3-17(QMTQSPSSLSASVGD).
Анализ константного региона 112 аминокислотных цепей пациентов с AL- каппа амилоидо-зом показал, что у всех пяти субклассов он одинаков. В качестве второго эпитопа был выбран участок из константного региона, соответствующий аминокислотным позициям 116-130
(FIFPPSDEQLKSGTA). Вторичная структура белка анализировалась по методике, описанной Паркером [15] с использованием программного обеспечения Peptide Companion software (CoshiSoft/peptiSearch; San Diego, CA).
Два рекомбинантных пептида были синтезированы и очищены методом высокоэффективной жидкостной хроматографиии (HPCL) с чистотой 86% и 89%. Четыре новозеландских кролика были иммунизированы синтетическим пептидом согласно стандартизированному протоколу иммунизации (Pineda Antibody-Service, Берлин, Германия). Сыворотка была взята на сотый день после иммунизации. Фракция Ig G была очищена при помощи афинной хроматографии на колонке Hi Trap Protein G HP (Amersham Biosciences AB, Фрайбург, Германия).
Два новозеландских кролика были иммунизированы с NH2-CQMTQSPSSLSASVGD-CONH, а другие два с NH2-CFIFPPSDEQLKSGTA-CONH2. Успешность иммунизации тестировалась методом Dot- блоттинга, с использованием синтезированного пептида в качестве позитивного контроля.
В результате мы получили четыре новых антитела. Антитела очищенной формы Ig G, направленные против NH2-
CQMTQSPSSLSASVGD-CONH, были названы AK1 и AK2, а антитела против NH2-CFIFPPSDEQLKSGTA-CONH2 - AK3 и AK4.
Иммуногистохимические исследования проводились с использованием моноклональных антител против АА-амилоидоза (1:600), поликло-нальных антител против плазменного амилоидного Р-компонента (1:5000), фибриногена (1:2000), лизоцима (1:3000), транстиретина (1:4000), лямбда легких цепей (1:160000) и каппа легких цепей (1:160000) компании Dako (Гамбург). Мы использовали также коммерчески недоступные поликлональные антитела против аполипопротеина A I (anti-Apo AI в разведении 1:1000), лямбда легких цепей (Anti-AL1, в разведении 1:3000), пептидные антитела против лямбда легких цепей AL3 (1:250) и AL7 (1:500). Для иммунной окраски использовалась система Bench Mark@ XT и ultraView TM Universal Alkaline Phosphatase Red Detection Kit (Vetana Medical Systems, Tucson/AZ, США). Для инкубации с антителами против амилоид-Р- компонента, Anti-Apo AI, лямбда и каппа легких цепей, а также
ATTR и AL7 срезы были обработаны Cel Conditioning 1 (по протоколу производителя CC1; Vetana) или с использованием цитрата натрия. Окрашивание синтезированными нами антителами против каппа легких цепей (anti-AK1 (1:1500), anti-AK2 (1:1000), anti-AK3 (1:3000), anti-AK4 (1:1000)) было выполнено при помощи LSAB Kit (Dako) и Super sensitive Link-Label IHC Detection System (BioGenex).
Результаты исследования. Среди исследованных нами случаев с амилоидозом, 54 биоп-тата было взято у мужчин (63%), а 31 биоптат - у женщин (36%). Пол одного пациента был неизвестен (1%). Средний возраст пациентов составил 64 года (возрастной диапазон 32-93 года).
В нашем исследовании наибольшее число би-оптатов было из толстой кишки (55,8%), в том числе из прямой кишки - 17,4%. Биопсии из желудка составили 22,1%, из двенадцатиперстной кишки - 16,2%. Биоптаты из тощей или подвздошной кишок составили 4,7%. Из полости рта был всего один биоптат (1,2%).
При гистологическом исследовании биопта-тов желудочно-кишечного тракта обнаруживались интерстициальные и васкулярные амилоидные отложения в слизистом, подслизистом и мышечном слоях, которые после окрашивания конго красным и исследовании в поляризованном свете имели характерное яблочно-зеленое свечение (рис.1). Наиболее часто в патологический процесс вовлекались слизистый и подсли-зистый слои, с выраженными отложениями кон-гофильных субстанций в интерстиции.
Согласно результатам имуногистохимиче-ского исследования, AL- каппа амилоидоз был обнаружен в 34 биоптатах (40%), AL-лямбда амилоид в 17 (20%), AA-амилоидоз - в 26 случаях, а транстирретиновый амилоидоз у 9 (10%) пациентов.
