Структурно-функциональные изменения эпидермиса и дермы кожи белых крыс после высококинетического механического повреждения Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ВЕТЕРИНАРНЫЕ НА УКИ

УДК 616-001.4-001.5

М.Н. Гонохова, А.Х. Ланичева, С. С. Степанов, В.В. Семченко

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ЭПИДЕРМИСА И ДЕРМЫ КОЖИ БЕЛЫХ КРЫС ПОСЛЕ ВЫСОКОКИНЕТИЧЕСКОГО МЕХАНИЧЕСКОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ

В эксперименте на половозрелых беспородных белых крысах установлено, что после высококинетического механического повреждения кожи в перинекротической зоне происходит выраженная реактивная и компенсаторно-восстановительная реорганизация структурных образований кожи, в значительной степени обусловленная гетерохронной активацией механизмов пролиферации клеток ведущих дифферонов эпидермиса и дермы.

Ключевые слова: кожа, эпидермис, дерма, дифферон, механическое повреждение, структурно-функциональная реорганизация, репарация.

Введение

Структурно-функциональные механизмы заживления раны кожи после повреждающего механического воздействия хорошо изучены. Широко обсуждаемая концепция о гистионе позволяет по-новому оценить фазность течения раневого процесса с учетом взаимоотношения клеток различных дифферонов в гистионе и его последующей трансформации при заживлении раны [1, 2, 5, 4]. В этой связи возникает необходимость оценки влияния трансформаций гистиона на структурно-функциональные изменения кожи с применением морфомет-рического анализа в сочетании с оценкой пролиферативной и функциональной активности клеток различных дифферонов в динамике раневого процесса, что и послужило целью настоящего исследования.

Материал и методы исследования

Эксперимент проведен на 30 белых беспородных крысах обоего пола массой 180-200 г в соответствии с «Правилами работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 № 755). Основную группу (п = 25) составили животные, которым травму кожи бедра вызывали с помощью специальной установки (падающий груз), моделирующей высококинетическое повреждение тканей [5]. Эксперимент проводили под эфирным наркозом. Фрагмент кожи (0,5x1,5 см) в зоне повреждения и вокруг нее для морфологического исследования забирали через 6 ч (п = 5), 1 (п = 5), 3 (п = 5), 7 (п = 5) и 15 (п = 5) сут после травмы. Животных декапитировали под эфирным наркозом. Контрольную группу составили интактные животные (п = 5).

Образцы кожи фиксировали в 10%-ном растворе формалина на фосфатном буфере фирмы ООО «Биовитрум». Материал заливали в парафин по общепринятой методике [6]. Срезы толщиной 4-5 мкм делали на ротационном микротоме ЬаЬоСШ; 4055 (фирма 81ее,

© Гонохова М.Н., Ланичева А.Х., Степанов С.С., Семченко В.В., 2011

Германия). Для микроскопии срезы окрашивали гематоксилином и эозином, методом Ван-Гизон, заключали в канадский бальзам. На этих препаратах оценивали структурно-функциональные изменения поврежденной кожи [7].

Для определения пролиферативной активности клеток кожи, верификации эпителиальных клеток эпидермиса и волосяных влагалищ использовали иммуногистохимический метод с мечеными моноклональными антителами соответственно к белку Ki-67 и Ск-14 по методикам, рекомендованным фирмой - производителем.

Микрофотосъемку гистологических препаратов проводили на микроскопе Axio Scope 40 (Carl Zeiss) и Axio Star (Carl Zeiss) с встроенным ТУ-адаптером и цифровой видеокамерой Carl Zeiss Imager, A1, окуляр W-PI 10x/23, объективы: Achroplan 20х/0,45, 40x/0,60, 63x/0,80 и 100x/1,25 oil. Морфометрический анализ проводили согласно общепринятым рекомендациям [7] с использованием программы ImageJ. На микрофотографиях (окраска гематокиси-ном-эозином и по Ван-Гизону) поперечных и тангенциальных срезов кожи животных контрольной и основной групп (по 5 срезов с каждого животного) определяли толщину (мкм) эпидермиса, дермы, гиподермы, объемную плотность (%) коллагена, сальных желез, эпителия волосяных влагалищ, микрососудов, численную плотность фибробластов (на 1 мм2 плоскости среза дермы), а также измеряли угол наклона, расстояние между волосками (мкм) и характер распределения волос. На иммуногистохимических препаратах определяли численную плотность Ю-67 позитивных клеток (индекс пролиферации) на 100 клеток данного типа и объемную плотность клеток, содержащих Ск-14 (эпителиальные клетки эпидермиса и волосяных влагалищ).

