CC BY
48УДК 615.076.9:571.27:576.08 ББК Е 28.074
О.В. МЕЛЬНИКОВА, В.Е. СЕРГЕЕВА
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПО ВЫЯВЛЕНИЮ CD4-ПОЗИТИВНЫХ КЛЕТОК СЕЛЕЗЕНКИ НА ФОНЕ ДЛИТЕЛЬНОГО УПОТРЕБЛЕНИЯ КАЛЬЦИЯ
Ключевые слова: селезенка, кальций, иммуногистохимия, CD4-позитивные клетки.
С помощью иммуногистохимической реакции изучены CD4-позитивные клетки 6 различных морфотипов в белой и красной пульпе, маргинальных синусах, трабекулах селезенки интактных крыс и после поступления соли кальция. После поступления кальция в течение 60 суток общее количество СD4-позитивных клеток снижается, но они в небольшом количестве появляются в периартериальной и реактивной зонах. Исследование показывает, что кальций оказывает иммуномодулирующее действие на СD4-пози-тивную популяцию лимфоцитов селезенки с Т-хелперной активностью.
O. MELNIKOVA, V. SERGEEVA IMMUNOHISTOCHEMICAL METHODS IN REVEALING CD4+ SPLEEN CELLS AFTER PROLONGED USE OF CALCIUM
Key words: spleen, calcium, immunohistochemistry, CD4+ cells.
Immunohistochemical reaction was used to study six different morphotypes of CD4+ cells in white and red pulp, marginal sinuses, spleen trabeculae of intact rats and experimental rats after they had been on a calcium-rich diet. The total number of CD4+ cells decreased after a 60-day calcium-rich diet, however they appeared in small numbers in periarterial an+d reactive zones. Our study shows that calcium has immunomodulatory effect on the spleen CD4+ T cells.
Интерес к иммуномодулирующей терапии резко возрос в последние годы ввиду снижения иммунологической реактивности населения в целом и, как следствие этого, повышения инфекционной, аутоиммунной, онкологической, аллергической заболеваемости. Известно большое количество различных иммуностимулирующих препаратов, из них минимальное внимание в этом списке уделяется макро- и микроэлементам. Исследования в данной области позволят по-новому подойти к селективной модуляции отдельных звеньев иммунитета с помощью таких препаратов [4].
Исследование структурно-функциональных особенностей селезенки является актуальной проблемой, так как селезенка как самый крупный периферический орган иммуногенеза ответственна за эффективность клеточного и гуморального иммунного ответа как врожденного, так и приобретенного иммунитета [7]. Всестороннее исследование влияния иммунотропных препаратов на органы иммунной системы, особенно на тканевом уровне, необходимо для избирательного, целенаправленного воздействия на нарушенные гисто-физиологические процессы, что является обязательным условием успешной иммуномодуляции [12].
CD4 идентифицирован на мембранах Т-лимфоцитов с помощью монокло-нальных антител как маркер Т-хелперов. CD4 содержится на поверхности кортикальных тимоцитов, части зрелых периферических Т-лимфоцитов (40-50% из них - почти исключительно T-хелперы). Он обнаруживается также на моноцитах, некоторых клетках головного мозга [14]. CD4-рецепторы существуют на мембранах и некоторых других клетках: макрофагах, эозинофилах, тимоцитах, мегака-риоцитах, альвеолярных макрофагах легких, дендритных клетках, олигодендро-цитах и астроцитах мозга, эпителиальных клетках кишки, клетках шейки матки [14, 17]. Функция CD4 обусловлена в первую очередь его способностью связываться с молекулами MHC класса II, а также передавать в клетку активационный сигнал [5]. Большой интерес представляет тот факт, что CD4-рецепторы клеток
мышей, крыс, кроликов имеют аналогичное строение и высокую гомологию с Сй4-рецепторами клеток человека (более 50%), особенно в цитоплазматическом участке молекулы [13]. Этот факт определяет практическую значимость и возможность применения данного исследования в области медицины.
