CC BY
112
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА И БИОЛОГИЯ
УДК 616.5-001.4-018 © А.Х. Ланичева, 2010
А.Х. Ланичева
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИНАМИКИ РАНЕВОГО ПРОЦЕССА ПОСЛЕ МЕХАНИЧЕСКОЙ ТРАВМЫ КОЖИ БЕЛЫХ КРЫС И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПЕРСПЕКТИВНЫХ НАПРАВЛЕНИЙ ЕГО КОРРЕКЦИИ
ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава», г. Уфа
Представлены результаты иммуногистохимического изучения цито- и гистоархитектоники кожи белых крыс в динамике раневого процесса после механической травмы в естественных условиях и на фоне коррекции состояния дренажно-детоксикационной функции кожи и пролиферативной активности ее клеток. Доказано: базовые структурно-
функциональные изменения, характерные для раневого процесса в коже (в частности уровень клеточной пролиферации), могут быть целенаправленно модулированы не только с помощью специфического воздействия (ретиноидные препараты), но и неспецифического воздействия углеродминеральных сорбентов, что существенно изменяет заживление раны. Ключевые слова: кожа, раневой процесс, иммуногистохимия, коррекция.
A.Kh. Lanitcheva
IMMUNOHISTOCHEMICAL CHARACTERISTICS OF THE WOUND PROCESS DYNAMICS AFTER A MECHANICAL TRAUMA TO THE SKIN OF WHITE RATS AND PERSPECTIVE TRENDS OF ITS CORRECTION
The outcomes of immunohistochemical analysis of the cyto- and histoarhitectonic of white rats in the dynamics of a wound process after a mechanical trauma in vivo and at the a background of correction of the skin drenage-detoxication function condition and proliferative activity of its cells are presented in the paper. It has been shown that: the basic structurall functional changes, typical of a skin wound process (in particularly the level of cellular proliferation), can be modulated using specific effects (retinoid drugs), but also nonspecific ones of carbon-mineral sorbents. This siguificautly changes the wound repairing.
Key words: skin wound process, immunohistochemistry, correction.
Механическое повреждение кожи - неизбежное следствие практически любой травмы. Оно часто встречается, значительно варьирует по тяжести и площади контакта с травмирующим фактором, имеет большое значение для исхода посттравматического восстановления организма, а часто и для социальной реабилитации пострадавших [9, 6]. Значение исследования раневого процесса в коже связано не только с ростом стихийных бедствий, производственных и бытовых травм, автокатастроф, военных действий, но и с множеством вопросов его патогенеза, в том числе механизмов компенсаторно-
восстановительной реорганизации цито- и гистоархитектоники составляющих компонентов кожи, взаимоотношения ее дренажно-детоксикационной системы и пролиферативной активности эпителиальных, эндотелиальных клеток, клеток соединительной ткани и крови на разных этапах замещения дефекта, формирования соответствующих гистионов [7, 8, 12]. По данным литературы, раневой процесс в коже рассматривается как реализа-
ция потенциально возможных адаптивных механизмов комплекса тканей организма в рамках взаимодействующей системы гистио-на [8, 12]. При этом большое значение как и в других органах [2], вероятно, играет состояние дренажно-детоксикационной функции кожи. Поэтому изучение раневого процесса как своеобразной системы, которая рождается, формируется, функционирует и подвергается регрессу со всеми сопровождающими эти изменения системными и межсистемными взаимоотношениями, несомненно, позволит получить новые научные данные.
Таким образом, проблема нормализации (протезирования) дренажно-
детоксикационной функции кожи и проблема целенаправленной коррекции пролиферативной активности ее недифференцированных клеток как основы регенерации кожного дефекта, на наш взгляд, имеют значение для совершенствования тактики локального консервативного лечения механической травмы кожи.
В связи с вышеизложенным, мы считаем целесообразным проведение сравнительного изучения пролиферативной активности базальных клеток эпидермиса и волосяных фолликулов при специфическом воздействии на ядерные рецепторы (мазь Редецил на основе ретиноидов) [7] и неспецифическом воздействии на раневой процесс сорбента СУМС-1, который обеспечивает локальное протезирование дренажно-детоксикационной функции любой микроциркуляторной системы [2, 3].
