CC BY
14
ORIGINAL RESEARCH
НАУЧНАЯ СТАТЬЯ
DOI: https://doi.oig/10.36233/0507-4088-91 © КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2022
Иммуноферментная идентификация escape-мутантов S143L и G145R вируса гепатита B (Hepadnaviridae: Orthohepadnavirus: Hepatitis B virus)
Коноплева М.В.1, Фельдшерова А.А.1, Эльгорт Д.А.1, Туполева Т.А.2, Кохановская Н.А.1, Панкратова В.Н.1, Семененко Т.А.1, Суслов А.П.1
1ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, 123098, Москва, Россия;
2ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Минздрава России, 125167, Москва, Россия
Введение. Достижение цели Всемирной организации здравоохранения по ликвидации вирусного гепатита В к 2030 г. представляется проблематичным, отчасти из-за наличия мутантов ускользания (англ. escape) у возбудителя этого заболевания, вируса гепатита В (ВГВ) (Hepadnaviridae: Orthohepadnavirus: Hepatitis B virus), распространяющихся преимущественно в группах риска. Специфической рутинной диагностики, направленной на идентификацию escape-мутантов, не существует.
Цель исследования - оценка метода серологического портретирования, адаптированного для рутинного выявления escape-мутаций в 143 и 145 аминокислотных остатках (а.о.) поверхностного антигена (HBsAg) ВГВ.
Материал и методы. ДНК ВГВ из 56 образцов HBsAg-положительных сывороток крови, полученных от доноров, хронических носителей HBsAg, а также страдающих злокачественными заболеваниями крови лиц, секвенировали. После выявления мутаций в HBsAg образцы тестировали в иммуноферментной тест-системе «Гепастрип-мутант-ЗК».
Результаты и обсуждение. Escape-мутации выявлялись преимущественно у больных со злокачественными заболеваниями крови: замены в 143 и 145 а.о. обнаружены в 10,81 и 8,11% случаев соответственно. С помощью иммуноферментного анализа мутация G145R распознана почти во всех случаях. Тест-система специфично распознавала замену S143L в отличие от варианта S143T. Присутствие соседней мутации D144E может предполагаться благодаря ее особому серологическому портрету.
Заключение. Иммуноферментная детекция escape-мутаций S143L, D144E и G145R может применяться для рутинной диагностики, особенно в группах риска. Диагностические параметры тест-системы могут быть уточнены при дополнительных исследованиях. Данная иммуноферментная тест-система и методика применимы для разработки и контроля качества вакцин против escape-мутантов.
Ключевые слова: вирус гепатита В (ВГВ); вирусный гепатит B; ускользание; мутант; HBsAg; G145R;
S143L; S-ген; иммуноферментный анализ (ИФА); моноклональное антитело (АТ); секвенирование нового поколения (NGS); онкогематология; злокачественные заболевания крови; серологический портрет Для цитирования: Коноплева М.В., Фельдшерова А.А., Эльгорт Д.А., Туполева Т.А., Кохановская Н.А., Панкратова В.Н., Семененко Т.А., Суслов А.П. Иммуноферментная идентификация escape-мутантов S143L и G145R вируса гепатита B (Hepadnaviridae: Orthohepadnavirus: Hepatitis B virus). Вопросы вирусологии. 2022; 67(1): 48-58. DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-91
Для корреспонденции: Коноплева Мария Вениаминовна, канд. биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории медиаторов и эффекторов иммунитета отдела иммунологии, ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, 123098, Москва, Россия. E-mail: maria-konopleva@rambler.ru
Участие авторов: Коноплева М.В. - концепция и дизайн исследования, анализ и интерпретация данных, подготовка текста, администрирование проекта; Фельдшерова А.А. - методология исследования, проведение экспериментов; Эльгорт Д.А. - проведение экспериментов, анализ данных; Туполева Т.А. - администрирование проекта, сбор образцов; Кохановская Н.А. - сбор и обработка образцов, проведение экспериментов; Панкратова В.Н. -сбор и обработка образцов, проведение экспериментов; Семененко Т.А. - рецензирование и редактирование статьи; Суслов А.П. - общее руководство, обеспечение финансирования. Финансирование: Исследование выполнено за счёт государственного бюджета. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Этическое утверждение. Исследование проводилось при информированном согласии пациентов. Протокол исследования одобрен локальным Этическим комитетом при ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Минздрава России (Протокол № 104 от 28.01.2015).
Поступила 18.11.2021 Принята в печать 02.02.2022 Опубликована 28.02.2022
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ORIGINAL ARTICLE
DOI: https://doi.oig/10.36233/0507-4088-91
Identification by enzyme immunoassay of escape mutants S143L and G145R of hepatitis B virus (Hepadnaviridae: Orthohepadnavirus: Hepatitis B virus)
Maria V. Konopleva1, Asya A. Feldsherova1, Dina A. Elgort1, Tatiana A. Tupoleva2,
Nataliya A. Kokhanovskaya1, Valentina N. Pankratova1, Tatiana A. Semenenko1, Anatoly P. Suslov1
1FSBI «National Research Centre for Epidemiology and Microbiology named after honorary academician N.F. Gamaleya» of the Ministry of Health of Russia, 123098, Moscow, Russia;
2FSBI «National Medical Research Center for Hematology» of the Ministry of Health of Russia, 125167, Moscow, Russia
Introduction. The achievement of the goal of the World Health Organization to eliminate viral hepatitis B by 2030 seems to be problematic partly due to the presence of escape mutants of its etiological agent, hepatitis B virus (HBV) (Hepadnaviridae: Orthohepadnavirus: Hepatitis B virus), that are spreading mainly in the risk groups. Specific routine diagnostic assays aimed at identification of HBV escape mutants do not exist.