Статистический анализ полученных результатов осуществляли с использованием программы Statistica 6.0. Проверку статистических гипотез проводили с помощью непараметрических методов (критерий Манна-Уитни, Колмогорова-Смирнова, ANOVA Краскела-Уоллиса), а для относительных величин - критерия Фишера двустороннего и вычисления 95% доверительного интервала [8].

Результаты исследования

В коже интактных белых крыс эпидермис в среднем имеет толщину (ширина на поперечном срезе - 12,6 ± 1,6 мкм), представлен базальным слоем мелких эпителиоцитов, которые в некоторых участках черепицеобразно накладываются друг на друга, 2-3 рядами шиповатых эпителиоцитов, зернистыми клетками и роговыми эпителиоцитами.

Дерма занимает основную часть (ширина на поперечном срезе - 585 ± 125 мкм) кожи и границы переходят в подкожную жировую клетчатку. Сосочковый слой дермы сглажен, сосочки в нем располагаются редко. Субэпидермальная рыхлая соединительная ткань проникает в сетчатый слой дермы, окружая железы и волосяные фолликулы. В норме ведущим клеточным диффероном дермы является фибробластический (420 ± 60 клеток/1 мм2). Коллагеновые волокна занимают 65,5 ± 7,0, а эластические - 3,1 ± 1,5, микрососуды - 1,5 ± 0,5% дермы.

Эпителиоциты в наружном волосяном влагалище контрольных животных расположены циркулярно 2-3 слоями клеток. Волосы кожи расположены в гексагональном порядке на расстоянии 163,5 ± 22,5 мкм друг от друга под углом 60-68 градусов (95% доверительный интервал средней). Волосяные луковицы находятся в подкожной жировой клетчатке. Сальные железы имеют разветвленные концевые отделы, представленные одной-двумя дольками, которые занимают 8,9 ± 2,8% объема дермы. Глубже сетчатого слоя дермы расположена гиподерма (ширина на поперечном срезе - 265 ± 86 мкм). В ней присутствует большое количество адипоцитов. По данным иммуногистохимического исследования кожи интактных крыс установлено, что степень пролиферативной активности клеток базального слоя эпидермиса и клеток дермы низкая.

Дисперсионный анализ (ANOVA Краскела-Уоллиса) результатов гистологического и иммуногистохимического морфометрического исследования тканей кожи в перинекротиче-ской зоне показал, что в течение 15 сут наблюдения статистически значимо изменялись та-

кие показатели, как толщина эпидермиса (df = 4, п = 125, Н = 29,8, р = 0,001), объемная плотность коллагена (df = 4, п = 125, Н = 15,8, р = 0,03), эпителия волосяных влагалищ (df = 4, п = 125, Н = 17,'6, р = 0,01), микрососудов (df = 4, п = 125, Н = 19,8, р = 0,01), численная плотность фибробластов (df = 4, п = 125, Н = 14,6, р = 0,04), угол наклона волос (df = 4, п = 125, Н = 16,5, р = 0,02), расстояние между волосками (df = 4, п = 125, Н = 22,5, р = 0,001), численная плотность волос и характер их распределения. Динамика изменений показателей, характеризующих структурно-функциональное состояние перинекротической зоны кожи и парный сравнительный анализ с контролем и между сроками исследования, показана в таблице.

Морфометрические показатели перинекротической зоны кожи бедра белых крыс

контрольной и основной группы

Показатель Контроль Посттравматический период

6ч 1 сут 3 сут 7 сут 15 сут

Толщина эпидермиса, мкм 14,6 ± 1,6 16,6 ±3,5 25,3 ± 6,2* 35,8 ± 2,5**л 63,7 ± 5,6***лл 31 7 ± 4 4**ллл

Индекс пролиферации

клеток базального слоя эпидермиса, %, ДИ 13,5-19,6 28,4-34,8* 32,5-42,4* 43,2-48,5*л 88,5-98,8*л 50,4-56,8*л

Толщина дермы, мкм 585 ±125 678 ±107* 699±114* 686 ±212* 614±105* 597 ±125л

Толщина гиподермы, мкм 265 ± 86 272 ± 75 258 ±71 268±101 289 ± 82 245 ± 67

Объемная плотность коллагена, % 65,5 ± 7,0 46,2 ± 4,8* 42,7 ± 6,2* 48,8 ±9,4* 78,8 ± 7,0*лл 74,4 ± 5,8*

Объемная плотность

эластических воло- 3,1 ± 1,5 2,2 ± 0,6* 2,5 ±0,8* 3,3 ± 1,2 3,6 ±0,9 3,0 ± 1,7

кон, %

Объемная плотность сальных желез, % 8,9 ±2,8 7,3 ± 1,2* 7,1 ±0,9* 6,9 ±0,8* 7,2 ± 0,7* 6,9 ± 1,3*

