CC BY
59
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА И БИОЛОГИЯ
УДК: 616.5-001.4-091/092
© А.Х. Ланичева, Х.Х. Мурзабаев, В.В. Семченко, С.С. Степанов, 2010
А.Х. Ланичева1, Х.Х. Мурзабаев1, В.В. Семченко2, С.С. Степанов2 АНАТОМО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ КОЖИ БЕДРА БЕЛЫХ КРЫС
ПОСЛЕ ВЫСОКОКИНЕТИЧЕСКОГО МЕХАНИЧЕСКОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ
!ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава», г. Уфа 2Омский государственный аграрный университет
В эксперименте на беспородных белых половозрелых крысах с помощью гистологических, иммуногистохимических и стереометрических методов проведен анализ анатомо-гистологических изменений в перинекротической зоне кожи бедра в течении 15 суток после механического повреждения. Установлено, что в перинекротической зоне изменяются следующие показатели: толщина эпидермиса, объемная плотность коллагена, объемная плотность эпителия волосяных влагалищ, объемная плотность микрососудов, численная плотность фибробластов, угол наклона волос, численная плотность волос. Динамика этих изменений кожи определяется степенью отека ее тканей и активацией механизмов пролиферации клеток ведущих дифферонов.
Ключевые слова: кожа, механическое повреждение, объемная плотность.
A.Kh. Lanitcheva, Kh.Kh. Murzabaev, V.V. Semchenko, S.S. Stepanov ANATOMO - PHYSIOLOGICAL CHANGES OF SKIN LEG RATS AFTER MECHANICAL DAMAGE
In experiment of white rats by means of histological, immunohistochemical and stereometrical methods realizated analysis ana-tomo-histological altarations of skin legs after mechanical damage.
It has been shown that changes indices: thickness of epidermis. Volume compactness of collagen, volum compactness epithelium horsehair vaginas, volume compactness mikrovessels, numeral volume fibroblasts, numeral volume hair. Dynamics this changes of skin determine of activation mechanism proliferation cells.
Key words: skin, mechanical damager, volume compactness.
Структурно-функциональные механизмы заживления раны кожи после повреждающего механического воздействия хорошо изучены. По данным литературы, раневой процесс в коже рассматривается как реализация потенциально возможных адаптивных механизмов комплекса тканей организма в рамках взаимодействующей системы гистиона. Широко обсуждаемая концепция о гистионе позволяет по-новому оценить фазность течения раневого процесса с учетом взаимоотношения клеток различных дифферонов в гистионе и его последующей трансформации при заживлении раны [4, 6, 7, 8]. В этой связи возникает необходимость оценки влияния трансформаций гистиона на анатомо-физиологические изменения кожи в процессе заживления раны. Необходимо провести детальный морфометрический анализ анатомических компонентов поврежденной кожи в сочетании с оценкой пролиферативной и функциональной активности клеток различных дифферонов в динамике раневого процесса.
Целью настоящего исследования является оценка анатомо-физиологических изменений и пролиферативной активности клеток
кожи бедра белых крыс после высококинетического механического повреждения.
Материал и методы
Эксперимент проведен на 30 белых беспородных крысах обоего пола массой 180-200 г в соответствии с «Правилами работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977г № 755). Основную группу (п=25) составили животные, которым травму кожи бедра наносили с помощью специальной установки (падающий груз), моделирующей высококинетическое повреждение тканей [3]. Эксперимент проводили под эфирным наркозом. Фрагмент кожи (0,5х1,5 см) в зоне повреждения и вокруг нее для морфологического исследования забирали через 6 ч (п=5), 1 сутки (п=5), 3 (п=5), 7 (п=5) и 15 суток (п=5) после травмы. Животным давали наркоз и декапитировали. Контрольную группу составили интактные животные
(п=5).
Образцы кожи фиксировали в 10% растворе формалина на фосфатном буфере фирмы ООО «Биовитрум», Санкт- Петербург. Материал заливали в парафин по общеприня-
той методике [2]. Срезы толщиной 4-5 мкм делали на ротационном микротоме LaboCut 4055 (фирма Slee, Германия). Для микроскопии срезы окрашивали гематоксилином и эозином, методом Ван-Гизона, заключали в канадский бальзам. На этих препаратах оценивали анатомо-физиологические изменения поврежденной кожи [1].