The study aimed the evaluation of the serological fingerprinting method adapted for routine detection of escape mutations in 143 and 145 aa positions of HBV surface antigen (HBsAg).
Material and methods. HBV DNA from 56 samples of HBsAg-positive blood sera obtained from donors, chronic HBsAg carriers and oncohematology patients has been sequenced. After the identification of mutations in HBsAg, the samples were tested in the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit «Hepastrip-mutant-3K». Results and discussion. Escape mutations were detected mainly in patients with hematologic malignancies. Substitutions in 143 and 145 aa were found in 10.81% and in 8.11% of such patients, respectively. The G145R mutation was recognized using ELISA kit in almost all cases. The kit specifically recognized the S143L substitution in contrast to the S143T variant. The presence of neighbor mutation D144E can be assumed due to it special serological fingerprint. Conclusion. ELISA-based detection of escape mutations S143L, D144E and G145R can be used for routine diagnostics, especially in the risk groups. The diagnostic parameters of the kit can be refined in additional studies. This immunoassay and methodology are applicable for the development and quality control of vaccines against escape mutants.
Key words: hepatitis B virus (HBV); viral hepatitis B; escape; mutant; HBsAg; G145R; S143L; S gene; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA); monoclonal antibody (AB); next generation sequencing (NGS); oncohematology; hematologic malignancies; serological fingerprint
For citation: Konopleva M.V., Feldsherova A.A., Elgort D.A., Tupoleva T.A., Kokhanovskaya N.A., Pankratova V.N., Semenenko T.A., Suslov A.P. Identification by enzyme immunoassay of escape mutants S143L and G145R of hepatitis B virus (Hepadnaviridae: Orthohepadnavirus: Hepatitis B virus). Problems of Virology (Voprosy Viruso-logii). 2022; 67(1): 48-58. DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-91
For correspondence: Maria V. Konopleva, Ph.D (Biol.), Senior Researcher of the Immunity Mediators and Effectors Laboratory, Immunology Department, FSBI «National Research Centre for Epidemiology and Microbiology named after honorary academician N.F. Gamaleya» of the Ministry of Health of Russia, 123098, Moscow, Russia. E-mail: maria-konopleva@rambler.ru Information about the authors: Konopleva M.V., https://orcid.org/0000-0002-9724-695X Feldsherova A.A., https://orcid.org/0000-0001-7216-4301 Elgort D.A., https://orcid.org/0000-0002-2197-4184 Tupoleva T.A., https://orcid.org/0000-0003-4668-9379 Kokhanovskaya N.A., https://orcid.org/0000-0001-5142-846X Pankratova V.N., https://orcid.org/0000-0003-4427-1809 Semenenko T.A., https://orcid.org/0000-0002-6686-9011 Suslov A.P., https://orcid.org/0000-0001-5731-3284
Contribution: Konopleva M.V. - study concept and design, data analysis and interpretation, original draft preparation, project administration; Feldsherova A.A. - study methodology, investigation; Elgort D.A. - investigation, data analysis; Tupoleva T.A. - project administration, specimens collection; Kokhanovskaya N.A. - specimens collection and processing, investigation; Pankratova V.N. - specimens collection and processing, investigation; Semenenko T.A. - review and editing of the article; Suslov A.P. - supervision, funding acquisition. Funding. The research was funded by the State budget. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Ethics approval. The study was conducted with the informed consent of the patients. The research protocol was approved by the Local Ethics Committee of the FSBI «National Medical Research Center for Hematology» of the Ministry of Health of Russia (Protocol No. 104 dated January 28, 2015).
Received 19 November 2021 Accepted 02 February 2022 Published 28 February 2022
ORIGINAL RESEARCH
Введение
Среди множества заболеваний, вызываемых вирусами у человека, лишь немногие обладают столь глобальной общественной значимостью, как вирусный гепатит В. Вирусом гепатита В (Hepadnaviridae: Orthohepadnavirus: Hepatitis B virus) (ВГВ) инфицирована примерно У населения планеты, при этом хроническая форма инфекции зарегистрирована не менее чем у 360 млн человек. Из-за клинических осложнений болезни, таких как цирроз печени и гепатоцел-люлярная карцинома, в мире происходит около 1 млн смертей в год [1]. В 2016 г. 69-я Всемирная ассамблея здравоохранения одобрила Глобальную стратегию сектора здравоохранения по вирусному гепатиту, целью которой определена ликвидация инфекционного гепатита как угрозы общественному здоровью к 2030 г. Установлены следующие рекомендуемые целевые показатели: снижение распространённости ВГВ среди детей в возрасте 1 года до <0,1%; снижение смертности от гепатита В до <5 на 100 тыс. населения; ежегодное снижение числа новых случаев коинфекции ВГВ и вируса гепатита С (Flaviviridae: Hepacivirus: Hepatitis С virus) [2].
Тем не менее распространение ВГВ продолжается, несмотря на проводимую во многих странах широкомасштабную вакцинацию против гепатита В, а также осуществление других противоэпидемических мероприятий. Такая ситуация во многом обусловлена разнообразными механизмами, сформировавшимися в ходе эволюции вируса и способствующими его выживанию в условиях иммунологического прессинга [3]. Существенное значение в этом отношении имеет возникновение мутантов диагностического, иммунологического и вакцинального ускользания (англ. escape) (escape-мутантов), которые выявляются во всём мире [4]. Вакцины, созданные на основе поверхностного антигена (HBsAg) вируса дикого типа, защищают не от всех escape-мутантов [5].