Поэтому целью настоящего исследования явилось изучение иммуногистохимиче-ским методом пролиферативной активности популяции эпителиальных клеток кожи в динамике раневого процесса на фоне лечения мазью Редецил и сорбентом СУМС-1.
Материал и методы
Эксперимент проведен на 105 белых беспородных крысах обоего пола массой 180200 г в соответствии с «Правилами работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 № 755).
Опыты распределены на пять серий: группа I - интактные животные - 5; группа II - модель механической травмы без лечения - 25;
группа III - модель механической травмы с
использованием мази Редецил - 25;
группа IV - модель механической травмы с
использованием СУМС-1 - 25;
группа V - модель механической травмы с
сочетанным использованием мази Редецил и
СУМС-1 - 25.
Травму кожи вызывали механическим повреждением с помощью специальной установки, равносильной по передаче кинетической энергии снаряда тканям при огнестрельном ранении [5, 8]. Эксперимент проводили под эфирным наркозом. Объектом ранения в эксперименте служила голень правой задней конечности крысы.
Материал для морфологического исследования кожи в области раны (0,5 х 1,5 см) забирали после наркотизирования и декапи-тации через 6 ч (п=5), 1 сутки (п=5), 3 суток (п=5), 7 суток (п=5) и 14 суток (п=5) после травмы.
Для обзорной световой микроскопии и иммуногистохимического исследования образцы кожи фиксировали в 10% растворе формалина на фосфатном буфере фирмы ООО «Биовитрум», Санкт- Петербург. Материал заливали в парафин по общепринятой методике [4]. С парафиновых блоков готовили
фронтальные срезы толщиной 4-5 мкм. Для проведения морфометрического исследования срезы толщиной 4-5 мкм делали на ротационном микротоме LaboCut 4055 (фирма Slee, Германия) с помощью одноразовых микро-томных лезвий А35 (фирма Feather, Япония), срезы размещали на стандартных по толщине предметных стеклах фирмы Menzel - Glaster (Германия) и окрашивали гематоксилином и эозином, азуром и методом Ван-Гизона. В препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином оценивали гистотопографию раны. При окраске азуром выявляли соотношение клеток гематогенного происхождения и соединительной ткани в ходе регенерационного гистогенеза. В перинекротической области раны подсчитывали количество гранулоцитов, мононуклеарных клеток и тучных клеток, суммарное количество клеток негематогенного происхождения, фибробластов, фиброцитов [1]. Методом Ван-Гизона окрашивали соединительную ткань и коллагеновые волокна. В дальнейшем проводили микрофотосъемку гистологических препаратов на микроскопе Axio Scope 40 (Carl Zeiss) и Axio Star (Carl Zeiss) с встроенным ТУ-адаптером и цифровой видеокамерой Carl Zeiss Imager, A1, окуляр W-PI 10x/23, объективы: Achroplan 20х/0,45, 40x/0,60, 63x/0,80 и 100x/1,25 oil.
Для более детального изучения пролиферации и дифференцировки клеток кожи использовали иммуногистохимические методы с мечеными моноклональными антителами. При выборе антител учитывали следующие критерии: высокая чувствительность метода, простота постановки и оценки реакции, низкое фоновое окрашивание и воспроизводимость результатов [13]. Этим условиям и цели работы соответствовали антитела для выявления белка CK-14 (экспрессируется во всех слоях эпидермиса, его количество линейно связано с уровнем дифференцировки клеток и нарастает по направлению от рогового слоя к базальному, маркер информативен при исследовании дифференцировки кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса) и белка Ki-67 (ядерный белок, является высокоселективным маркером пролиферативной активности) [11]. Для проведения иммуногистохими-ческой реакции использовались соответствующие антитела - CK-14 (Clone RB 9020 -K7) и Ki-67 (Clone RM 9106) фирм Labvision (США) и Dako Cytomation (США).
