CC BY
55
УДК 616.411:612.412:615.2 ББК Е 60:737
С .А. ЯСТРЕБОВА, Т.Л. СМИРНОВА, Л.Р. ЯЛАЛЕТДИНОВА РЕАКЦИЯ ^4-ПОЗИТИВНЫХ МАКРОФАГОВ СЕЛЕЗЕНКИ НА ВВЕДЕНИЕ Т-АКТИВИНА*
Ключевые слова: селезенка, красная и белая пульпа, CD4-позитивные макрофаги, моноклональные антитела, Т-активин.
Выявлены CD4-позитивные макрофаги в красной и белой пульпе, маргинальном синусе, трабекулах селезенки интактных мышей и при введении иммуномодулятора Т-активина. В ходе цитоморфологического исследования СD4-позитивные макрофаги селезенки разделены на 5 групп.
S.A. YASTREBOVA, T.L. SMIRNOVA, L.R. YALALETDINOVA REACTION OF CD4 POSITIVE SPLEEN MACROPHAGES TO THE INTRODUCTION OF T-ACTIVIN
Key words: spleen, red and white pulp, CD4 positive macrophages, monoclonal antibodies, T-activin.
CD4 positive macrophages in the red and white pulp, marginal sinus, trabeculae of the spleen of intact mice with the introduction of immunomodulator T-activin are identified. During the cy-tomorphological study of CD4 positive spleen macrophages are divided into 5 groups.
Изучению состава популяции лимфоцитов при воздействии иммуномодуляторов уделяется большое внимание. Зрелые наивные медуллярные Т-лим-фоциты, экспрессирующие CD4, распознают молекулу HLA II класса [2]. CD4-55kDA представляет собой трансмембранный гликопротеин, экспрессируемый Т-хелперами и определяемый на 55-65% зрелых Т-клетках периферической крови и тимоцитах мозгового вещества тимуса. CD4-маркер также экспрессирует моноциты-макрофаги, клетки Лангерганса и другие дендритные клетки [2]. Характерной иммунофенотипической особенностью наивных Т-хел-перов является мембранная экспрессия молекулы CD45RA. В белой пульпе селезенки в периартериальных лимфоидных муфтах CD4-позитивные Т-клетки преобладают над CDS-позитивными, в то время как в красной пульпе другое соотношение популяций клеток [2].
Цитоморфометрическое определение CD4-позитивных клеток с помощью моноклональных антител широко применяется в клинической иммунологии для определения содержания Т-хелперов при иммунодифицитных состояниях, в особенности при ВИЧ-инфекции, лимфопролиферативных заболеваниях.
В литературе широко описаны гуморальные изменения при введении иммуномодуляторов [1, 3, 6]. Морфологическим реакциям в иммунных органах уделяется недостаточно внимания.
Цель исследования - изучение популяций CD4-позитивных клеток селезенки у интактных животных, под влиянием иммуномодулятора Т-активина.
Материалы и методы исследования. Объектом исследования служила селезенка 4S мышей-самцов массой 22-24 г. Животные были разделены на три группы: I группа - интактные животные (n = 16); II группа - контрольные животные с введением физраствора 0,2 мг на животное (n = 16); III группа - экспериментальные животные с введением Т-активина по 0,2 мг на животное (n = 16). Селезенка забиралась под глубоким наркозом. В работе использован иммуноги-стохимический стрептавидин-биотин-пероксидазный метод [4, 7]. Селезенки мышей после фиксации в 10%-ном растворе нейтрального формалина материал заливали парафином. Парафиновые срезы толщиной 5 мкм готовились на мик-
* Работа выполнена на кафедре медицинской биологии с курсом микробиологии и вирусологии. Госбюджетная тема 0120.085.1887 от 2008 г. «Гистохимия биогенных аминов в морфофункциональном состоянии органов и тканей в норме и эксперименте».