Процесс распространения подобных мутантов, по-видимому, происходит неравномерно, что зависит, прежде всего, от генотипа возбудителя [4, 6]. Кроме того, escape-мутации преимущественно накапливаются у лиц определённых категорий, то есть в особых группах риска. В частности, наибольшая встречаемость мутантов продемонстрирована у онкогематоло-гических больных [7, 8], вакцинированных детей [7], а также у получивших иммунопрофилактику детей, рождённых от матерей - носителей вируса [10].
Проникновение escape-мутантов в популяции (в т.ч. охарактеризованные выше) напрямую связано также с ошибками обнаружения этих видоизменённых вариантов вируса [11]. Аналитическая чувствительность тестирования на HBsAg зависит от генотипа или субтипа ВГВ, но в случае escape-мутаций ситуация гораздо более сложная и неоднозначная. Исследования показали, что мутации в 5"-гене ВГВ, расположенные вблизи а-детерминанты HBsAg или в регуляторных элементах, могут существенным образом влиять на антигенные профили HBsAg, при-
водя иногда к полному нарушению распознавания последнего моноклональными антителами (АТ) диагностических тест-систем [11, 12]. Даже наиболее чувствительная на сегодняшний день количественная хемилюминесцентная тест-система «Lumipulse HBsAg-HQ» (Fujirebio Inc., Япония), которая имеет по отношению к ВГВ дикого типа диагностическую чувствительность 0,005 МЕ/мл (с нижним порогом детекции ~0,0011 МЕ/мл), обеспечивает существенно худшее качество выявления рекомбинантных HBsAg с escape-мутациями по сравнению с диким типом этого антигена [12]. В то же время в целях адекватной оценки чувствительности подобных тест-систем в отношении escape-мутантов желательно использовать сывороточные панели с природными мутантами, так как серологический портрет мутантного HBsAg естественного происхождения может не совпадать с таковым его рекомбинантного варианта [13]. Помимо этого, возможно снижение чувствительности диагностической тест-системы на фоне присутствия множественных escape-мутаций в HBsAg. В итоге недостаточно тщательная оценка способности тест-системы к обнаружению escape-мутантов может иметь результатом их недовыявление.
В настоящее время не существует рутинных диагностических тестов для определения мутантов подобного рода. Наиболее эффективным и надёжным способом является секвенирование нового поколения (next generation sequencing, NGS) [7], однако на сегодняшний день это достаточно трудоёмкая и дорогая методика. Разрабатывались решения на основе методов полимеразной цепной реакции (polymerase chain reaction, PCR) и гэп-ли-газной цепной реакции (gap ligase chain reaction, g-LCR), например для детекции escape-мутантов D144A [14] и G145R [15, 16]. Кроме того, известны попытки применения ПЦР предельного разведения (limiting dilution cloning PCR, LDC-PCR) в сочетании с секвенированием для выявления escape-мутаций в 120, 126, 128, 133, 141-145 а.о. [17, 18]. Были также разработаны микрочипы для ДНК-идентификации генотипов ВГВ и выявления важных мутаций в генах S, Pol, Core и X [19]. Однако все эти исследования не привели к разработке полноценных диагностических тест-систем. Ранее мы предлагали алгоритм серологического поиска мутаций в 143 и 145 а.о. HBsAg в сыворотке крови (S-HBsAg), основанный на серологическом портре-тировании — иммуноферментном выявлении дефектов взаимодействия данного антигена с монокло-нальными анти-HBsAg АТ по критерию падения чувствительности иммуноферментного анализа (ИФА) в >10 раз при серийных 10-кратных разведениях сывороток [20]. Однако этот вариант оказался довольно трудоёмким, поскольку предполагал использование 11 моноклональных конъюгатов.
Целью данной работы стала оценка чувствительности и специфичности метода серологического пор-третирования, адаптированного для рутинного выявления escape-мутаций в 143 и 145 а.о. S-HBsAg.
ВОПРОСЫ ВИРУСОЛОГИИ. 2022; 67(1)
https://doi.org/10.36233/0507-4088-91 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материал и методы
Образцы. Исследование проводили на 56 образцах сывороток крови, которые были получены от пациентов различных стационаров и донорских пунктов Российской Федерации. На основании данных анамнеза или источника получения образцов пациентов разделили на следующие группы: доноры (п = 11), хронические носители HBsAg (группа «Носители») (п = 8) и страдающие злокачественными заболеваниями крови (группа «Онкогематология») (п = 37).
Образцы сывороток исследовали на наличие серологических маркёров возбудителя гепатита В (HBsAg, АТ анти-HBs, антиген инфекционности HBeAg, ан-ти-НВе IgG, анти-НВс ^М + IgG). Кроме того, в пробах определяли уровень вирусной нагрузки ВГВ. Анализ escape-мутаций в положениях 143 и 145 а.о. проводили методами NGS и ИФА посредством имму-ноферментной тест-системы «Гепастрип-мутант-ЗК». Сыворотки проверяли также на АТ к вирусам гепатитов С и D.
Диагностические наборы. Исследование сывороток крови на наличие HBsAg проводили с использованием иммуноферментной тест-системы «Гепастрип В» (ООО «Ниармедик Плюс», Россия). Для ряда образцов определяли количество HBsAg, используя отраслевой стандарт (ОСО) HBsAg 42-28-311-00 (ООО «НПО «Диагностические системы», Россия). Тестирование на другие маркёры инфицирования ВГВ, а также на наличие суммарных антител к вирусам гепатитов С и D выполняли методом ИФА с использованием тест-систем производства ЗАО «Вектор-Бест» (Россия): «ВектоHBe-IgG» (кат. № D-0578), «Векто-НВе антиген» (кат. № D-0576), «Векто-НВс антитела» (кат. № D-0566), «Векто-HBsAg антитела» (кат. № D-0562), «Бест анти-ВГС» (комплект 3) (кат. № D-0773) и «Вектогеп D-антитела» (кат. № D-0954). ИФА проводили в соответствии с прилагаемыми инструкциями производителя.