Постановку иммуногистологического окрашивания осуществляли согласно рекомендациям фирмы-производителя. После де-парафинирования и регидратации срезов в
1Q2
трех сменах ксилола проводили демаскировку антигенов в микроволновой печи в цитратном буфере при pH 6,0. Для предотвращения фонового окрашивания инкубировали препарат в блоке эндогенной пероксидазы, промывали в Tris Buffered Salin при pH 7,6. Рабочие разведения антител - 1:200. Визуализацию результатов проводили с использованием системы детекции Ultra Vision ONE Detection System HRP Polymer. Инкубировали с рекомендованным хромогеном-DAV Plus Substrate System. Срезы докрашивали гематоксилином Майера и заключали в БиоМаунт - среду.
Для оценки качества реакции использовали стекла с позитивным контролем для каждого антигенов (фирма Labvision, США). Для оценки экспрессии Ki-67 рассчитали индекс Ki-67 - содержание Ki-67-позитивных клеток в поле зрения микроскопа. Подсчеты производили при об. х100, ок.х15 в 20-23 полях зрения среза. Для оценки результатов им-муногистохимического окрашивания с использованием антител к СК-14 измеряли ширину зоны положительной экспрессии белка (в мкм) при помощи комплекса Микмед-2-1600-3 и программного обеспечения Image Tool (USA, Universiti Texas).
Системный статистический анализ проводили с использованием программы Statistica 6.0. Проверку статистических гипотез осуществляли с помощью непараметрических методов. Сравнение двух попарно не связанных выборок по их средним тенденциям проводили с помощью критерия Манна-Уитни, при сравнении более двух вариационных рядов использовали однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA Краскела-Уоллиса) [10].
Результаты и обсуждение
Наши исследования показали, что в процессе естественного заживления раны экспрессия белков СК-14 и Ki-67 статистически значимо меняется (ANOVA Краскела-
Уоллиса; H>6,5, p<0,05). Максимальное количество иммунопозитивных клеток выявляется в фазе регенерационного гистогенеза через 7 суток после травмы (рис. а и б).
К 7-м суткам в области раневого дефекта интенсивно разрастается грануляционная ткань, для которой характерно большое количество новообразованных растущих гемокапилляров, макрофагов, тканевых базофилов, лимфоидных элементов, фибробластов. Основные закономерные процессы регенерационного гистогенеза и адаптивной перестройки эпителия кожи проявляются в перинекротиче-ской области. В эпителии происходит актива-
ция камбиальных источников развития, их миграция и дивергентная дифференцировка.
Рис. Генерализованное усиление экспрессии белка СК-14 (а) и Кл-67 (б), интенсивное окрашивание, четкие контуры эпителиальных клеток кожи белой крысы через 7 суток после травмы, группа II (без коррекции). Иммуногистохимический метод верификации белка с помощью меченых моноклональных антител, докрашивание гематоксилином Майера. Микрофото.
Ув.х100.
Особенно наглядно это проявляется при анализе Ю-67-позитивных клеток эпидермиса и волосяных фолликулов. Максимальное количество Кь67-позитивных клеток (рис. 1 б) выявляется в базальном слое эпидермиса, но значительное их количество верифицируется и вне базального слоя, что свидетельствует об их миграции и пролиферации. Морфометрический анализ СК-14 позитивных клеток показал, что через 6 часов после травмы контуры эпидермиса размытые, экспрессия белка ниже среднего уровня, а на некоторых участках отсутствовала. По уровню индекса пролиферации отмечалась низкая экспрессионная активность базальных клеток эпидермиса и волосяных фолликулов (индекс Ю-67: 22,4±6,8%). Через 1, 3 и 7 суток отмечались прогрессивное усиление экспрессии белков СК-14 и Ю-67 и соответствующий рост индекса пролиферации (1-е сутки - 28,2±3,9%; 3-и сутки - 41,5±5,7%; 7-е сутки -
88,6±12,2%), что свидетельствовало о ком-
пенсаторном увеличении количества эндотелиальных клеток.