В многочисленных исследованиях, посвященных воздействию иммуно-тропных препаратов на организм, в основном использованы функциональные, клинические и иммунологические методы исследования [5, 13]. В научной литературе практически отсутствуют работы, в которых изучали бы структурную организацию и иммунокомпетентные клетки органов иммунной системы, и в частности селезенки, при поступлении кальция в организм. Кроме того, в условиях клиники органы иммунной системы недоступны для морфологического изучения после иммунокорригирующих лечебных мероприятий.
Цель исследования - изучение и морфофункциональная характеристика популяций Сй4-позитивных клеток селезенки лабораторных крыс при употреблении соли кальция, поступающей с питьевой водой, в течение 60 суток.
Материал и методы исследования. Объектом исследования служили 36 селезенок белых нелинейных лабораторных крыс-самцов одного возраста и одной массы (150-200 г). Экспериментальные животные разделены на 2 группы:
первая группа - контрольные животные (n = 18), получавшие ad libitum питьевую воду, соответствующую требованиям ГОСТ Р 52109-2003, СанПиН 2.1.4.1116-02;
вторая группа - подопытные животные (n = 18), получавшие ad libitum питьевую воду, соответствующую требованиям ГОСТ Р 52109-2003, СанПиН 2.1.4.1116-02 с добавлением хлорида кальция в концентрации 235 мг/л в пересчете на кальций.
Ежедневно в течение двух месяцев опытные животные получали с питьевой водой в среднем 8,1-10,2 мг/кг кальция. Свободный доступ к питьевой воде был обусловлен моделированием поступления кальция в естественных условиях с питьевой водой. Выбор хлорида кальция для изменения концентрации кальция в питьевой воде был обусловлен его растворимостью и опытом использования другими исследователями [1].
Все действия, предусматривающие контакты с экспериментальными животными, проводились согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ № 742 от 13.11.84 г. МЗ СССР), требованиям «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1986) и принципам Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным. Выведение животных из эксперимента проводилось путем декапитации [3].
В работе использован иммуногистохимический стрептавидин-биотин-пероксидазный метод. После фиксации в 10%-ном растворе нейтрального формалина селезенки крыс заливали парафином. Парафиновые срезы толщиной 5 мкм готовились на микротоме МПС-2 и после депарафинирования и регитратации в этаноле нисходящей концентрации срезы селезенки погружали в восстанавливающий цитратный буфер (рН 6,0). Затем проводили высокотемпературную обработку прогреванием на водяной бане при 90-95°С в течение 30 мин с целью демаскировки искомых антигенов в тканях. После ингибирования эндогенной пероксидазы 3%-ным раствором перекиси водорода на метаноле проводили иммуногистохимическую реакцию методом трехэтапного непрямого иммуноферментного анализа с использованием первичных моноклональных антител (МКАТ) к антигенным маркерам CD4 в раз-
ведении 1:100 согласно рекомендации фирмы-изготовителя (Dako, Дания). Визуализацию первичных МКАТ, связавшихся с антигенами, проводили стандартным биотин-стрептавидин-пероксидазным методом с использованием набора LSAB-2 (Labeled Streptavidin Biotin System Peroxidase). На заключительном этапе срезы докрашивались гематоксилин-эозином [18].
Морфометрическое исследование участков селезенки проведено с применением компьютерного анализа микроскопических изображений. Определение размеров клеточных структур проводилось после фотографирования препаратов при увеличении объектива 40 и окуляра 10 с использованием светового микроскопа МИКМЕД-5. Линейные морфометрические измерения, измерения площадей клеток и структур, а также количественные морфометрические измерения интенсивности мембранных и цитоплазматических иммуногистохимических реакций выполнены с применением программы «Sigma Scan Pro 5.0» [2]. Границы каждого поля зрения препаратов селезенки записывали в формате JPEG, для каждого случая вычисляли количество СD4-позитивных клеток.
Оценка статистической значимости проводилась по f-критерию Стьюден-та и критериям Вилкоксона - Манна - Уитни [9].