Выделение и количественное определение ДНК ВГВ осуществляли методом ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) с помощью набора реагентов «РеалБест ДНК ВГВ» (количественный вариант) (кат. № D-0599, ЗАО «Вектор-Бест», Россия) также согласно инструкции производителя.
Моноклональные конъюгаты. Моноклональные мышиные АТ к HBsAg (1^3, Н2), а также их конъ-югаты с пероксидазой хрена, приготовленные по методу Р. Т^еп и соавт. [21], получены в лаборатории медиаторов и эффекторов иммунитета ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» (НИЦЭМ) Минздрава России. Кроме того, использовали коммерчески доступный конъюгат NF5 (ООО «Сорбент», Россия).
Полногеномное глубокое секвенирование изоля-тов вируса гепатита В. Полногеномное исследование методом NGS проводили для всех 56 изолятов. С целью амплификации образцов ДНК использовали праймеры, расположенные в консервативных участ-
ках генома, с учётом перекрытия амплифицируемых локусов. Каждую реакцию амплификации осуществляли отдельно. В реакции использовали следующие праймеры [22, 23]:
- пара 1: 1-TCACCATATTCTTGGGAACAAGA,
- 2-CGAACCACTGAACAAATGGC;
- пара 2: 1-GCCATTTGTTCAGTGGTTCG,
- 2-TGGGCGTTCACGGTGGT;
- пара 3: 1-ACCACCGTGAACGCCCA,
- 2-TCTTGTTCCCAAGAATATGGTGA.
Длина первого ПЦР-продукта составила 1103 п.н., второго - 946 и третьего - 1226 п.н. После амплификации выполняли агарозный гель-электрофорез полученных ПЦР-продуктов. В полученных ампликонах измеряли концентрацию ДНК с помощью флуориме-тра Qubit 2.0 (Invitrogen, США). Далее все 3 продукта амплификации смешивали эквимолярно в одном образце с последующим определением содержания нуклеиновой кислоты в суммированных амплифици-рованных образцах также при помощи флуориметра Qubit 2. Концентрация ДНК в образцах нормировалась до 15 нг/мкл. Для приготовления индексированных библиотек в реакцию брали по 100 нг каждого образца; библиотеки были приготовлены в соответствии со стандартным протоколом производителя.
Секвенирование NGS проводили на платформе Ion PMG (Life Technologies, США) с использованием чипов типа 316 по стандартному протоколу. Каждый чип вмещал 16 подготовленных индексированных геномных библиотек при теоретической расчётной ёмкости от 300 М до 1 G, т.е. от 300 млн до 1 млрд нуклеотидов. За расчётную величину брали практическую ёмкость в 500 M исходя из длины генома ВГВ, равной ~3200 п.н. Расчётная глубина секвенирования при одновременном исследовании 16 индексированных геномных библиотек составляла ~9700 прочтений на образец. Результаты секвенирования показали, что средняя глубина прочтения разных образцов составила ~1000-10 000.
Выравнивание нуклеотидных последовательностей S-гена и сравнительный анализ первичной нуклео-тидной последовательности выполняли при помощи программы Vector NTI 9.0 (ThermoFisher Scientific Inc. (Invitrogen), США). В качестве референсных данных использовали последовательности геномов ВГВ (генотипы А-Н), полученные из базы GenBank. Определение генотипов, субтипов и мутаций ВГВ проводили с учётом данных опубликованных ранее работ [11, 25, 26]. Для выравнивания последовательностей применяли также следующие референсы из GenBank: JX096956 (Latvia, субгенотип D2) и X98077, субтип adw [27]. В данной статье приведён анализ относительно части гена S, соответствующей S-HBsAg ВГВ.
Оценка escape-мутантовHBsAg с помощью адаптированной методики серологического портретирования с ИФА набором «Гепастрип-мутант-3К». Методика, реализованная в виде иммуноферментного набора «Ге-пастрип-мутант-3К», основана на данных работы А.И. Баженова и соавт. [20]. Это «сэндвич»-вариант ИФА, разработанный для поиска мутантов НВsAg в позитив-
ных по данному маркёру образцах, отобранных при скрининговом исследовании человеческих сывороток посредством любой универсальной тест-системы. В ходе анализа поликлональные анти-HBs АТ, сорбированные на поверхности лунок планшетов, связывают HBsAg в сыворотке или плазме крови человека, а образовавшийся комплекс антиген-антитело обнаруживается с помощью пероксидазных конъюгатов мышиных моноклональных АТ по цветной реакции с хромогеном. При этом используются 3 конъюгата, обладающих различной специфичностью в отношении к HBsAg дикого и мутантного типов. Конъюгат 11F3 практически не выявляет варианты HBsAg, несущие мутации S143L и G145R, в то время как конъюгат Н2 выявляет как HBsAg дикого типа, так и названные варианты. Третий конъюгат (NF5) реагирует с мутантом в области 143 (но не 145) а.о.
Для каждой исследуемой HBsAg-содержащей сыворотки готовили серию 10-кратных разведений (от 1/10 до 1/1 000 000) в буфере, включающем 125 мМ HEPES ((4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоно-вую кислоту)), 438 мМ сахарозу, 192 мМ хлорид натрия, 1,25% (v/v) казеин, 3,3 мМ _р-гидроксифенил-ук-сусную кислоту, 5% (w/v) BSA (bovine serum albumin; бычий сывороточный альбумин, БСА), 1% (w/v) человеческий у-глобулин, 12,2 мкМ метиловый оранжевый, 1,95 мкМ бромфеноловый красный, 0,1% (v/v) ProClin-300, 10% (w/v) мертиолят, 21,6 мкМ амфоте-рицин В, 0,01% (v/v) гентамицин и 1% (v/v) Твин-20. Каждое разведение сыворотки тестировали с конъю-гатами в 4 дублях. Способность конъюгатов выявлять HBsAg в образцах сывороток оценивали относительно HBsAg дикого типа («ИмБио»; АО «НПО «Микро-ген», Россия), взятого в концентрации 2 мкг/мл.
