CC BY
39
УДК 616-056.3-08:615.37
Р. А. ХАНФЕРЯН*, Е. А. САВЧЕНКО*, А. А. БАБАХИН**, С. М. АНДРЕЕВ**
ИММУНОГЕННОСТЬ И АЛЛЕРГЕННОСТЬ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ФОРМ АЛЛЕРГЕНОВ
* Кубанский государственный медицинский университет, кафедра клинической иммунологии, аллергологии и лабораторной диагностики ФПК и ППС, г. Краснодар,
** ГНЦ РФ Институт иммунологии Минздрава России, г. Москва,
В настоящее время проблема аплергизации населения является одной из важнейших проблем современной медицины, так как число аллергических заболеваний и осложнений постоянно растет. В связи с этим особую актуальность приобретают исследования, направленные на разработку методов специфического лечения аллергических заболеваний.
В течение ряда последних лет продолжались попытки усовершенствования аллергенспецифической иммунотерапии (АСИТ), в том числе путем химической модификации аллергенов, используемых для приготовления аллерговакцин (АВ). Необходимо, чтобы аллерген после модификации обладал двумя основными свойствами: максимально сниженной аллергенностью (неспособностью связывать специфический IgE за счет блокады В-клеточных эпитопов) и сохраненной имму-ногенностью (способностью реагировать с Т-клетками за счет неизменных Т-клеточных эпитопов) [10]. Это, в свою очередь, создает возможность активации аллер-генспецифичных Thl-клеточных клонов со сменой профиля интерлейкинов (с ТЬ|2-характерного на Thl-характерный) и последующим «переключением» В-клеток с продукцией аллергенспецифического IgE на продукцию аллергенспецифического IgG, что в конечном счете обеспечивает эффект гипосенсибилизации [4]. Неоднозначность результатов, полученных как в экспериментальных условиях, так и при ограниченных испытаниях в клинике некоторых АВ, приготовленных на основе химически модифицированных аллергенов, предполагает продолжение поиска подходящих вариантов химической модификации с целью создания препаратов, приемлемых для безопасной и эффективной АСИТ.
Задачей настоящего исследования было изучение in vivo и in vitro некоторых иммунологических свойств модифицированного сукцинилированием аллергена в отношении его пригодности для целей создания АВ.
Материалы и методы Приготовление химически модифицированного экстракта пыльцы амброзии
Экстракт пыльцы амброзии W1 готовили по стандартной методике с использованием раствора Кока. Для химической модификации W1 применялся метод сукцини-лирования (обработка янтарным ангидридом) с использованием различной степени модификации эпсилон-групп [1]. Янтарный ангидрид добавляли к 1-5%-ному раствору водно-солевого экстракта пыльцы амброзии при комнатной температуре до конечного соотношения их массы 1:1 при pH в пределах 8,5-9,0 (pH доводили 4N NaOH). После окончания реакции раствор модифицированного экстракта был диализирован против 0,06 натрий-фосфатного буфера pH 7,0, профильтрован через мембранные фильтры с размером пор 0,22 мкм (“Millipore”) и лиофилизиро-ван. Модифицированные эпсилон-группы определяли количественным TNBS-методом. Были получены образцы
сукцинилированного W1 (sW1) со степенями модификации в %-ном отношении: 56%, 79%, 85%, 91%, 95%. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АЛЛЕРГЕННОСТИ SW1 Определение гистамина после стимуляции базофилов крови специфическим аллергеном стекловолоконным методом Определение гистамина после стимуляции базо-филов крови специфическим аллергеном проводили с помощью стекловолоконного метода [9]. Гепарини-зированная кровь (5 мл) была получена от 12 пациентов с сенсибилизацией к W1, подтвержденной клинической симптоматикой, кожными пробами и ИФА. Данная гепаринизированная кровь в объеме 25 мкл помещалась в лунки 96-луночного плейта, на дне которого находился стекловолоконный матрикс и куда предварительно было добавлено по 25 мкл десятикратных разведений модифицированного sW1 или не-модифицированного W1 аллергена, приготовленного на PIPES-буфере. После инкубации плейтов в течение 1 ч при 370 и отмывки дистиллированной водой проводили последующую инкубацию в течение 30 мин при 370 с 0,4%-ным раствором SDS. По завершении инкубации и последующей отмывки дистиллированной водой в каждую лунку плейтов добавляли определенное количество раствора ортофталиевого диальдегида для конденсации гистамина, высвободившегося из базо-филов. Реакцию останавливали через 10 мин добавлением 0,59%-ного раствора хлорной кислоты (HClO4). Результаты, полученные путем спектрофлюорометри-ческого анализа и рассчитанные по специальной компьютерной программе, выражали в нанограммах на 1 мл (нг/мл) высвободившегося гистамина. Сравнение уровней высвободившегося гистамина под воздействием модифицированного (sW1) и немодифициро-ванного экстракта (W1) проводили с помощью метода определения площади под кривой (ППК).