Результаты исследования и их обсуждение. Лимфатическая ткань селезенки крыс представлена белой пульпой и лимфоидными элементами красной пульпы. В ходе иммуногистохимических исследований нами было выявлено 6 различных морфотипов СD4-позитивных клеток селезенки крыс: I тип - крупные, с центрально расположенным округлым базофильным ядром, без видимых гранул и бледной светло-коричневой мембраной; II тип - крупные, с эксцентрично расположенным округлым ядром и неокрашенными пузырьками в цитоплазме; III тип - темно-коричневые грануляции, без цитоплазмы; IV тип - крупные, яркие, с эксцентрично расположенным округлым ядром, гранулами и отростками; V тип - малые, яркие, неправильной формы, без видимых гранул; VI тип - малые, бледные, правильной округлой формы, без гранул.
Таблица 1
Количественное распределение Сй4-позитивных клеток в разных зонах ткани селезенки интактных крыс и после длительного употребления кальция, М±т
Группы животных Микроструктуры селезенки
белая пульпа маргинальный синус красная пульпа тра-бекула
периартериаль-ная зона реактивная зона (герминативный центр) мантийная зона маргинальная зона
Контроль 0 0 8,5±0,08 7,7±0,3 9,1±0,5 47,7±0,9 14,2±0,04*
Опыт 2,2±0,01 3,1±0,05 5,3±0,02 6,7±0,2 8,8±0,9 23,6±0,8 11,5±0,02*
Примечание. * - достоверность (р < 0,05) по сравнению с контрольными данными.
В селезенке интактных животных Сй4-позитивные клетки в основном располагаются в мантийной и маргинальной зонах, вдоль маргинальных синусов и в красной пульпе (рис. 1). Нами не обнаружены изучаемые клетки в периартери-альной и реактивной (герминативный центр) зонах белой пульпы (табл. 1). Чаще выявляются в тканях селезенки Сй4-позитивные клетки I, IV и VI типов.
После системного поступления кальция в организм крыс Сй4-позитивные клетки преобладают в красной пульпе (рис. 2). Среди шести выделенных нами морфотипов клеток в тканях селезенки опытной группы преобладают клетки V и VI типов. Отличительной чертой срезов селезенки опытной группы является появление Сй4-позитивных клеток в герминативном центре (3,1±0,05) и периарте-риальной лимфоидной муфте лимфоидных узелков (2,2±0,01). Соответственно,
после поступления кальция общее количество С04-позитивных клеток снижается, но в белой пульпе - значительно увеличивается. Таким образом, кальций оказывает иммуномодулирующее действие на С04-позитивную популяцию лимфоцитов селезенки с Т-хелперной активностью.
В красной пульпе селезенки обеих групп животных подавляющее большинство 004-позитивных клеток представлены популяциями VI типа (малые, бледные, правильной округлой формы, без гранул, с площадью поверхности 102-686 мкм2), в белой пульпе - популяциями I и IV типов.
Рис. 1. Лимфоидный узелок селезенки крысы. Интактная группа. Иммуногистохимическая реакция с антителами 004. Микроскоп Микмед-5. Об. 40, ок. 10
Рис. 2. Лимфоидный узелок селезенки крысы. После поступления кальция с питьевой водой в течение 60 суток. Иммуногистохимическая реакция с антителами 004. Микроскоп Микмед-5. Об. 40, ок. 10
С помощью морфометрического анализа площади клетки морфотипы 004-позитивных клеток селезенки крыс были разделены на три группы - малые, средние и крупные. В популяции клеток обеих исследуемых групп преобладают клетки с малыми размерами - процент их количества составил 49,1% и 62,7%, соответственно (табл. 2).
Происходит увеличение абсолютного количества Сй4-позитивных клеток после длительного употребления кальция с питьевой водой почти в два раза - на 82,7% относительно контрольной группы. Также обнаружено перераспределение клеток по размерам: значительное преобладание малых СР4-позитивных клеток (62,7%) и снижение числа клеток крупных размеров.