Рабочие растворы конъюгатов 11F3 (0,8-1,0 мкг/мл), H2 (2 мкг /мл) и NF5 (2 мкг/мл) готовили в буфере, содержащем 0,01 М ЭДТА (этилендиаминтетрааце-тат), 0,5% (w/o) сухое молоко, 12,5% (v/v) FBS (fetal bovine serum, фетальная бычья сыворотка) (инактиви-рованную 30 мин при 56 °С), 12,5% (v/v) нормальную кроличью сыворотку (инактивированную аналогичным образом), 0,05% (w/o) сапонин, 0,0125% (v/v) Triton Х-405, 0,00625% (v/v) Твин-80, 15 мМ калий йодид, 0,1% (v/v) n-пропил-галлат, 0,15 M хлорид натрия, 0,5 M мочевину, 0,005% (w/o) бромкрезоло-вый пурпурный, 0,35% (w/o) тиоцианат калия, 0,1% (w/v) Цвиттергент, 10 % (w/v) мертиолят (орто-этилр-тутьтиосалицилат натрия), 21,6 мкM амфотерицин В, 0,01% (v/v) гентамицин в растворе Версена.
Для постановки реакции в лунки планшета из тест-системы «Гепастрип В» с иммобилизованными козьими поликлональными АТ анти-HBs вносили по 50 мкл рабочего раствора конъюгата 11F3, H2 или NF5. Каждый из них тестировали по отдельности со всеми разведениями сыворотки (либо с контрольным антигеном дикого типа). После этого в контрольные лунки планшета добавляли по 100 мкл HBsAg дикого типа или буфер, использующийся для разведения сывороток (отрицательный контроль), а в оставшиеся лунки вносили разведения тестируемых сыворо-
ток. Планшет инкубировали во влажной камере при температуре +37 °С на протяжении 2 ч, после чего отмывали 8 раз раствором PBST (Phosphate Buffered Saline Tween 20) (0,15 M хлорид натрия, 2,67 мМ натрия гидрофосфат дигидрат, 0,01% азид натрия, 0,1% (v/v) Твин-20; pH 7,2-7,5). Затем во все лунки вносили 100 мкл свежеприготовленного по стандартной методике раствора 3,3',5,5'-тетраметилбензидина гидрохлорида (ТМБ) в субстратном буфере, содержащем пероксид водорода, и выдерживали 30 мин при +37 °С. Реакцию останавливали добавлением в каждую лунку 50 мкл 2 М серной кислоты, после чего сразу производили учёт результатов на спектрофотометре Sunrise (Tecan, Швейцария) при 450 нм против референсной длины волны 620 нм.
Оценку сравнительной активности конъюгатов проводили для разведений HBsAg-содержащей сыворотки со значениями оптической плотности, позволяющими сравнивать активность 2 конъюгатов, т.е. <3,0 (плато).
Сыворотки, имеющие в одинаковых разведениях сходные значения оптической плотности с конъюгата-ми Н2 и 11F3, относятся к дикому типу. Образцы же, дающие с конъюгатом Н2 значения оптической плотности, превышающие таковые для 11F3 в >10 раз, могут содержать мутацию в положениях 143 или 145 а.о. и требуют дальнейшего исследования. Для этого используется третий конъюгат - NF5, который реагирует с мутантом в области 143 а.о. (но не 145 а.о.). Если реактивность образца сыворотки с конъюгатом Н2 не превышает таковую с NF5 в >10 раз, это означает, что в данной пробе присутствует HBsAg с мутацией в положении 143 а.о. Если же реактивность сыворотки с конъюгатом Н2 превышает таковую в >10 раз как с 11F3, так и с NF5, можно заключить, что имеющийся HBsAg несёт мутацию в позиции 145 а.о.
Исследование проводилось при информированном согласии пациентов. Протокол исследования одобрен Локальным этическим комитетом при ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России (Протокол № 104 от 28.01.2015 г.).
Результаты и обсуждение
По результатам NGS только 5 (8,93%) среди 56 образцов имели мутацию в 143 а.о., причём 4 из них принадлежали группе лиц с онкогематологической патологией. Таким образом, распространённость мутации в позиции 143 а.о. составила 10,81% (4 из 37) (см. табл. 1). При этом 3 из 5 образцов содержали гомогенную мутацию S143T, а 2 оставшихся - мутацию S143L. Все образцы с вариантом S143T, относившиеся к субтипу adw1 генотипов A и D, определены иммуноферментной тест-системой «Гепастрип-му-тант-3К» как содержащие дикий тип, несмотря на достаточно высокий уровень вирусной ДНК (105-108 копий/мл). Низкотитражная сыворотка с гетерогенной мутацией S143L, относительное содержание которой составило 31%, также идентифицирована как имеющая дикий тип вируса. Лишь 1 из 5 сывороток с ВГВ, мутантным по 143 а.о. S-HBsAg, правильно
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
определена ИФА тест-системой. Это была высокоти-тражная сыворотка из группы «Доноры», содержащая ВГВ генотипа D субтипа ayw3 (см. табл. 1).