Иммуногистохимическое окрашивание биоп-татов синтезированными нами антителами AK1-AK4 показало, что из 34 случаев с AL- каппа амилоидозом в 33 (97%) все 4 антитела были позитивными. В одном биоптате желудка AK1 дало слабоположительную реакцию, а AK2 отрицательное окрашивание. Случаев с негативным окрашиванием всех 4 антител не было. Специфичность наших антител была протестирована на 52 биопсиях, полученных у пациентов с другими видами амилоидоза: 17 пациентов с AL-
лямбда амилоидозом, 26 пациентов с АА-амило-идозом и 9 с транстиретиновым амилоидозом. Во всех случаях с AL-лямбда амилоидозом все четыре антитела (АК1-АК4) были негативны. В одном случае, в биоптате из толстой кишки отмечалась слабоположительная иммунная реакция при окрашивании со всеми антителами против каппа амилоидоза, а также выраженная реакция с антителом против транстирретина. Данный случай был классифицирован как транстиррети-новый амилоидоз. В другом биоптате из прямой кишки отмечалась слабоположительная реакция с антителом против каппа-амилоидоза фАКО), но окрашивание с нашими антителами дало негативную реакцию. В данном случае была выраженная позитивная реакция с антителами против транстирретина.
Во всех остальных случаях с АА-, TTR-, и AL-лямбда- амилоидозом антитела AK1-AK4 были негативны.
При окрашивании гематоксилином и эозином в стенках сосудов видны гомогенные эозино-фильные массы амилоида (H&E). Отмечается характерное яблочно-зеленое двойное лучепреломление при исследовании в поляризованном свете срезов, окрашенных конго красным (Kongo Red). Выявлена иммунореактивность с антителом против Р-компонента амилоида (AP), имму-нонегативная реакция при окрашивании с антителами против AL-каппа легких цепей амилоида (Lambda, AL3), а также против AA- амилоидоза (AA) и транстирретина (ATTR). Яркая иммуно-позитивная реакция при окрашивании с двумя антителами против AL- каппа амилоидоза (Kappa, AK3).
Рисунок 1. Биоптат толстой кишки с преимущественно васкулярными амилоидными отложениями x 10.
Мы проанализировали корреляцию различных типов амилоидоза с возрастом и полом пациентов (таб. 1). Самой старшей была группа пациентов с AL- амилоидозом. При этом, у больных с AL-лямбда амилоидозом средний возраст составил 69 лет, а у AL-каппа пациентов - 66 лет.
Затем шла группа с транстирретиновым амилои-дозом, средний возраст составил 65 лет. Самой молодой была АА-амилоидная часть исследуемых, в которой был выявлен 32-летний пациент. Средний возраст данной группы составил 58 лет. В целом, амилоидоз желудочно-кишечного
тракта обнаруживается чаще у пожилых людей. В нашем исследовании 64% пациентов были старше 60 лет.
В данной работе у пациентов с AL-каппа и AL-лямбда амилоидозом число мужчин и жен-
щин было почти одинаковым. В группе с тран-стирретиновым амилоидозом 89% были мужчины. Таже тенденция отмечалась у АА-амилоидной группы (85%).
Таблица 1
Корреляция типов амилоидоза с возрастом и полом пациентов
Тип амилоидоза Число биоптатов n (%) Возраст пациентов в числовом и процентном соотношении [n(%)l Пол
30-39 40-49 50-59 60-69 70-79 80-89 90-99 жен муж неизв
AL- каппа 34 (40) - 2 (6) 9 (26) 8 (24) 12 (35) 2 (6) 1 (3) 17 (50) 16 (47) 1 (3)
AL- лямбда 17 (20) - - 1 (5) 10 (60) 5 (30) 1 (5) - 9(53) 8(47) -
ATTR 9 (10) - 2 (22) 1 (11) 2(22) 3 (33) 1(11) 1 (11) 8 (89) -
АА 26 (30) 2 (8) 5 (19) 8 (31) 7 (27) 1 (4) 3 (11) - 4 (15) 22(85) -
Всего: 86(100) 2 (2) 9(10) 19 (22) 27(31) 21(24) 7 (8) 1 (1) 31 (36) 54 (63) 1(1)
Дискуссия. Ежегодно в амилоидный регистр г. Киль присылается около 110 биоптатов из желудочно-кишечного тракта, которые необходимо классифицировать по типу амилоида. Данные биоптаты составляют 21% из всех случаев с амилоидозом [16]. В настоящей работе мы исследовали доступную нам часть из этих материалов, состоящую из 86 биоптатов, полученных из различных отделов гастроинтестинального тракта.