Таблица 2
Морфометрические показатели распределения Сй4-позитивных клеток селезенки интактных крыс и после длительного употребления кальция
Популяции Сй4-позитивных клеток селезенки крыс Площадь клеток, мкм2 Количество СР4-позитивных клеток, шт. (%) Степень и направленность изменений
контрольная группа опытная группа
Малые 102-686 57 (49,1%) 133 (62,7%)* +13,6%
Средние 687-1270 29 (25%) 75 (35,4%)* +10,4%
Крупные 1271-1855 30 (25,9%) 4 (1,9%)* -24,0%
Количество Сй4-позитивных клеток в пяти полях зрения микроскопа 116 212 +82,7%
Примечание. * - достоверность (р < 0,05) по сравнению с контрольными данными.
Известно, что влияние окружающей среды на человека складывается из непрерывных воздействий физических, химических, социальных факторов. Это связано как с развитием промышленности, так и с освоением новых территорий, характеризующихся различным соотношением химических элементов в почве и питьевой воде [10]. Неблагоприятная геохимическая обстановка часто усугубляется бесконтрольным применением фармакологических препаратов и биологически активных добавок, содержащих различные химические элементы [8]. Сложившаяся ситуация свидетельствует о необходимости расширения научных знаний о влиянии химических элементов на деятельность эндокринной, нервной и иммунной систем.
По данным исследований Д. Оберлиса, для нормального протекания жизненных процессов в клетках и тканях необходимы микро- и макроэлементы [6]. Доказано, что кальций активизирует многие катаболические процессы (гликогенолиз, липолиз, протеолиз), стимулирует синтез белка, мышечное сокращение и немышечную подвижность, экзо-, эндоцитоз, ионный транспорт, секрецию нейромедиаторов, работу нервной и сердечно-сосудистой системы [8]. Он принимает активное участие в процессах высвобождения катехолами-нов из надпочечников и выделения нейромедиаторов пресинаптических мембран, участвует в стабилизации мембран тучных клеток, препятствует высвобождению гистамина и уменьшает проявление аллергических реакций, воспалительных процессов [8, 16]. Значимость для функционирования организма является причиной строгого поддержания постоянной концентрации ионов кальция в сыворотке крови: изменение ее лишь на 1% приводит в действие механизм, восстанавливающий необходимую концентрацию [6]. Показано, что интенсивность митотической активности в костном мозге и тимусе пропорциональна концентрации кальция в плазме. При отсутствии кальция большое число стимулированных антигеном клеток не может вступить в фазу активного синтеза ДНК, в результате чего иммунный ответ угнетается [5]. Удаление паращитовидных желез у крыс приводит к гипоплазии костного мозга, инво-
люции тимуса, снижению антителобразующих клеток (АОК) [7]. После удаления паращитовидных желез организм становится неспособным к увеличению количества АОК и повышению титров циркулирующих антител, снижается пролиферация тимических лимфобластов, что приводит к атрофии тимуса. Эффект восстанавливается введением ПТГ или кальция [8]. Повышение концентрации кальция вызывает деление и бласттрансформацию лимфоцитов [5]. Вышеизложенные факты позволяют думать о том, что для нормального функционирования лимфоидной ткани необходима стабильная концентрация кальция в организме [6].
По литературным данным, дифференцировка Т- и В- лимфоцитов происходит при участии стромального микроокружения селезенки [17] и антиген-представляющих клеток, к которым относятся дендритные клетки [13], ретикулярные клетки [5] и макрофаги [12]. В селезенке наблюдается наибольшая функциональная активность лимфоидных клеток, так как хелперно-индуктор-ная популяция СР4+ Т-лимфоцитов преобладает над СР8+ супрессорно-киллерной [5, 15].
Проведенные нами иммуногистохимические исследования микроструктур селезенки показали аналогичные результаты. В табл. 1 и 2 отображена качественная и количественная динамика распределения Сй4-позитивных клеток в различных структурах селезенки в норме и после 60-дневного поступления соли кальция с питьевой водой. Таким образом, селезенка играет важную роль в развитии системного иммунного ответа, являясь «домом» для местно протекающих антигенстимулированных лимфоцитов.