По сравнению с заменами в 143 а.о. мутация в 145 а.о. S-HBsAg встречалась реже и аналогичным образом доминировала в образцах из группы «Онко-гематология», однако лучше детектировалась с помощью ИФА (см. табл. 2). Все 4 обнаруженные замены в 145 а.о. представляли собой мутацию G145R. Таким
образом, частота встречаемости этой мутации у онко-гематологических больных составила 8,11% (3 из 37), а в целом среди всех исследованных образцов - 7,14% (4 из 56). В 2 случаях мутация оказалась гомогенной, а в 2 других - представленной в виде минорных популяций (22-25%). Оба образца со 100% мутацией G145R правильно идентифицированы иммунофер-ментной тест-системой. Тем не менее, чувствительность последней оказалась недостаточной для де-
Таблица 1. Выявление мутации в позиции 143 аминокислотного остатка S-HBsAg вируса гепатита В в сыворотках с помощью иммуноферментной тест-системы «Гепастрип-мутант-3К»
Table 1. Detection of mutation in 143 amino acid position of S-HBsAg hepatitis B virus in sera using the enzyme-linked immunosorbent assay kit «Hepastrip-mutant-3K»
№ сыворотки* Serum number* Группа пациентов Patients' group Маркёры вирусных гепатитов в сыворотке Markers of viral hepatitis in the serum Свойства ВГВ по результатам NGS HBV properties according to NGS Гепастрип-мутант-3К Hepastrip-mutant-3K
ВГВ HBV Другие Others Оптимальное разведение сыворотки (1 : х) для определения конъюгатом* Optimal dilution of serum (1 : х) for detecting by conjugate* Оценка S-HB- sAg S-HB- sAg assessment
HBsAg§ анти-HBsAg§ anti-HBsAg§ HBeAg анти-HBe IgG anti-HBe IgG анти-HBc IgM + IgG anti-HBc IgM + IgG ДНК, копий/мл DNA, copies/ml анти-HCV anti-HCV анти-HDV anti-HDV Генотип Genotype Суб-тип Subtype Мутация в 143 а.о.* Mutation in 143 аа* 11F3 H2 NF5
18 Онкоге-матоло- гия Hema-tologic malignancies + - + - - 3,0 x 108 - - A adwl S143T 99% 104 104 104 дикий тип wild type
29 + - - + + 2,9 x 105 - - D adwl S143T 100% 104 104 104 дикий тип wild type
33 + - - + + 4,5 x 108 - - D adwl S143T 100% 104 104 104 дикий тип wild type
35 + - - + + 3,7 x 103 - - D ayw3 S143L 31% 103 103 103 дикий тип wild type
77 Доноры Donors 95 <10 - + + 7,4 x 108 + + D ayw3 S143L 100% исходный original 104 105 замена в позиции 143 а.о. substitution in 143 аа position
Примечание: "номера сывороток 1-40 из группы «Онкогематология» соответствуют нумерации из работы [7], содержащей детали диагноза и молекулярно-биологические характеристики; ^величина обозначает установленную концентрацию аналита (МЕ/мл); t величина обозначает содержание ВГВ с указанной мутацией относительно общего пула вируса; *темно-серая заливка обозначает дефект распознавания в >100 раз, светло-серая - в >10 раз; «+» - положительный результат, «-» - отрицательный результат; NGS - секвенирование нового поколения.
Note. "the numbers of sera from 1 to 40 from the group «Hematologic malignancies» correspond to the numbering according [7], which contains the details of the diagnosis and molecular biological features; §the value indicates the measured concentration of the analyte (IU/ml); *the value indicates the content of the HBV with such mutation relative to the total viral pool; *the recognition defect that is not less than 100 times is highlighted in dark gray, and the recognition defect that is not less than 10 times is highlighted in light gray; «+», positive result; «-», negative result; NGS, next generation sequencing.
ORIGINAL RESEARCH
текции минорных популяций G145R: в одном случае проба определена как дикий тип, а во втором - как замена в 143 а.о. В последнем случае образец ВГВ (№ 66) имел генотип, который можно отнести к ре-комбинантной форме D/E. При этом он нёс в S-HBsAg минорную мутацию L216Opal (содержание 21%) наряду с относящимися к мутациям диагностического ускользания заменами V118A и V128 А, что, вероятно, могло повлиять на выявление мутации G145R.
Среди оставшихся 47 образцов 8 представляли собой сыворотки со слабовыраженными дефек-
тами по моноклональным конъюгатам (<10 раз) (табл. 3). Объединяющих их мутаций, позволяющих отчётливо идентифицировать характерный серологический портрет, не обнаружено (табл. 3 и 4). Интересным представляется факт, что escape-мутация D144E, встречавшаяся в гомогенном виде в образцах №№ 65 и 10, показала серологическую реакцию, отличающуюся от картины мутационных изменений в позициях 143 и 145 а.о., несмотря близкую к ним расположенность. В частности, оба образца с заменой D144E имели слабый дефект по конъюгату NF5. Эта
№ сыворотки* Serum Number* Группа пациентов Patients' group Маркёры вирусных гепатитов в сыворотке Markers of viral hepatitis in the serum Свойства ВГВ по результатам NGS HBV properties according to NGS Гепастрип-мутант-3К Hepastrip-mutant-3K
ВГВ HBV Другие Others Оптимальное разведение сыворотки (1 : х) для определения конъюгатом* Optimal dilution of serum (1 : х) for detecting by conjugate* Оценка S-HBsAg S-HBsAg assessment
HBsAg§ анти-HBsAg§ anti-HBsAg§ HBeAg анти-HBe IgG anti-HBe IgG анти-HBc IgM + IgG anti-HBc IgM + IgG ДНК, копий/мл DNA, copies/ml анти-HCV anti-HCV анти-HDV anti-HDV Генотип Genotype Суб-тип Subtype Мутация в 145 а.о.* Mutation in 145 aa* 11F3 H2 NF5
1 Онкогема-тология Hema-tologic malignancies 60 30 - + + 1,0 x 108 - - D/E? ayw2/ ay? G145R 100% 102 105 104 замена в позиции 145 а.о. substitution in 145 аa position
2 95 - + ± + 9,4 x 107 - - D adw3 G145R 100% 102 105 103 замена в позиции 145 а.о. substitution in 145 аа position
15 + - - + + 1,4 x 108 н/т# n/t# - D ayw? G145R 25% 104 104 104 дикий тип wild type
66 HBsAg-носители HBsAg carriers >1 <10 + + + 3,7 x 108 - - D/E? ayw3 G145R 22% 104 105 105 замена в позиции 143 а.о. substitution in 143 aa position
Примечание: "номера сывороток 1-40 из группы «Онкогематология» соответствуют нумерации из работы [7], содержащей детали диагноза и молекулярно-биологические характеристики; ^величина обозначает установленную концентрацию аналита (МЕ/мл); ^величина обозначает содержание ВГВ с указанной мутацией относительно общего пула вируса; *тёмно-серая заливка обозначает дефект распознавания в >100 раз, светло-серая - в >10 раз; #н/т - не тестировано; «+» - положительный результат, «-» - отрицательный результат.