Объемная плотность

эпителия волосяных 22,6 ± 7,6 21,8 ±4,4 16,4 ± 1,7*л 21,5 ± 4,2*л 35,4 ± 4,8**лл 28,8 ± 6,2*л

влагалищ, %

Объемная плотность микрососудов, % 1,5 ±0,5 0,6 ±0,2* 0,5 ±0,4* 2,8 ± 0,4*лл 3,4 ± 0,4** 1,8 ± 0,6Л

Численная плотность

фибробластов, на 420 ± 60 370 ± 72* 330 ±50* 385 ± 75л 655 ± 78**ллл 510 ± 72*л

1 мм2

Угол наклона волос, градусы, ДИ 60-68 72-83* 74-86* 76-88* 50-110*л 30-120*

Расстояние между волосками, мкм 163 ± 22 172 ± 29 208 ± 28**л 365 ± 38**лл 314 ±22** 263 ± 29*л

Характер распределения волос Г, С Г, С Г, С Г, А Г, А Г, А

Численная плотность волос, на 1 мм2 66,7 ± 7,8 62,5 ± 6,3 54,2 ± 7,1*л 45,2 ± 6,8*л 52,5 ± 8,9*л 51,5 ±9,2*

Примечание. «*» - различия статистически значимы в сравнении с контролем при р < 0,05, «**» - при р < 0,01 и «***» - прир < 0,001; «л» - различия статистически значимы в сравнении с предыдущим сроком при р < 0,05, «ЛЛ» - при р< 0,01 и «ллл» - при р < 0,001 (критерий Колмогорова-Смирнова и Манна-Уитни для парных сравнений независимых выборок. Г - гексагональное, С - симметричное, А - асимметричное, ДИ - доверительный интервал.

Изменения объемной плотности через 6 ч, 1 и 3 сут после травмы связаны с отеком перинекротической зоны, а в более отдаленном периоде (7, 15 сут) - с активацией процессов репаративной регенерации. Увеличивается количество клеток с высоким содержанием ядерного белка Кл-67 (таблица), происходит гиперплазия и гипертрофия клеток эпидермиса, волосяных влагалищ, клеток фибробластического дифферона, макрофагов и эндотелиальных клеток.

Через 7 сут после травмы прилежащий краям раны эпителий гипертрофирован. Особенно наглядно это видно на иммуногистохимических препаратах. Толщина эпидермиса в среднем составляла 63,7 ± 5,6 мкм (9-10 слоев клеток). На границе с раной край эпителиального пласта узким клином входил на раневую поверхность. К этому сроку эпителий продвинулся на раневую поверхность на расстояние 0,4-0,5 мм. Под ним выявлялась молодая рыхлая соединительная ткань.

Через 15 сут после травмы у всех животных поверхность дефекта была эпителизирова-на. Эпителий состоял из 4-6 слоев клеток (толщина около 20 мкм) и ороговевающих напластований. Клетки эпителия уплощены, с вытянутыми ядрами, длинная ось ядра располагалась параллельно поверхности дефекта. Рыхлая соединительная ткань под эпителием (толщина 40-90 мкм) состояла из тонких волоконец и клеточных элементов с преобладанием фибробластов. В периферической области дефекта увеличивалось количество эластических волокон. Волокнистые структуры соединительной ткани, заполняющей центральную часть дефекта, имели вид сетки.

Таким образом, после высококинетического механического повреждения кожи бедра белой крысы в перинекротической зоне происходит выраженная реактивная и компенсаторно-восстановительная реорганизация структурных образований кожи. Изменяется соотношение толщины слоев кожи, объемных долей коллагеновых волокон, эпителиальных клеток волосяных влагалищ, микрососудов, численная плотность волос и их пространственное распределение, клеточный состав. Динамика выявленных изменений тканевых структур в значительной степени определяется гетерохронной активацией механизмов пролиферации клеток ведущих дифферонов эпидермиса и дермы.

Список литературы

1. Одинцова И.А. Закономерности процессов регенерационного гистогенеза в кожно-мышечной ране / И.А. Одинцова // Анатомия и военная медицина. - СПб. : ВМедА, 2003. - С. 41-43.

2. Чепурненко М.Н. Морфологическая характеристика тканей кожи в регенерационном гистогенезе при механической травме в эксперименте : автореф. дис. ... канд. биол. наук. - СПб., 2007. - 17 с.

3. Hamamoto Т., Yabuki A., Yamato О. et al. Immunohistochemical analysis of cyclooxygenase-2 induction during wound healing in dog skin // Res Vet Sci. - 2009. - V. 87, № 3. - P. 349-354.