Метод торможения ELISA Для торможения ELISA различные разведения модифицированного sW1 (с различной степенью модификации) и немодифицированного W1 экстракта аллергена инкубировали с сывороткой, полученной от 5 пациентов с сенсибилизацией к аллергену пыльцы амброзии, подтвержденной историей болезни, прик-тестами и наличием специфического IgE. После инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре уровень аллерген-специфического (анти-W^ IgE определялся по стандартной ELISA методике.
Получение трансгенных мышей и культура клеток in vitro Трансгенные мыши были получены в лаборатории Imunology Research Institute of New England, Fitchburg, MA, USA. Характеристика линии: животные экспрессируют гены HLA-DQ8(HLA-DQA1* 0301 или HLA-DQ6 (HLA-DQA1*0103 и HLA-DQB1* 0601) и дефицитны по эндогенным молекулам II класса MHC [2, 3, 7]. Экспрессия HLA-DQ и Н-2 молекул II класса на поверхности лим-
фоцитов периферической крови была проанализирована путем цитофлюориметрического анализа (FACS, Becton Dickinson Immunocytometry Systems, USA). Ни H-2Aab , ни H-2Ebb не были определены на HLA-DQ6 или HLA-DQ8 лимфоцитах периферической крови. Экспрессия гибридных молекулярных форм с H-2Aab и DQb цепями не была обнаружена у HLA-DQ8 или HLA-DQ6 мышей. Экспрессия HLA-DQ молекулы в H-2Aa0 мышах индуцировала селекцию CD4+ Vb TCR+ клеток и восстанавливала CD4+ Т-клеточную популяцию в периферической крови до обычного уровня 5,0-9,3% [2, 7]. Таким образом, H-2Ab0/HLA-DQ6 или H-2AP0/ HLA-DQ8 трансгенные мыши не экспрессируют молекулы мышиного II класса МНС, но экспрессируют молекулы человеческого HLA II класса.
Трансгенных мышей HLA-DQ6 и HLA-DQ8 иммунизировали подкожно в дозе 20 мкг экстракта W1 на мышь в смеси с полным адъювантом Фрейнда в основание хвоста и подушечки задних лап. Через 7 дней после иммунизации были выделены лимфоузлы и приготовлены культуры клеток [5, 8]. В культуру лимфоидных клеток in vitro добавляли как немодифицированный W1, так и сукцинилированный sW1 различной степени модификации, начиная с концентрации 1 мкг/мл.
Активацию лимфоцитов учитывали после добавления на заключительном этапе культивирования 3Н ти-мидина за 2 часа в дозе 1 мкг/мл. Результаты выражали в изменении Dcpm = (среднее значение cpm в триплетах, содержащих аллерген) - (среднее значение cpm в триплетах, содержащих среду.
Иммунизация животных и определение сывороточных антител
В эксперименте были использованы мыши (CBAxC57BL/6)F1 в возрасте 8-12 недель (в количестве 15 особей). Для определения иммуногенности образцов sW1 с различной степенью сукцинилирования (79%, 85% и 95% соответственно) мышей иммунизировали внутрибрюшинно 3 раза с интервалом 3 недели в объеме 0,5 мл и в дозе 10 мкг на мышь. На 12-й день первичной и через 1 и 3 недели после вторичной и третичной иммунизации получали кровь в объеме 200 мкл из ретроорбитального синуса каждой мыши. Полученную сыворотку до анализа хранили при -700 С.
Титры анти^1-аллергенспецифических IgE и IgG-антител в сыворотках, полученных от каждой группы мышей, определяли с помощью реакции пассивной
кожной анафилаксии (РПКА) и методом ELISA соответственно.
Определение аллергенности с помощью РПКА
РПКА для определения аллергенности модифицированного sW1 проводилась с поимощью метода, предложенного B. B. Levine, N. M. Vaz, 1970 [6]. Крыс Wistar сенсибилизировали внутрикожно в объеме 30 мкл несколькими разведениями мышиной сыворотки (начиная с 1:4), полученной путем многократной иммунизации мышей (CBAxC57BL/6) F1 немодифицированным аллергеном пыльцы амброзии (W1), содержащей высокие титры анти-WI-IgE. Через 2024 часа крысам внутривенно вводили либо модифицированный sW1 или немодифицированный W1 в дозе 100 мкг/ 100 г веса крысы с 0,5%-ным раствором Эванса. Реакцию учитывали через 30 мин и выражали в log2 реципрокных титрах последнего разведения сыворотки, которое еще давало окрашенное пятно диаметром не менее 5 мм.