ротоме МПС-2, и после депарафинирования и регидратации в этаноле нисходящей концентрации срезы селезенки погружали в восстанавливающий цитратный буфер (рН 6,0). Затем проводили высокотемпературную обработку прогреванием на водяной бане при 90-95°С в течение 30 мин с целью демаскировки искомых антигенов в тканях. После ингибирования эндогенной пероксидазы 3%-ным раствором перикиси водорода на метаноле проводили иммуногистохимическую реакцию методом трехэтапного непрямого иммуноферментного анализа с использованием первичных моноклональных антител (МКАТ) к антигенным маркерам CD4 в разведении 1:100 согласно рекомендации фирмы-изготовителя (Dako, Дания). Визуализацию первичных МКАТ, связавшихся с антигенами, проводили стандартным биотин-стрептавидин-пероксидазным методом с использованием набора LSAB-2 (Labeled Streptavidin Biotin System Peroxidase). На заключительном этапе срезы докрашивались толуидиновым синим по Нисслю. Морфометрическое исследование участков селезенки проведено с применением компьютерного анализа микроскопических изображений. Аппаратное обеспечение состояло из микроскопа, цифровой камеры Canon, ПК на базе Intel Pentium 4, имеющего программное обеспечение для анализа изображений Sigma Scan Pro 5.0 (Systat). Границы каждого поля зрения препаратов селезенки записывали в формате JPEG, для каждого случая вычисляли количество CD4-позитивных клеток.
Статистическая обработка полученных цифровых данных проводилась с использованием пакета программ Microsoft office (Word и Excel). Оценка статистической значимости проводилась по ^-критерию Вилкоксона-Манна-Уитни.
Результаты исследования и их обсуждение. Лимфатическая ткань селезенки представлена белой пульпой и лимфоидными элементами красной пульпы. В ходе цитоморфологических исследований нами было выявлено 5 различных популяций CD4-позитивных клеток селезенки: I тип - крупные, яркие, без видимых гранул; II тип - крупные, бледные, с гранулами и без отростков; III тип - крупные, бледные, с гранулами и отростками; IV тип - мелкие, яркие, без видимых гранул; V тип - мелкие, с бледными гранулами.
В селезенке интактных животных общее количество CD4-позитивных клеток преобладает в красной пульпе и совсем не выявляется в периартери-альной и реактивной зонах белой пульпы. Чаще выявляются в тканях селезенки СD4-позитивные клетки V типа (36,6+1,8 на поле зрения).
При введении Т-активина также СD4-позитивные клетки преобладают в красной пульпе (180,8+10,6), в то время как в белой пульпе их всего 43,3±2,3. Максимальное количество СD4-позитивных клеток выявлено на 3-и сутки после введения Т-активина (84,8+3,8), а минимальное количество - на 1-е сутки эксперимента (38,5+2,9). Среди пяти выделенных нами типов СD4-позитивных клеток в тканях селезенки преобладают клетки V типа (180+6,8), на втором месте клетки I типа (33,9+4,1), на третьем -клетки IV типа (29,7+2,1), на четвертом - клетки III типа (13,9+1,2), на пятом - популяция клеток II типа (4,7+1,4).
Распределение CD4-позитив-ных клеток в структурах селезенки показано в таблице.
По литературным данным в белой пульпе селезенки преобладают CD4-пози-тивные Т-клетки над CD8^-зитивными Т-клетками, а в „ КОНІПї:~,нн;гГв'рно0ть р< 005) по ер“""°
Количество С04-позитивных клеток в разных зонах ткани селезенки при введении физиологического раствора и Т-активина, M±m
Группы животных Микроструктуры селезенки
белая пульпа маргинальный синус красная пульпа трабе- кула
Т-активин 1-е сут. 3,2±1,1 1,2±0,9 31,9±2,8 2,2±1,2*
Т-активин 3-и сут. 28,4±2,9* 6,4±1,6* 46,6±2,1* 3,4±1,6*
Т-активин 7-е сут. 5,7±1,5* 8,5±1,4* 32,7±1,9* 0
Т-активин 14-е сут. 2,2±1,3 8,6±1,89* 27,6±1,8 1,8±1,1
Контроль 3,8±1,6 7±1,68 42±3,5 0
красной пульпе отмечается обратное соотношение между этими популяциями [3, 6]. Иммуногистохимические исследования микроструктур селезенки показали аналогичные результаты. В таблице представлена динамика содержания Сй4-позитивных Т-клеток селезенки на введение Т-активина.