4. Nussbaum E.L., Mazzulli Т., Pritzker K.P. et al. Effects of low intensity laser irradiation during healing of skin lesions in the rat // Lasers Surg Med. - 2009. - V. 41, № 5. - P. 372-381.

5. Мурзабаев X.X. Способ дозированной передачи кинетической энергии снаряда повреждаемым тканям / Х.Х. Мурзабаев, И.Г. Кашапов // Морфология. - 2001. - Т. 120, № 6. - С. 83-84.

6. Семченко В.В., Барашкова С.А., Ноздрин В.И., Артемьев В.Н. Гистологическая техника. - Омск : Омская областная типография, 2006. - 290 с.

7. Автандилов Г.Г. Введение в количественную патологическую морфологию / Г.Г. Автиндилов. - М. : Медицина, 1980. - 216 с.

8. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA / О.Ю. Реброва. - М. : МедиаСфера, 2002. - 305 с.

SUMMARY

M.N. Gonohova, А.Н. Lanicheva, S.S. Stepanov, V.V. Semchenko

Structurally functional changes of white rats skin epidermis and derma after

high kinetic mechanical damage

In experiment on mature not purebred white rats it is established, that after highkinetic mechanical damage of a skin in the perinekrotic zone there is an expressed jet and kompensatorno-regenerative reorganisation of structural formations of the skin, substantially caused geterohronic activation of mechanisms proliferation cages of leaders epidermis and dermis differones.

Key words: a skin, epidermis, derma, differon, mechanical damage, structurally functional reorganisation, reparation.

УДК 612.826.2+616.8-091.81 B.B. Семченко, С.С. Степанов

СИНАПТИЧЕСКАЯ ПЛАСТИЧНОСТЬ КАК ОСНОВА ПАТОЛОГИЧЕСКОЙ РЕОРГАНИЗАЦИИ МЕЖНЕЙРОННЫХ ОТНОШЕНИЙ В КОРЕ БОЛЬШОГО МОЗГА (экспериментальное исследование)

Проведено исследование синапсов сенсомоторной коры большого мозга белых крыс после острой ишемии и аудиогенного стрессового воздействия. Установлено, что хронический стресс после перенесенной острой ишемии головного мозга является фактором, способствующим развитию патологических нейронных систем в отдаленном постишемическом периоде. Для формирования патологической системы необходим длительный период действия хронического стресса - до появления устойчивых структурных изменений синаптоархитекто-ники.

Ключевые слова: кора большого мозга, синапсы, ишемия, хронический стресс, патологические системы головного мозга.

Введение

Синаптическая пластичность является составляющей нейропластичности, рассматривается как свойство синапсов реагировать на физиологические и патологические воздействия изменением эффективности транссинаптической передачи информации. Пластическая реорганизация синапсов обеспечивает адаптацию нейронов к изменениям информационного потока, проходящего через его афферентные входы, оптимизирует работу нейронных сетей и, как следствие, - возможность адаптации организма к среде обитания [1, 2, 3]. С позиций современных представлений о структурных механизмах синаптической пластичности [4, 5], ее роль как основы патологической реорганизации межнейронных отношений изучена недостаточно.

Цель настоящего исследования: выявить особенности структурно-функциональной перестройки синаптоархитектоники молекулярного слоя неокортекса белых крыс в качестве основы патологической реорганизации межнейронных отношений в мозге после острой ишемии и аудиогенного стрессового воздействия.

Объекты и методы

Эксперимент проведен с соблюдением принципов гуманного обращения с экспериментальными животными (приложение к приказу МЗ СССР от 1977) и в соответствии с рекомендациями Международного комитета по науке о лабораторных животных, поддержанных ВОЗ. Острая ишемия головного мозга моделировалась после внутрибрюшинного введения тиопентала-натрия в дозе 7,5 мг/кг. Выделялись обе общие сонные артерии и пережимались на 20 минут (основная группа, п = 40). Затем зажимы снимали, рану ушивали и обрабатывали раствором бриллиантовой зелени. У животных контрольной группы (п = 40) после доступа к сосудам клипирование не выполнялось (ложнооперированные). Основную (группа I, п = 40) и контрольную группы (II, п = 40) животных делили на подгруппы (1-1, 1-2 и II-1, II-2). Животные подгрупп 1-1 и II-1 два раза в неделю подвергались прерывистому аудиогенному воздействию (70-80 децибел) (по две минуты) в течение 3 месяцев. Животные подгрупп 1-2 и II-2 содержались в тех же условиях, но без аудиогенного стрессового воздействия.

Изучали межнейронные синапсы сенсомоторной коры (СМК) большого мозга половозрелых беспородных белых крыс [6] через 1, 3, 5 и 9 месяцев после начала эксперимента с

© Семченко В.В., Степанов С.С., 2011