Для более подробного изучения иммунокомпетентных клеток селезенки при поступлении кальция планируется проведение серии экспериментов по идентификации супрессорных (СР8) субпопуляций Т-лимфоцитов и СР20-позитивных В-лимфоцитов.
Экспериментальные исследования поддержаны научными грантами Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере «Исследование морфофункциональных изменений биоаминсодержащих структур селезенки при водном воздействии кальция» (государственный контракт № 6975р/9584 от 04.09.2009); «Разработка оптимального состава хлеба, обогащенного кальцием, и исследование влияния продукта на показатели состояния здоровья обследуемых групп населения» (государственный контракт № 11306р/20545 от 14.01.2013).
Выводы. 1. С помощью иммуногистохимической реакции в селезенке крыс обнаружены Сй4-позитивные клетки 6 различных популяций. Наибольшее количество Сй4-позитивных клеток выявлено в красной пульпе селезенки.
2. Поступление с питьевой водой соли кальция отражается на распределении Сй4-позитивных клеток селезенки крыс.
3. После поступления кальция общее количество Сй4-позитивных клеток снижается, и впервые они в небольшом количестве появляются в периарте-риальной и реактивной зонах.
4. Происходит увеличение абсолютного количества и перераспределение по размерам Сй4-позитивных клеток после длительного употребления кальция с питьевой водой.
5. Кальций оказывает иммуномодулирующее действие на Сй4-позитив-ную популяцию лимфоцитов селезенки с Т-хелперной активностью.
Литература
1. Дьячкова И.М., Смородченкова А.Т. Изучение каспаз-9 позитивных клеток в тимусе лабораторных крыс при поступлении в организм хлорида кальция и метасиликата натрия с питьевой водой // Морфология в теории и практике: сб. материалов и тезисов (к 90-летию со дня рождения Д.С. Гордон). Чебоксары: Изд-во Чуваш. ун-та, 2012. С. 185-186.
2. Иммуногистохимическая характеристика акцидентальной инволюции тимуса после спле-нэктомии / Е.В. Москвичев, Л.М. Меркулова, Г.Ю. Стручко и др. // Вестник Национального медико-хирургического центра им. Н. И. Пирогова. 2012. Т. 7, № 2. С. 40-43.
3. Каркищенко Н.Н. Основы биомоделирования. М.:Изд-во ВПК, 2004. 608 с.
4. Кудрин А.В., Громова О.А. Микроэлементы в иммунологии и онкологии. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. 544 с.
5. Лунева А.Г. Роль Т-хелпертного звена иммунитета в реакции отторжения аллогенного трансплантата почки человека: автореф. дис. ... докт. мед. наук. Киев, 2003. 36 с.
6. Оберлис Д., Харланд Б., Скальный А. Биологическая роль макро- и микроэлементов у человека и животных. СПб.: Наука, 2008. 273 с.
7. Онтогенетические аспекты стромально-паренхиматозных взаимоотношений в селезенке / А.И. Рябикина, М.Ю. Капитонова, А.А. Нестерова и др. // Морфология. 2008. Т. 132, № 2. С. 58.
8. Пилат Т.Л. Биологически активные добавки к пище. M.: Авалон, 2002. 710 с.
9. Платонова А.Е. Статистический анализ в медицине и биологии: задачи, логика, компьютерные методы. М.: Изд-во РАМН, 2000. 52 с.
10. Сусликов В.Л., Толмачева Н.В. Эколого-биогеохимическое зонирование территорий -необходимый этап изучения причинно-следственных связей атеросклероза и его последствий // Фундаментальные исследования. 2007. № 12. С. 127-130.
11. Труфалкин В.А., Шурлыгина А.В. Проблемы гистофизиологии иммунной системы // Иммунология. 2002. № 1. С. 4-8.