Для определения пролиферативной активности клеток кожи, верификации эпителиальных клеток эпидермиса и волосяных влагалищ использовали иммуногистохимиче-ский метод с мечеными моноклональными антителами соответственно к белкам Ki-67 и Ск-14. Постановку иммуногистологического окрашивания осуществляли согласно рекомендациям фирмы-производителя. После де-парафинирования и регидратации срезов в трех сменах ксилола проводили демаскировку антигенов в микроволновой печи в цитратном буфере при pH 6,0. Для предотвращения фонового окрашивания инкубировали препарат в блоке эндогенной пероксидазы, промывали в Tris Buffered Salin при pH 7,6. Рабочие разведения антител - 1:200. Визуализацию результатов проводили с использованием системы детекции Ultra Vision ONE Detection System HRP Polymer. Инкубировали с рекомендованным хромогеном-DAV Plus Substrate System. Срезы докрашивали гематоксилином Майера и заключали в БиоМаунт-среду. Для оценки качества реакции использовали стекла с позитивным контролем для каждого из антигенов (фирма Labvision, США).
Микрофотосъемку гистологических препаратов проводили на микроскопах Axio Scope 40 (Carl Zeiss) и Axio Star (Carl Zeiss) с встроенным ТУ-адаптером и цифровой видеокамерой Carl Zeiss Imager, A1, окуляр W-PI 10x/23, объективы: Achroplan 20х/0,45, 40x/0,60, 63x/0,80 и 100x/1,25 oil. Морфометрический анализ проводили согласно общепринятым рекомендациям [1] с использованием программы ImageJ. На микрофотографиях (окраска гематоксилином и эозином и по Ван-Гизону) поперечных и тангенциальных срезов кожи бедра животных контрольной и основной групп (по 5 срезов с каждого животного) определяли толщину (мкм) эпидермиса, дермы, гиподермы, объемную плотность (%) коллагена, сальных желез, эпителия волосяных влагалищ, микрососудов, численную плотность фибробластов (на 1 мм2 плоскости среза дермы), а также измеряли угол наклона, расстояние между волосками (мкм) и характер распределения волос. На иммуногистохи-мических препаратах определяли численную
плотность Ю-67 позитивных клеток (индекс пролиферации) на 100 клеток данного типа и объемную плотность клеток, содержащих Ск-
14 (эпителиальные клетки эпидермиса и волосяных влагалищ).
Статистический анализ полученных результатов осуществляли с использованием программы 81ай8йса 6.0. Проверку статистических гипотез проводили с помощью непараметрических методов (критерий Манна-Уитни, Колмогорова-Смирнова, ANOVA
Краскела-Уоллиса), а для относительных величин - критерия Фишера двустороннего и вычисления 95% доверительного интервала
[5].
Результаты и обсуждение
В коже бедра интактных белых крыс эпидермис в среднем имеет равномерную толщину (ширина на поперечном срезе -12,6±1,6 мкм), представлен базальным слоем мелких эпителиоцитов, которые в некоторых участках черепицеобразно накладываются друг на друга, 2-3-мя рядами шиповатых эпи-телиоцитов, зернистыми клетками и расположенными над ними роговыми эпителиоцита-ми (рис. 1).
7.
- I—п- - .
Яма
Рис. 1. Поперечный срез кожи бедра интактной белой крысы, наружная и средняя часть дермы: Д - дерма, В - волосы, Э -эпидермис, стрелкой указаны сальные железы.
Окраска гематоксилином и эозином. Об. х20
Дерма занимает основную часть (ширина на поперечном срезе -585±125 мкм) кожи и без резкой границы переходит в подкожную жировую клетчатку. Сосочковый слой дермы сглажен, сосочки в нем располагаются редко. Субэпидермальная рыхлая соединительная ткань проникает в сетчатый слой дермы, окружая железы и волосяные фолликулы (рис. 1). В норме ведущим клеточным диффероном дермы является фибробластический (420±60 клеток на 1 мм2 плоскости поперечного среза). Коллагеновые волокна занимают 65,5±7,0%, а эластические - 3,1±1,5% дермы. Объемная плотность микрососудов в дерме составляет 1,5±0,5%.
Эпителиоциты в наружном волосяном влагалище контрольных животных расположены циркулярно (рис. 1). Наружное эпителиальное влагалище образовано 2-3-мя слоями клеток.
Волосы кожи расположены в гексагональном порядке на расстоянии 163,5±22,5 мкм друг от друга под углом 60-68 градусов (95% доверительный интервал средней). Волосяные луковицы находятся в подкожной жировой клетчатке. Между волосами и сальными железами кожи крыс существует тесная структурно-функциональная и пространственная взаимосвязь. Сальные железы имеют разветвленные концевые отделы, представленные одной - двумя дольками, занимающими 8,9±2,8% объема дермы. Глубже сетчатого слоя дермы расположена гиподерма (ширина на поперечном срезе 265±86 мкм). В ней присутствует большое количество адипоци-тов. Среди них находится заключенная в со-единительно-тканный футляр кожная мышца. Ведущей тканью в ней является поперечнополосатая мышечная ткань.
По данным иммуногистохимического исследования кожи бедра интактных белых крыс установлено, что степень пролифера-
тивной активности клеток базального слоя эпидермиса и клеток дермы низкая.