AL амилоидоз является самым частым вариантом системного амилоидоза. Согласно нашим результатам, а также данным других исследователей, данная тенденция относится и к амилоидным отложениям в желудочно-кишечном тракте [5, 16, 17]. Некоторые авторы утверждают, что различные типы амилоидоза имеют свою излюбленную локализацию в гастроинтестинальной области. Freudenthaler и др. на примере исследования 663 биоптатов из желудочно-кишечного тракта, сделали вывод о том, что AL- каппа и АА- амилоидоз чаще встречаются в верхних отделах желудочно-кишечного тракта. AL-лямбда и транстирретиновый амилоидоз наиболее характерны для колоректальных биоптатов. В нашем исследовании из 19 биоптатов желудка, в 8 случаях обнаружен AL-каппа амилоид, а в 6 -АА-амидоид. Транстирретиновый амилоидоз диагностирован у двух пациентов, а AL-лямбда - у трех. В тонкой кишке наиболее часто встречался каппа-амилоидоз, а наиболее редким был тран-стирретиновый амилоидоз (всего один случай). В толстой кишке преобладали биоптаты с АА-
амилоидозом, они составили 43% от всех случаев.
В данном исследовании мы провели анализ сенситивности и специфичности синтезированных нами антител, направленных против вариабельного и константного региона каппа легких цепей. Результат исследования показал, что по-ликлональные пептидные антитела (AK1-AK4) являются высокоспецифичными для выявления AL- каппа амилоидоза и неспецифичными для других типов амилоидоза (АА-, ATTR- и AL-лямбда). Антитела AK1, AK2, AK3 и AK4 могут быть рекомендованы для улучшения иммуноги-стохимической классификации амилоидоза. Им-мунопозитивная реакция с несколькими антителами против каппа легких цепей повышает вероятность правильной диагностики AL- каппа ами-лоидоза у пациентов, что позволяет, тем самым, снизить риск неправильного иммуногистохими-ческого типирования амилоидоза.
ЛИТЕРАТУРА
1. Merlini G, Bellotti V Molecular mechanisms of amyloidosis. N Engl J Med 2003; 349:583-596
2. Sipe JD, Benson MD, Buxbaum JN, Ikeda S, Merlini G, Saraiva MJ, Westermark P Nomenclature 2014: amyloid fibril proteins and clinical classification of the amyloidosis. Amyloid. 2014; 21:221-224
3. Röcken C, Ernst J, Hund E, Michels H, Perz J, Saeger W, Sezer O, Spuler S, Willig F, Schmidt HHJ Interdisziplinäre Leitlinien zur Diagnostik und Therapie der extrazerebralen Amyloidosen. DMW. 2006; 131:S45-S66
4. Syed U, Ching Companioni RA, Alkhawam H, Wal-fish A. Amyloidosis of the gastrointestinal tract and the liver: clinical context, diagnosis and management. Eur J Gastroenterol Hepatol. 2016 0ct;28(10):1109-21.
5. Said SM, Grogg KL, Smyrk TC Gastric amyloidosis: clinicopathological correlations in 79 cases from a single institution. Hum Pathol. 2015; 46:491-498
6. Kyle RA, Spencer RJ, Dahlin DC Value of rectal biopsy in the diagnosis of primary systemic amyloidosis. Amer J Med Sci. 1966; 251:35/501-540/506
7. Rosenzweig M., Landau H. Light chain (AL) amyloidosis: update on diagnosis and management. J Hematol Oncol. 2011; 18;4:47.
8. Desport E., Bridoux F., Sirac C., Delbes S., Bender S. Al amyloidosis. Orphanet J Rare Dis. 2012; 21;7:54-67.
9. Katoh N., Matsushima A., Kurozumi M., Matsuda M., Ikeda S. Marked and Rapid Regression of Hepatic Amyloid Deposition in a Patient with Systemic Light Chain (AL) Amy-loidosis after Highdose Melphalan Therapy with Stem Cell Transplantation. Intern Med. 2014; 53(17):1991-5.
10. Linke R.P. On typing amyloidosis using immunohisto-chemistry. Detailled illustrations, review and a note on mass spectrometry. Prog Histochem Cytochem. 2012; 47(2):61-132.