Note. "the numbers of sera from 1 to 40 from the group «Hematologic malignancies» correspond to the numbering according [7], which contains the details of the diagnosis and molecular biological features; §the value indicates the measured concentration of the analyte (IU/ml); ^the value indicates the content of the HBV with such mutation relative to the total viral pool; *the recognition defect that is not less than 100 times is highlighted in dark gray, and the recognition defect that is not less than 10 times is highlighted in light gray; «+», positive result; «-», negative result; #n/t, not tested.
Таблица 2. Выявление мутации в позиции 145 аминокислотного остатка S-HBsAg вируса гепатита В в сыворотках с помощью иммуноферментной тест-системы «Гепастрип-мутант-3К»
Table 2. Detection of mutation in 145 amino acid position of S-HBsAg hepatitis B virus in sera using the enzyme-linked immunosorbent assay kit «Hepastrip-mutant-3K»
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Таблица 3. Характеристика сывороток со слабовыраженными дефектами распознавания вируса гепатита В моноклональными конъюгатами из иммуноферментной тест-системы «Гепастрип-мутант-3К»
Table 3. Features of sera with mild defects of hepatitis B virus recognition by monoclonal conjugates with the enzyme-linked immunosorbent assay kit «Hepastrip-mutant-3K»
№ сыворотки* Serum number* Группа пациентов Patients' group Маркёры вирусных гепатитов в сыворотке Markers of viral hepatitis in serum Свойства ВГВ по результатам NGS HBV properties according to NGS Гепастрип-мутант-3К Hepastrip-mutant-3K
ВГВ HBV Другие Others Оптимальное разведение сыворотки (1 : х) для определения конъюгатом* Optimal dilution of serum (1 : х) for detecting by conjugate* Оценка S-HBsAg S-HBsAg assessment
HBsAg§ анти-HBsAg§ anti-HBsAg§ HBeAg анти-HBe IgG anti-HBe IgG анти- тс IgM + IgG anti- тс IgM + IgG ДНК, копий/мл DNA, copies/ml анти-HCV anti-HCV анти-HDV anti-HDV Генотип Genotype Суб-тип Subtype Общие мутации Mutual mutations 11F3 H2 NF5
14 Онкогема- тология Hematologic malignancies + - - + + 6,o x lo7 н/дТ n/t* - D ayw2 нет none lo3 lo3 lo4 замена в позиции 143 а.о.? substitution in 143 а.о. position?
38 Онкогема- тология Hematologic malignancies + - + + + 5,o x lo8 н/д n/t - D2 ayw3 нет none lo5 lo5 lo6 замена в позиции 143 а.о.? substitution in 143 а.о. position?
4o Онкогема- тология Hematologic malignancies + - - + + 1,1 x lo5 - - D2 ayw3 нет none lo3 lo3 lo4 замена в позиции 143 а.о.? substitution in 143 а.о. position?
63 HBsAg-носители HBsAg carriers >1 - + + + 4,4 x lo5 - - D ayw2 нет none lo5 lo5 lo4 ?
64 HBsAg-носители HBsAg carriers >1 - + + + 1,4 x lo8 - - D ayw2 нет none lo5 lo5 lo4 ?
65 HBsAg-носители HBsAg carriers >1 - + + + 2,5 x lo7 - - D/E? adw2 нет none lo6 lo6 lo5 ?
9 Онкогема- тология Hematologic malignancies + н/т n/t - н/т n/t + н/т n/t н/т n/t н/т n/t D ayw3 нет none lo lo исходный original ?
lo Онкогема- тология Hematologic malignancies + н/т n/t н/т n/t н/т n/t н/т n/t 4,7 x lo6 н/т n/t н/т n/t D adw3 нет none lo5 lo4 lo4 ?
Примечание: "номера сывороток 1-40 из группы «Онкогематология» соответствуют нумерации из работы [7], содержащей детали диагноза и молекулярно-биологические характеристики; ^величина обозначает установленную концентрацию аналита (МЕ/мл); *н/т - не тестировано; *серая заливка обозначает дефект распознавания в >10 раз; «+» - положительный результат, «-» - отрицательный результат; «?» - характер изменений неясен.
Note. "the numbers of sera from 1 to 40 from the group «Hematologic malignancies» correspond to the numbering according [7], which contains the details of the diagnosis and molecular biological features; §the value indicates the measured concentration of the analyte (IU/ml); *n/t, not tested; *the recognition defect that is not less than 10 times is highlighted in gray; «+», positive result; «-», negative result; «?», the details of the changes are unclear.