Дисперсионный анализ (ЛКОУЛ Крас-кела-Уоллиса) результатов гистологического и иммуногистохимического морфометрического исследований тканей дефекта кожи в перинекротической зоне показал, что в течение 15 суток наблюдения статистически значимо изменялись такие показатели, как толщина эпидермиса ^=4, п=125, Н=29,8,
/=0,001), объемная плотность коллагена ^=4, п=125, Н=15,8, /=0,03), объемная плотность эпителия волосяных влагалищ (df=4, п=125, Н=17,6, /=0,01), объемная плотность микрососудов ^=4, п=125, Н=19,8, />=0,01), численная плотность фибробластов (df=4, п=125, Н=14,6, /=0,04), угол наклона волос ^=4, п=125, Н=16,5, /=0,02), расстояние между волосками ^=4, п=125, Н=22,5, /=0,001), численная плотность волос и характер их распределения. Динамика изменений показателей, характеризующих анатомо-
физиологические состояние перинекротиче-ской зоны кожи, и парный сравнительный анализ с контролем и между сроками исследования показаны в нижеследующей таблице.
Таблица
Показатель Контроль Посттравматический период
6 ч 1 сут 3 сут 7 сут 15 сут
Толщина эпидермиса, мкм 14,6±1,6 16,6±3,5 25,3±6,2* 35,8±2,5**л 63,7±5,6***лл 31 7±4 4**ллл
Индекс пролиферации клеток базального слоя эпидермиса, %, ДИ 13,5-19,6 28,4-34,8* 32,5-42,4* 43,2-48,5*л 88,5-98,8*л 50,4-56,8*л
Толщина дермы, мкм 585±125 678±107* 699±114* 686±212* 614±105* 597±125Л
Толщина гиподермы, мкм 265±86 272±75 258±71 268±101 289±82 245±67
Объемная плотность коллагена, % 65,5±7,0 46,2±4,8* 42,7±6,2* 48,8±9,4* 78,8±7,0*лл 74,4±5,8*
Объемная плотность эластических волокон, % 3,1±1,5 2,2±0,6* 2,5±0,8* 3,3±1,2 3,6±0,9 3,0±1,7
Объемная плотность сальных желез, % 8,9±2,8 7,3±1,2* 7,1±0,9* 6,9±0,8* 7,2±0,7* 6,9±1,3*
Объемная плотность эпителия волосяных влагалищ, % 22,6±7,6 21,8±4,4 16,4±1,7*л 21,5±4,2*л 35,4±4,8**лл 28,8±6,2*л
Объемная плотность микрососудов, % 1,5±0,5 0,6±0,2* 0,5±0,4* 2,8±0,4*лл 3,4±0,4** 1,8±0,6Л
Численную плотность фибробластов, на 1 мм2 420±60 370±72* 330±50* 385±75Л 655±78**ллл 510±72*л
Угол наклона волос, градусы, ДИ 60-68 72-83* 74-86* 76-88* 50-110*л 30-120*
Расстояние между волосками, мкм 163±22 172±29 208±28**л 365±38**лл 314±22** 263±29*л
Характер распределения волос Г, С Г, С Г, С Г, А Г, А Г, А
Численная плотность волос, на 1 мм2 66,7±7,8 62,5±6,3 54,2±7,1*л 45,2±6,8*л 52,5±8,9*л 51,5±9,2*
* Различия статистически значимы в сравнении с контролем при /<0,05, ** при /<0,01 и *** - при /<0,001; Л - различия статистически значимы в сравнении с предыдущим сроком при /<0,05, лл _ ПрИ /<0,01 и ллл _ ПрИ /<0,001 (критерий Колмогорова-Смирнова и Манна-Уитни для парных сравнений независимых выборок. Г - гексагональное, С - симметричное сравнение, А -асимметричное сравнение, ДИ - доверительный интервал).
Найденные изменения объемной плотности через 6часов, 1 и 3 суток после травмы связаны с проявлениями отека перинекроти-ческой зоны, а в более отдаленном периоде (7,
15 суток) свой вклад в изменение пространственных отношений вносит активация процессов репаративной регенерации. Увеличивается количество клеток с высоким содержанием ядерного белка Ю-67 (см. таблицу), происходят гиперплазия и гипертрофия клеток эпидермиса, волосяных влагалищ, клеток фиб-
робластического дифферона, макрофагов и эндотелиальных клеток. Все это в совокупности приводит к найденным анатомическим изменениям кожи в зоне повреждения.