11. Said S.M., Sethi S., Valeri A.M., Leung N., Cornell L.D., et al. Renal amyloidosis: origin and clinicopathologic correlations of 474 recent cases. Clin J Am Soc Nephrol. 2013; 8(9):1515-23.
12. Gioeva ZV, Mikhaleva LM, Roeken K. Immunohisto-chemical classification of cardiac amyloidosis. Vladikavkaz
Medico-Biological Bulletin, 2015, vol.XXI, №3 (33), pp. 25-31 (in Russian)
13. Lachmann H.J., Booth D.R., Booth S.E. et al. Misdiagnosis of hereditary amyloidosis as AL (primary) amyloidosis. N Engl J Med. 2002;346:1786-1791.
14. Mikhaleva LM, Gioeva ZV, Roeken K. Optimization of immunohistochemical diagnostic AL- amyloidosis with new antibodies. Archives of pathology, 2015; 77 (5), pp. 58-63 (in Russian)
15. Parker J.M., Guo D., Hodges R.S. New hydrophilicity scale derived from high-performance liquid chromatography peptide retention data: correlation of predicted surface residues with antigenicity and X-ray-derived accessible sites. Biochemistry. 1986;25:5425-5432.
16. Freudenthaler S, Hegenbart U, Schönland S, Behrens HM, Krüger S, et al. Amyloid in biopsies of the gastrointestinal tract - a retrospective observational study on 542 patients. Vir-chows Arch. 2016 May; 468(5):569-77.
17. Cowan AJ, Skinner M, Seldin DC, Berk JL, Lichtenstein DR, O'Hara CJ, Doros G, Sanchorawala V Amyloidosis of the gastrointestinal tract: a 13-year, single-center, referral experience. Haematologica. 2013; 98:141-146
18. Röcken C, Eriksson M Amyloid and amyloidoses. Pathologe. 2009; 30:182-192
IMMUNOHISTOCHEMICAL TYPING OF GASTROINTESTINAL AMYLOID DEPOSITS USING AN EXPANDED PANEL OF ANTIBODIES DIRECTED AGAINST AL-KAPPA AMYLOIDOSIS
Gioeva1 Z. V., Mikhaleva2 L.M., Röcken3 C.
1 North Ossetian State Medical Academy, Vladikavkaz, RF
2 Research Institute of Human Morphology, Moscow, RF
3Institute of Pathology, Christian-Albrechts-University, Kiel, Germany
Annotation: Objective: To investigate biopsy specimens of amyloid sites from different parts of the gastrointestinal tract using an expanded panel of antibodies for immunohistochemical typing of AL amyloidosis.
Materials and methods: Materials for the study were obtained from the Amyloid Registry, Kiel (Germany). The biopsy specimens were fixed in 10% neutral buffer formalin and embedded into paraffin blocks. The tissue sections were stained with H&E and Congo red. Antibodies against P-component, AA-amyloid, A-I apolipoprotein, lysozyme, fibrinogen, transthyretin, k- and X-light chains were used for the immunohistochemical classification of amyloid types. The antibodies produced by our team for optimizing diagnosis of ALk amyloidosis were used in the study. Results: In total, 86 biopsy specimens of amyloid sites from multiple parts of the gastrointestinal system were examined. Most of the biopsy specimens were taken from the large intestine (55.8%), including rectum (17.4%). Biopsy specimens from the stomach accounted for 22.1% and those from the duodenum - 16.2%. Ileal or jejunal biopsy specimens were examined in 4.7% of all cases. Only a single biopsy specimen was received from the oral cavity (1.2%). Based on the results of immunohistochemical examination, ALk amyloidosis was found in 40% of cases, ALX amyloidosis - in 20%, AA-amyloidosis - in 30%, and transthyretin amyloidosis - in 10% of patients. The results of immunohistochemical staining of the biopsy specimens with our panel of antibodies AK1, AK2, AK3 and AK4 against K-light chains demonstrated its high specificity for detecting ALk amyloidosis. However, these antibodies did not immunoreact with other amyloid types (ALX, AA and ATTR amyloidosis). Conclusion: Based on the study results, AL-amyloidosis was the most frequent type of amyloid deposits in the gastrointestinal tract. Polyclonal antibodies developed by our team against the variable and constant regions of K-light chains look promising for optimizing the immunohistochemical classification of amyloidosis. Key words: amyloidosis, gastrointestinal tract, immunohistochemistry, antibodies, AL-Kappa amyloidosis.