Таким образом, максимальное количество иммунопозитивного материала и меченых клеток отмечалось через 7 суток после травмы. Эпидермис в этот период был утолщен, контуры эпителиальных клеток четкие на всем его протяжении (рис. 1а). Ядра большинства базальных клеток меченные (рис. 1б). Через 14 суток иммуноцитоархитектоника эпидермиса и волосяных фолликулов не изменялась, сохранялись гипертрофические и гиперпластические проявления, но экспрессия белка Ki-67 в базальных клетках уменьшалась. Об этом свидетельствует снижение индекса пролиферации с 88,6±12,2 до 39,5±8,8% (уровень 3 суток) ( ^<0,01). При сравнении экспериментальных групп (II-V) по срокам исследования статистически значимые различия между группами по уровню экспрессии белков СК-14 и Ki-67 отмечались через 1, 3, 7 и 14 суток (ANOVA Краскела-Уоллиса; H>9,8, /><0,01). Парное сравнение между группами показало, что выявленные в ходе ANOVA различия через 1 и 3 суток были обусловлены статистически значимым увеличением на 15-22% (95% доверительный интервал) содержания Ki-67 иммунопозитивных клеток в группах животных с СУМС-1 (группы IV и V) по сравнению с животными группы II (_р<0,01). Различия же через 7 и 14 суток были обусловлены статистически значимым увеличением на 10-17% содержания Ki-67 иммунопозитивных клеток в группах животных, леченных мазью Редецил (группы IV и V) по сравнению с животными группы II ( ^<0,05). Это свидетельствует о том, что через 6 часов после травмы во всех группах животных в зоне повреждения устойчиво преобла-
дают катаболические процессы, а использованные препараты не меняют уровень экспрессии изученных белков ни за счет специфического (активация ретинол - связывающих рецепторов), ни за счет неспецифического (протезирование дренажно-детоксикационной функции и локального снижение уровня интоксикации) влияния на эпителиальные клетки кожи. Через 1и 3 суток увеличение экспрессии белков СК-14 и Ю-67 в большей степени обусловлено положительным влиянием сорбента на дренажно-детоксикационную функцию кожи на фоне выраженного воспаления, а через 7 и 14 суток - активацией ретинол - связывающих рецепторов и последующей пролиферации на фоне естественного включения механизмов регенерационного гистогенеза.
Таким образом, при анализе результатов иммуногистохимического изучения уровня экспрессии белков СК-14 и Ю-67 в зоне механического повреждения кожи белых крыс получены новые данные об особенностях влияния на пролиферативную активность базальных клеток эпидермиса и волосяных фолликулов специфических и неспецифических способов ее регуляции. В условиях нарушения дренажно-детоксикационной функции кожи после ее механического повреждения существенно снижаются возможности специфической (посредством определенных рецепторов) активации репаративных механизмов. Вероятно, только после нормализации микро-циркуляторных процессов в тканях кожи (например с помощью сорбентов) становится возможным эффективная целенаправленная специфическая коррекция восстановления популяции эпителиальных клеток эпидермиса и волосяных фолликулов.
Сведения об авторе статьи
Ланичева Альбина Хамитовна
аспирант кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии Башкирского государственного медицинского университета телефон: 8 (347)-256-82-51, е-шай: [email protected]
ЛИТЕРАТУРА
1. Автандилов, Г.Г. Введение в количественную патологическую морфологию. - М.: Медицина, 1980. - 216 с.
2. Бгатова, Н.П. Использование биологически активных пищевых добавок на основе природных минералов для детоксикации организма / Н.П. Бгатова, Я.Б. Новоселов - Новосибирск, 2000. -240 с.
3. Бородин, Ю.И. .Лимфатическая система и лимфотропные средства / Ю.И. Бородин, А.В. Ефремов, А.А. Зыков, В.Н. Горчаков. - Новосибирск, 1997. - 136 с.
4. Микроскопическая техника: руководство / под ред. Д.С.Саркисова, Ю.Л.Перова. - М.: Медицина, 1996. - 544 с.
5. Мурзабаев, Х.Х. Способ дозированной передачи кинетической энергии снаряда повреждаемым тканям / Х.Х. Мурзабаев, И.Г. Кашапов // Морфология. - 2001. - Т. 120, № 6. - С. 83-84.
6. Ноздрин, В.И. Гистофизиология кожи / В.И. Ноздрин, С.А. Барашкова, В.В. Семченко -Омск, 2008. - 280 с.