Результаты исследований и обсуждение
Высвобождение гистамина (ВГ) из базофилов крови больных, сенсибилизированных кW1, при ее инкубации in vitro было существенно подавлено, при воздействии sW1 со степенью модификации 79% и выше в сравнении с воздействием немодифицированного аллергена W1 или модифицированного аллергена sW1 с модификацией 56%. То обстоятельство, что sW1 (56%) индуцировал высвобождение гистамина (ВГ) такое же, как и в контроле (W1), свидетельствует о том, что оставшихся немодифицированных IgE-связывающих эпитопов достаточно для индукции ВГ (рис. 1).
С помощью метода торможения ELISA показано, что способность sW1 связываться с анти^1 человеческим IgE достоверно снижена, когда степень модификации составляет 79% и выше (рис. 2).
Стимуляция in vitro культуры клеток лимфоузлов мышей HLA-DQ8 или HLA-DQ6 с W1 или sW1 (различной степени модификации) приводила к дозозависимому пролиферативному ответу. sW1 (56%, 79%, 85% и 91% модификацией) сохранял способность индуцировать in vitro Т-клеточный ответ, тогда как sW1 со степенью модификации 95% обладал слабым пролиферативным ответом, близким к контролю (рис. 3 и 4).
Иммунизация мышей (CBAxC57BL/6)F1 sW1 всеми тремя используемыми препаратами (со степенью модификации 79%, 91%, 95%) в целом приводит к снижению анти^1 IgE антителообразования в сравнении
Рис. 1. Высвобождение гистамина из базофилов крови пациентов, сенсибилизированных к пыльце амброзии, индуцированное SucW1 с различной степенью модификации: 1 - W1 (немодифицированный); 2 - SucW1 (56% модификации);
3 - SucW1 (79% модификации); 4 - SucW1 (85% модификации);
5 - SucW1 (91% модификации); 6 - SucW1 (95% модификации)
Примечание: * - p<0,05.
* 100 и ц
би 80
A
S
E
60
40
20
0
i
1 2 3 4 5 6
Рис. 2. ELISA ингибирование с SucWI с различной степенью модификации: 1 - W1 (немодифицированный); 2 - SucWI (56% модификации);
3 - SucWI (79% модификации); 4 - SucWI (85% модификации);
5 - SucWI (91% модификации); 6 - SucWI (95% модификации) Примечание: * - p<0,05.
HW1 (немодифицированный) ~SucW1 (56% модификации)-S-SucW1 (85% модификации) -ж- SucW1 (91% модификации)-
“SucW1 (79% модификации) -SucW1 (95% модификации)
Рис. 3. In vitro пролиферативный ответ клеток лимфатических узлов HLA-DQ-6 мышей к различным концентрациям W1 или SucWI:
1 - 200 mcg/ml; 2 - 100 mcg/ml; 3 - 50 mcg/ml;
4 - 20 mcg/ml; 5 - 5 mcg/ml; 6 - 1 mcg/ml Примечание: * - p<0,05
£
Cl
О
a
lt
el
D
_W1 (немодифицированный) I -SucW1 (85% модификации) —
■ SucW1 (56% модификации)” - SucW1 (91% модификации)-
“SucW1 (79% модификации) -SucW1 (95% модификации)
Рис. 4. In vitro пролиферативный ответ клеток лимфатических узлов HLA-DQ-8 мышей к различным концентрациям W1 или SucW1: 1 - 200 mcg/ml; 2 - 100 mcg/ml; 3 - 50 mcg/ml; 4 - 20 mcg/ml; 5 - 5 mcg/ml; 6 - 1 mcg/ml
1 2 3 4 5
^ W1 (немодифицированный) ^ SucWI (79% модификации) пш SucWI (85% модификации) ^ SucWI (95% модификации)
Рис. 5. Анти-W-I IgE-ответ у мышей (CBAxC57BI/6) F1 при иммунизации W1 или sW1 различной степени модификации:
1 - 12-й день первой иммунизации; 2 - 1-я неделя второй иммунизации;
3 - 3-я неделя второй иммунизации; 4 - 1-я неделя 3-й иммунизации 12
1 2 3 4 5
^ W1 (немодифицированный) SucWI (79% модификации) пш SucWI (85% модификации) ВЯ SucWI (95% модификации)
Рис. 6. Анти-WH IgG-ответ у мышей (CBAxC57BI/6) F1 при иммунизации W1 или sW1 различной степени модификации:
1 - 12-й день первой иммунизации; 2 - 1-я неделя второй иммунизации;
3 - 3-я неделя второй иммунизации; 4 - 1-я неделя третьей иммунизации;
5 - 3-я неделя третьей иммунизации
с контролем (иммунизация с немодифицированным W1), причем наиболее существенное понижение 1дЕ ответа наблюдается при использовании sW1 (85% и 95% модификации (рис. 5).