Через 7 суток после травмы прилежащий к краям раны эпителий гипертрофирован. Особенно наглядно это было видно на имму-ногистохимических препаратах (рис. 2). Толщина эпидермиса в среднем составляла 63,7±5,6 мкм (9-10 слоев клеток). На границе с раной край эпителиального пласта узким
напластований. Клетки эпителия были уплощены, с вытянутыми ядрами, а длинная ось ядра располагалась параллельно поверхности дефекта. Молодая соединительная ткань под эпителием (толщина 40-90 мкм) состояла из тонких волоконец и клеточных элементов с преобладанием фибробластов. В периферической области дефекта увеличивалось количество эластических волокон. Молодая соединительная ткань, заполняющая центральную часть дефекта, состояла из волокнистых структур, которые образовывали перекресты и имели вид сетки.
Таким образом, после высококинетического механического повреждения кожи бедра белой крысы в перинекротической зоне происходят значительная реактивная и компенсаторно-восстановительная реорганизации анатомических образований кожи. Изменяется соотношение толщины слоев кожи, объемных долей коллагена, эпителиальных клеток волосяных влагалищ, микрососудов. Кроме того, изменяется численная плотность волос и их пространственное распределение в коже. Динамика вышеназванных изменений кожи определяется, вероятно, степенью отека ее тканей и активацией механизмов пролиферации клеток ведущих дифферонов.
Сведения об авторах статьи:
Ланичева Альбина Хамитовна - аспирант кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии Башкирского государственного медицинского университета. Адрес: Уфа, 450000, Ленина, 3а. E-mail: albina19803003@yandex.ru
Мурзабаев Хасан Хамзович - заведующий кафедрой гистологии, эмбриологии и цитологии БГМУ, доктор медицинских наук, профессор. Адрес: Уфа, 450000, Ленина, 3а, телефон: (3472) 272-86-73;
Семченко Валерий Васильевич - профессор кафедры анатомии, гистологии и патологической анатомии ИВМ ФГОУ ВПО ОмГ АУ, доктор медицинских наук, профессор, руководитель гистологической лаборатории с электронной микроскопией ГНУ ВНИИБТЖ Россельхозакадемии. Тел. (3812) 23-95-96; E-mail: serg_stepanov@mail.ru
Степанов Сергей Степанович - Научн. сотр. лаборатории резистентности животных ИВМ ФГОУ ВПО ОмГАУ, доктор медицинских наук. Адрес: Омск, 644052, Омск, 2-я Челюскинцев, 118, Тел. (3812) 284-133, E-mail: serg stepanov@mail.ru
ЛИТЕРАТУРА
1. Автандилов, Г.Г. Введение в количественную патологическую морфологию. - М.: Медицина, 1980. - 216 с.
2. Микроскопическая техника: руководство / под ред. Д.С.Саркисова, Ю.Л.Перова. - М.: Медицина, 1996. - 544 с.
3. Мурзабаев, Х.Х. Способ дозированной передачи кинетической энергии снаряда повреждаемым тканям / Х.Х. Мурзабаев, И.Г. Кашапов // Морфология. - 2001. - Т. 120, № 6. - С. 83-84.
4. Одинцова, И.А. Закономерности процессов регенерационного гистогенеза в кожно-мышечной ране // Анатомия и военная медицина. - СПб.: ВМедА, 2003. - С. 41-43.
5. Реброва, О.Ю. Статистический анализ медицинских данных // Применение пакета прикладных программ STATISTICA / О.Ю. Реброва. - М.: МедиаСфера, 2002. - 305 с.
6. Чепурненко, М.Н. Морфологическая характеристика тканей кожи в регенерационном гистогенезе при механической травме в эксперименте: автореф. дис. ... канд. биол. наук. - СПб., 2007. - 17 с.
7. Hamamoto T., Yabuki A., Yamato O. et al. Immunohistochemical analysis of cyclooxygenase-2 induction during wound healing in dog skin // Res Vet Sci. - 2009. - V.87, N3. - P.349-354.
8. Nussbaum E.L., Mazzulli T., Pritzker K.P. et al. Effects of low intensity laser irradiation during healing of skin lesions in the rat // Lasers Surg Med. - 2009. - V.41, N5. - P.372-381.
клином входил на раневую поверхность. К этому сроку эпителий продвинулся на раневую поверхность на расстояние 0,4-0,5 мм. Под ним выявлялась молодая соединительная ткань.
Рис. 2. Поперечный срез кожи бедра белой крысы на 7-е сутки после травмы. Увеличенное количество клеточных слоев эпидермиса, изменение пространственной ориентации клеток эпидермиса и волосяных влагалищ, равномерное интенсивное цитоплазматическое окрашивание кератина в эпителиальных клетках. Д - дерма, Э - эпидермис, стрелками обозначены эпителиальные клетки волосяных влагалищ. Иммуногистохимиче-ский метод верификации белка Ск-14 с помощью меченых поликлональных кроличьих антител и докрашивание гематоксилином Майера. Об.х100.
Через 15 суток после травмы у всех животных поверхность дефекта была эпителизи-рована. Эпителий состоял из 4-6 слоев клеток (толщина около 20 мкм) и ороговевающих