12. Хаитов Р.М., Алексеев Л.П. Иммуногенетика и биомедицина // Российский аллерголо-гический журнал. 2013. № 1. С. 5-14.
13. Хайдуков С.В., Зурочка А.В. Цитометрический анализ субпопуляций T-хелперов (Th1, Th2, Treg, Th17, T-хелперы активированные) // Медицинская иммунология. 2011. Т. 13, № 1. С. 7-16.
14. Ярилин А.А. Транскрипционные регуляторы дифференцировки Т-хелперов: обзор // Иммунология. 2010. Т. 31, № 3. С. 153-168.
15. Ястребова С.А., Смирнова Т.Л., Ялалетдинова Л.Р. Реакция Сй4-позитивных макрофагов селезенки на введение Т-активина // Вестник Чувашского университета. 2013. № 3. С. 578-580.
16. Ficher M., Enblad G. et al. Interactions between tumor cell and mast cell in Hogkin's disease. Scand. J. Immunol., 2001, vol. 54, no. 1, p. 24.
17. Liu J. Enhanced CD4+ T cell proliferation and Th2 cytokine production in DR6-deficient mice. Immunity, 2001, vol. 15(1), pp. 23-34.
18. Stemberger L.A., Petrali J.P. The unlabeled antibody enzyme method. Attempted use of pe-roxidase-conjugated antigen as the third layer in the technique. J. Histochem. Cytochem., 1977, vol. 25(9), pp. 1036-1042.
References
1. D'yachkova I.M., Smorodchenkova A.T. Izuchenie kaspaz-9 pozitivnykh kletok v timuse labora-tornykh krys pri postuplenii v organizm khlorida kal'tsiya i metasilikata natriya s pit'evoi vodoi [The study of CASPAS-9 positive cells in the thymus of laboratory rats at the receipt in an organism of calcium chloride and metasilicate with drinking water]. Morfologiya v teorii i praktike: sb. materialov i tezisov (k 90-letiyu so dnya rozhdeniya D.S. Gordon) [Morphology in the theory and practice: collection of materials and theses (to the 90th anniversary since the birth of D.S.Gordon)]. Cheboksary, Chuvash State Univesity Publ., 2012, pp. 185-186.
2. Moskvichev E.V., Merkulova L.M., Struchko G.Yu. et al. Immunogistokhimicheskaya kharakte-ristika aktsidental'noi involyutsii timusa posle splenektomii [Immunohistochemical characterization of accidental evolution of the thymus after splenectomy]. Vestnik Natsional'nogo mediko-khirurgicheskogo tsentra im. N.I. Pirogova [Bulletin of national medical and surgical center named after N.I.Pirigov], 2012, vol. 7, no. 2, pp. 40-43.
3. Karkishchenko N.N. Osnovy biomodelirovaniya [Fundamentals of biomodelling]. Moscow, VPK Publ., 2004, 608 p.
4. Kudrin A.V., Gromova O.A. Mikroelementy v immunologii i onkologii [Microcells in immunology and oncology]. Moscow, GEOTAR-Media Publ., 2007, 544 p.
5. Luneva A.G. Rol' T-khelpertnogo zvena immuniteta v reaktsii ottorzheniya allogennogo transplan-tata pochki cheloveka: dis. ... dokt. med. nauk [The role of T-Hallertau immunity in the rejection of allogeneic transplant kidneys of humans and animals. Abstract of PhD thesis]. Kiev, 2003, 36 p.
6. Oberlis D., Kharland B., Skal'nyi A. Biologicheskaya rol' makro- i mikroelementov u cheloveka i zhivotnykh [The biological role of macro- and microelements in man and animals]. St. Petersburg, Nau-ka Publ., 2008, 273 p.
7. Ryabikina A.I., Kapitonova M.Yu., Nesterova A.A. et al. Ontogeneticheskie aspekty stromal'no-parenkhimatoznykh vzaimootnoshenii v selezenke [Ontogenetic aspects of stromal-parenchymal interactions in the spleen]. Morfologiya [Morphology], 2008, vol. 132, no. 2, pp. 58.