В отличие от анти^1-1дЕ-ответа динамика анти-W1-IgG-ответа несколько иная. После иммунизации с sW1 (79% и 89%) ^ ответ, оставаясь пониженным после вторичной иммунизации по сравнению с тем, что наблюдается при иммунизации немодифицирован-ным W1 аллергеном после третичной иммунизации, (особенно через три недели) достигает уровня немо-дифицированного W1. sW1 (95%) индуцирует слабый анти-W1-IgG-ответ после вторичной иммунизации, однако после третьей иммунизации (3-я неделя) уровень анти-W1-IgG сходен с тем, что наблюдается при иммунизации немодифицированным W1 (рис. 6).
Таким образом, приведенные данные в комплексе с другими доказательствами позволили продемонстрировать новый вариант снижения аллергенности аллергена при сохранении его иммуногенности. Понятно, что сниженная аллергенность позволит избежать нежелательных побочных эффектов АСИТ (местных и системных реак-
ций) и использовать лечебную форму модифицированного аллергена в значительно более высоких концентрациях, чем нативного аллергена, т. е. добиться более высоких поддерживающих и курсовых доз аллергена. Терапевтический эффект зависит от величины курсовой дозы.
Поступила12.10.2006 ЛИТЕРАТУРА
1. Андреев С. М., Сидорова М. В., Ракова О. А. и др. Синтез N-гидроксисукцинимид эфиров карбоксильных полимеров и органических кислот с помощью N-трифторацетосукцинимида // Биоорганическая химия. 1987. № 13. С. 696-702.
2. Bradley D. S., Nabozny G. H., Cheng S., Zhou P., Griffiths M. M., Luthra H. S., David C. S. HLA-DQB1 polymorphism determines incidence, oncet, and severity of collagen-induced arthritis (CIA) in transgenic mice: implications in human rheumatoid arthritis. J. Clin. Invest. 1997. Vol. 100. P. 2227.
3. Cheng S., Baisch J., Krco C., Savarirayan S., Hanson J., Hodgson K., Smart M., David C. Expression and function of HLA-Dq8 (DQA1 *0301/DQB1 *0302) genes in transgenic mice. Eur. J. Immunogenet., 1996. Vol. 23, P. 15-18.
4. Durham S. R., Ying S., Varney V. A. et al. // J.allergy. 1996. Vol. 97. P. 602-612.
5. Krco C. J., Beito T. G., david C. S. Determination of tolerance to self Ea peptides by clonal elimination of H-2E reactive T cells and antigen presentation by H-2Amolecules. Transplantation, Vol. 54. P. 920-992.
УДК 617.753.2-053.2:615.838
6. Levine B. B., Vaz N. M. Effect of combination of imbred strai, antigen, and antigen dose on immune responsiveness and regain production in the mouse // Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 1970. V. 39. P. 156-171.
7. Nabozny G. H., Baisch J. M., Cheng S., Cosgrove D., Griffiths M. M., Luthra H. S., David C. S. HLA-DQ8 transgenic mice are highly susceptible to collagen-induced arthritis: a novel model for human polyarthritis. J. Exp. Med., 1996. Vol. 183. № 27.
8. Neeno T., Krco C. J., Harders J., baisch J., Cheng S., David C. S. HLA-DQ8 transgenic micelacking endogenous class II molecules respond to house dust mite allergens; identification of antigenic epitopes. J. Immunol, 1996. Vol. 156. P. 3191.
9. Nolte H., Storm K., Schiotz P.O. Diagnostic value of a glass fiber-based histamine analysis for allergy testing in children //Allergy 1990. V. 45. P. 213-223.