Методами иммуногистохимии нам удалось исследовать Сй4-позитивные Т-клетки селезенки в течение 14 суток. Гистологическая картина показывает, что общее количество Сй4-позитивных клеток преобладает в красной пульпе, клетки совсем не выявляются в периартериальной и реактивной зонах белой пульпы.
В ходе цитологического исследования были выявлены 5 морфотипов Сй4-позитивных клеток селезенки, играющих определенную роль в иммунологических реакциях. В красной пульпе преобладают мелкие клетки V типа.
При введении Т-активина нарастает количество Сй4-позитивных клеток. На 2-е сутки наиболее реактивными оказались клетки белой и красной пульпы, маргинального синуса и трабекулы. Содержание Сй4-позитивных клеток в белой пульпе достигло 28,4+2,9 в поле зрения (р < 0,05) в сравнении с контрольными данными 3,8+1,6 в поле зрения. Морфологическое влияние Т-ак-тивина в отношении клеток красной пульпы возрастало на 3-и сутки.
Исследования иммуногистохимического статуса при введении Т-активина показали, что в селезенке происходят выраженные иммуностимулирующие воздействия, затрагивающие Т-клеточное звено.
Препарат Т-активин является средством, нормализующим течение иммунологических процессов при многих заболеваниях [1, 2]. Применение Т-активина корригирует течение иммунологических процессов и нормализует метаболизм [5]. Проведенное нами исследование показывает, что введение иммуномодулятора Т-активина приводит к изменению общего количества Сй4-позитивных клеток в разные сроки эксперимента, в разных зонах селезенки, а также к перераспределению соотношений разных типов Сй4-позитивных клеток.
Выводы. 1. Изменение гистологической структуры селезенки и клеточного состава расширяет представления о морфологических реакциях лимфоидного органа на введение Т-активина.
2. Применение Т-активина показано с целью иммуномодуляции при патологических состояниях, сопровождающихся иммуносупрессией.
Литература
1. Донецкова АД, Никонова М.Ф., Ярилин А.А. Экспрессия генов транскрипционных факторов, контролирующих дифференцировку адаптивных популяций Сй4+ Т-лимфоцитов в покоящихся и активированных лимфоцитах у здоровых людей // Иммунология. 2011. № 4. С. 184-189.
2. Иммунные механизмы воспалительных процессов при заболеваниях внутренних органов / И.П. Корюкина, А.В. Туев, В.Ю. Мишланов и др. Пермь: ПГМА им. Е.А. Вагнера, 2008. 150 с.
3. Иммунодиагностика лимфом / И.И. Тупицын, Е.Н. Шолохова, ЛЮ. Андреева и др. // Современная онкология. 2002. Экстра-выпуск. С. 12.
4. Новиков В.И. Патогенетическое обоснование использования иммунокорригирующей терапии в комплексном лечении сахарного диабета 1-го типа (экспериментально-клиническое исследование): автореф. ... дис. докт. мед. наук. М., 2004. 36 с.
5. Пособие по иммунологии / Д.К. Новиков, Н.В. Железняк, С.В. Жаворонок и др. Витебск: Изд-во Витебского гос. мед. инт-та. 1996. 19 с.
6. Desanti G.E., Cumano A., Golub R. Identificacion of СР4 progenitors in mouse fetal spleen, a source of resident lymphoid cells // J. of Leukocyte. 2008. Vol. 83, May. P. 1145-1154.
7. Sternberger L.A., Petrali J.P. The unlabeled antibody enzyme method. Attempted use of peroxidase-conjugated antigen as the third layer in the technique // J. Histochem. Cytochem. 1977. Vol. 25(9), Sep. P. 1036-1042.
ЯСТРЕБОВА СВЕТЛАНА АЛЕКСАНДРОВНА. См. с. 577. СМИРНОВА ТАТЬЯНА ЛЬВОВНА. См. с. 563. ЯЛАЛЕТДИНОВА ЛЕЙСАНА РАМИЛОВНА. См. с. 577.