8. Pilat T.L. Biologicheski aktivnye dobavki k pishche [Biologically active food supplements]. Moscow, Avalon Publ., 2002, 710 p.
9. Platonova A.E. Statisticheskii analiz v meditsine i biologii: zadachi, logika, komp'yuternye me-tody [Statistical analysis in medicine and biology: challenges, logic, computer methods]. Moscow, RAMN Publ., 2000, 52 p.
10. Suslikov V.L., Tolmacheva N.V. Ekologo-biogeokhimicheskoe zonirovanie territorii - neobk-hodimyi etap izucheniya prichinno-sledstvennykh svyazei ateroskleroza i ego posledstvii [Ecological-biogeochemical zoning is a necessary stage in the study of the causal relationship of atherosclerosis and its consequences]. Fundamental'nye issledovaniya [Basic researches], 2007, no. 12, pp. 127-130.
11. Trufalkin V.A., Shurlygina A.V. Problemy gistofiziologii immunnoi sistemy [Problems of histo-physiology immune system]. Immunologiya [Immunology], 2002, no. 1, pp. 4-8.
12. Khaitov R.M., Alekseev L.P. Immunogenetika i biomeditsina [Immunogenetic and Biomedi-cine]. Rossiiskii allergologicheskii zhurnal [Russian allergic magazine], 2013, no. 1, pp. 5-14.
13. Khaidukov S.V., Zurochka A.V. Tsitometricheskii analiz subpopulyatsii T-khelperov (Th1, Th2, Treg, Th17, T-khelpery aktivirovannye) [Cytometrics analysis of subpopulations of T-Hellerau (Th1, Th2, Treg, Th17]. Meditsinskaya immunologiya [Medical immunology], 2011, vol. 13, no. 1, pp. 7-16.
14. Yarilin A.A. Transkriptsionnye regulyatory differentsirovki T-khelperov: obzor [Transcriptional regulators of differentiation of T-Hellerau: survey]. Immunologiya [Immunology], 2010, vol. 31, no. 3, pp. 153-168.
15. Yastrebova S.A., Smirnova T.L., Yalaletdinova L.R. Reaktsiya CD4-pozitivnykh makrofagov selezenki na vvedenie T-aktivina [The response of CD4-positive macrophages of the spleen to the introduction of T-activin]. Vestnik Chuvashskogo universiteta, 2013, no. 3, pp. 578-580.
16. Ficher M., Enblad G. et al. Interactions between tumor cell and mast cell in Hogkin's disease. Scand. J. Immunol., 2001, vol. 54, no. 1, p. 24.
17. Liu J. Enhanced CD4+ T cell proliferation and Th2 cytokine production in DR6-deficient mice. Immunity, 2001, vol. 15(1), pp. 23-34.
18. Stemberger L.A., Petrali J.P. The unlabeled antibody enzyme method. Attempted use of pe-roxidase-conjugated antigen as the third layer in the technique. J. Histochem. Cytochem., 1977, vol. 25(9), pp. 1036-1042.
МЕЛЬНИКОВА ОЛЬГА ВЛАДИМИРОВНА - аспирант кафедры медицинской биологии с курсом микробиологии и вирусологии, Чувашский государственный университет, Россия, Чебоксары (olga1407@bk.ru).
MELNIKOVA OLGA - Post-Graduate Student, Department of Medical Biology with Microbiology and Virology Course, Chuvash State University, Cheboksary, Russia.
СЕРГЕЕВА ВАЛЕНТИНА ЕФРЕМОВНА - доктор биологических наук, профессор кафедры медицинской биологии с курсом микробиологии и вирусологии, Чувашский государственный университет, Россия, Чебоксары (kaf-biology@yandex.ru).
SERGEEVA VALENTINA - Doctor of Biological Sciences, Professor, Department of Medical Biology with Microbiology and Virology Course, Chuvash State University, Cheboksary, Russia.