7. Ноздрин, В.И. Гистофармакологические исследования кожи: наш опыт / В.И. Ноздрин, Т.А. Белоусова, В.И. Альбанова, О.И. Лаврик. - М.: ЗАО Ретиноиды, 2006. - 376с.
8. Одинцова, И.А. Закономерности процессов регенерационного гистогенеза в кожномышечной ране / И. А. Одинцова // Анатомия и военная медицина. - СПб.: ВМедА, 2003. - С. 41-43
9. Раны и раневая инфекция: руководство для врачей / под ред. М.И. Кузина, Б.М. Костюченка. - М.: Медицина, 1990. - 591 с.
10.Реброва, О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA / О.Ю. Реброва - М., МедиаСфера, 2002. - 305 с.
11.Упоров, А.В. Сравнительное изучение пролиферации (по выявлению антигена КІ-67) и активности ядрышковых организаторов клеток рака молочной железы / А.В. Упоров., Е.В. Цыр-лина, К.М. Пожарисский // Вопросы онкологии. - 1998. - Т. 44, N 3. - С. 316-324.
12.Чепурненко, М.Н. Морфологическая характеристика тканей кожи в регенерационном гистогенезе при механической травме в эксперименте: автореф. дис. ... канд. биол. наук. - СПб., 2007. - 17 с.
13.Kohler G., Milstein C. Continious cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity / Nature. - 1975. - V. 256. - P. 495-497.
УДК 611.728.3-018.36 © Л.Г. Нурбулатова, В.Ш. Вагапова, 2010
Л.Г. Нурбулатова, В.Ш. Вагапова СТРОЕНИЕ СТЕНОК СИНОВИАЛЬНЫХ СУМОК КОЛЕННОГО СУСТАВА
ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава», г. Уфа
С целью изучения рельефа поверхности и фиброархитектоники различных участков стенок синовиальных сумок коленного сустава было исследовано 20 ампутированных нижних конечностей людей обоего пола.
Поверхность стенок после обработки препаратов раствором азотнокислого серебра исследована отраженной световой микроскопией. Фиброархитектоника изучена комплексным методом окраски пленочных препаратов по Харту, водной анилиновой синей и гематоксилином.
В результате исследования выявлено, что по рельефу поверхности и фиброархитектонике различные участки стенок синовиальных сумок коленного сустава неоднородны и делятся на ареолярную, адипозную, фиброзную и ареолярно - ади-позную типы синовиальной мембраны.
Ключевые слова: коленный сустав, синовиальные сумки, рельеф, фиброархитектоника.
L.G. Nurbulatova, V.S. Vagapova KNEE - JOINT SYNOVIAL BURSA, ITS WALL MORPHOLOGY
Goaling at the conducting studies on different knee - joint synovial bursae relief surface of walls and their fibroarchitectonics, twenty (20) amputated lower limbs of both human sexes have been investigated.
The surfaces of the bursae walls were studied with method of the indirect light microscopy after impregnation with nitrate of silver.
The fibroarchitectonics were investigated with the help of the complex method, that is Chart,s, water aniline blue and hematoxylin staining the membrane specimens.
As a result of the investigation it was revealed that the different areas of knee - joint synovial bursae walls were not homogeneous in the relief their surfaces and their fibroarchitectonics. Consequently those knee - joint synovial bursae walls can be classified into four (4) types of the synovial membrane: areolar, adipose, fibrous and areolar - adipose types.
Key words: knee - joint, synovial bursae, relief, fibroarchitectonics.
Известно, что синовиальная мембрана капсулы суставов имеет различное строение: ареолярное, адипозное, фиброзное [5; 4], и между ними имеются переходные зоны. Стенки синовиальных сумок коленного сустава до настоящего времени не были предметом специальных исследований.
Цель исследования - выявить особенности строения стенок различных синовиальных сумок коленного сустава.
Материал и методы
Материалом исследования были 20 ампутированных нижних конечностей людей обоего пола зрелого, пожилого и старческого возрастов. Поверхность стенок синовиальных сумок исследована отраженной световой микроскопией после обработки препаратов раствором азотнокислого серебра. Фиброархи-тектоника изучена комплексным методом окраски пленочных препаратов по Харту, вод-