10. Wheeler A. W., Drachenberg K. J. // Allergy. 1997. Vol. 52. P. 602-612.
R. A. KHANFERYAN, E. A. SAVCHENKO, A. A. BABAKHIN, S. M. ANDREEV
IMMUNOGENICITY AND ALLERGENICITY OF MODIFIED FORMS OF ALLERGENS
The aim of the study was to investigate immunological properties of ragweed allergen modified by succinilation. Taken together our results indicate that chemical modification of allergens by succinilation can reduce allergenicity while preserving immunogenicity and T-cell reactivity. These features allow to create of new allergovaccines which are potentially less likely to induce IgE-mediated adverse reactions while maintaining efficacy for allergen-specific vaccination.
Р. Р. ЧЕТЫЗ, А. И. ЕРЕМЕНКО
САНАТОРНОЕ СПЕЦИАЛИЗИРОВАННОЕ ЛЕЧЕНИЕ ДЕТЕЙ С ДЕФЕКТАМИ ОРГАНОВ ЗРЕНИЯ
Кафедра глазных болезней Кубанского государственного медицинского университета
Основой санаторно-курортного лечения является теория «медицинской географии», определенная в 1901 году И. П. Скворцовым. «Медицинская география» - это наука о воздействии природных условий как на патогенез различных заболеваний, так и на организм человека. Предметом «медицинской географии» является вся сумма природных условий различных мест земного шара и их воздействие на здоровье.
Основываясь на этом, проф. С. В. Очаповским применительно к ландшафту Северного Кавказа и особым климатическим условиям Кубани с побережьем Черного моря введено понятие «медицинское краеведение», представляющее собой сложную науку, включающую историю, географию, этнографию и элементы общественных наук. С. В. Очаповский на базе кафедры глазных болезней Кубанского медицинского института (ныне университета) создал «краеведческую офтальмологию», дающую возможность изучить влияние определенных климатических условий, в частности климата Кубани, на патогенез и методы излечения глазных заболеваний. С. В. Очаповский писал: «Глазные болезни возникают, развиваются и поддерживаются под влиянием и на почве всевозможных болезней организма. Все средства, которые оздоравливают и укрепляют наше тело, будут полезны и для глаза. В смысле профилактическом и лечебном. Среди этих средств видное место занимает климатотерапия.
В дальнейшем с расцветом климатотерапии в нашей стране появился ряд публикаций, посвященных разработке эффективных организационных форм профилактики зрительных расстройств методом восстановительного лечения.
Существует большое количество научно обоснованных методов лечения различной глазной патологии. Примером этого могут служить разработанные в 70-е годы НИИ им. Гельмгольца (г. Москва) ортопто-пле-оптическое и диплоптическое лечение, эффективные при амблиопии, спазме аккомодации, нистагме и других патология глаза, развивающихся в детском возрасте. Однако эти методы требуют применения частых и длительных курсов, и, более того, у большей части детей лечение может быть успешным только на фоне
общего оздоровления, проводимого в санаторном режиме.
Указанные обстоятельства диктуют необходимость организации помимо существующей офтальмологической сети специальных детских глазных учреждений санаторного типа, которые могли бы обеспечить активное, систематическое и длительное лечение детей. К сожалению, в настоящее время среди больных, получающих санаторно-курортное лечение, глазные заболевания представлены весьма незначительно [1].
Целью настоящего исследования явилась оценка эффективности лечения детей с различной глазной патологией в условиях глазного отделения санатория «Черноморец» г. Геленджика.
Материалы и методы исследования
Для выполнения поставленной цели нами было проведено комплексное обследование и лечение 64 детей с различной глазной патологией в возрасте от 4 до 18 лет из различных регионов Российской Федерации на базе глазного отделения санатория «Черноморец» г. Геленджика Краснодарского края в летний период 2004 года. Из них у 22 человек отмечалась миопия средней и высокой степени с амблиопи-ей I, II и III степени; у 10 - спазм аккомодации; у 2 -остаточные дегенеративные изменения после перенесенного хориоретинита, частичная атрофия зрительного нерва; у 2 - обскурационная амблиопия на фоне афакии; 2 были с врожденной высокой степенью ги-перметропии с амблиопией; 6 - с аккомодативным косоглазием на фоне врожденной начальной миопии;
2 имели сходящееся косоглазие на фоне слабой ги-перметропии; 6 - расходящееся аккомодационное косоглазие, миопию с амблиопией; 3 - были с частичной атрофией зрительных нервов на фоне врожденной перинатальной патологии; 3 имели сходящееся аккомодационное косоглазие с гиперметропией высокой степени; 3 - нистагм с амблиопией, миопией и гиперметропией.
У 96% детей имелась различная экстраокулярная патология: 22 человека имели заболевания центральной нервной системы (недостаточное кровообращение