ORIGINAL RESEARCH
же мутация обнаружена ещё в одном образце группы «Онкогематологая», однако её содержание не превышало 72%; вероятно, по этой причине в тест-системе «Гепастрип-мутант-ЗК» не зарегистрирован даже слабый дефект распознавания. Серологический портрет остальных 38 образцов также ничем не отличался от портрета дикого типа вируса.
HBsAg является основным серологическим маркёром для выявления острой и мониторинга хронической ВГВ-инфекции. Уровень ДНК возбудителя у вирусоносителей, которые проходят лечение аналогами нуклеозидов/нуклеотидов, может опускаться ниже предела обнаружения. Поэтому для мониторинга течения хронической ВГВ-инфекции используется количественное определение HBsAg, в т.ч. в фазах иммунотолерантности, иммунного клиренса и иммунного контроля (неактивной фазы), а также при реактивации HBeAg-негативной формы заболевания [12]. Однако при использовании даже самых чувствительных методов определения HBsAg могут иметь место диагностические ошибки. Такая возможность появляется в том случае, если в образце присутствуют escape-мутанты, особенно при их множественном возникновении у одного и того же пациента. Это способствует увеличению эпидемиологической опасности, особенно учитывая накопление мутационных изменений в группах риска [7].
Полученные нами результаты показывают, что рутинный поиск escape-мутантов оправдан именно в таких субпопуляциях, одной из которых являются страдающие онкогематологическими заболеваниями лица. Escape-мутации S143L/T, D144E и G145R выявлены преимущественно у этой категории больных с частотой 10,81, 5,41 и 8,11% соответственно. Чувствительность иммуноферментного выявления этих мутаций оказалась невелика. Наиболее отчётливый результат достигнут при 100% гомогенности мутации и высокой концентрации ДНК ВГВ. Несмотря на это, обнаружена специфичность иммуноферментного выявления замены S143L в отличие от S143T. Кроме того, надёжность выявления мутаций S143L и G145R напрямую связана с глубиной выявляемых серологических дефектов. В случае мутации S143L снижение глубины дефекта распознавания мутантного HBsAg моноклональным конъюгатом 1^3 до величины <10 раз приводила к погрешности определения, выявляя в качестве сомнительных образцы с ВГВ, не содержащих такой замены. Это обосновывает необходимость проведения дальнейших экспериментов по уточнению количественных критериев используемой тест-системы.
Другим важным аспектом подхода, описанного в данной работе, может являться применение его в целях разработки и контроля качества вакцин, на-
Таблица 4. Мутации в S-HBsAg в образцах со слабовыраженными дефектами распознавания вируса гепатита В моноклональными конъюгатами иммуноферментной тест-системы «Гепастрип-мутант-3К»
Table 4. Mutations in S-HBsAg in samples with mild defects of hepatitis B virus recognition by monoclonal conjugates of enzyme-linked immunosorbent assay kit «Hepastrip-mutant-3K»
№ сыворотки* Serum number* Группа пациентов Patients' group Дефект по конъю- гатам в ИФА Conjugate defect in ELISA Генотип ВГВ HBV genotype Субтип ВГВ HBV subtype Аминокислотные замены в S-HBsAg и степень их гомогенности Amino acid substitutions in S-HBsAg, and their homogeneity
14 Онкогематология Hematologic malignancies 11F3, H2 D ayw2 V118T (100%); V128A (100%); E164A (40%); T189I (21%); S207N/ H/R (39%); L222I (21%)
38 Онкогематология Hematologic malignancies D2 ayw3 нет none
40 Онкогематология Hematologic malignancies D2 ayw3 S114P (<100%)
63 HBsAg-носители HBsAg carriers NF 5 D ayw2 V118T (100%); V128A (100%); T189I (68%); L216Opal (21%)
64 HBsAg-носители HBsAg carriers D ayw2 R24K (27%); V118T (100%); V128A (100%)
65 HBsAg-носители HBsAg carriers D/E? adw2 P11L (99%); V118T (100%); V128A (100%); Y134H (94%); D144E (100%); V177A (98%)
9 Онкогематология Hematologic malignancies D ayw3 S114A (97%)
10 Онкогематология Hematologic malignancies H2, NF5 D adw3 V118T (100%); V128A (100%); D144E (100%); S174N (100%); L222R (66%); I226S (99%)
Примечание: "номера сывороток 1-40 из группы «Онкогематология» соответствуют нумерации из работы [7], содержащей детали диагноза и молекулярно-биологические характеристики; ИФА - иммуноферментный анализ.
Note. *the numbers of sera from 1 to 40 from the group «Hematologic malignancies» correspond to the numbering according [7], which contains the details of the diagnosis and molecular biological features; ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay.
ВОПРОСЫ ВИРУСОЛОГИИ. 2022; 67(1)
https://doi.org/10.36233/0507-4088-91 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
правленных против escape-мутантов. В такой ситуации рекомбинантный HBsAg с мутацией может рассматриваться как гомогенный белковый препарат, и тест-система «Гепастрип-мутант-ЗК» позволит отчётливо выявлять правильный фолдинг этого мутант-ного белка в количественном отношении.
Заключение
Иммуноферментный вариант детекции escape-мутаций S143L, D144E и G145R может быть использован в рутинной лабораторной диагностике, особенно в группах риска. Тем не менее, возможно уточнение параметров диагностической чувствительности и специфичности тест-системы, а также критериев оценки наличия мутационных изменений при дополнительных исследованиях на увеличенной выборке образцов, охарактеризованных молекулярно-биоло-гическими методами. Кроме того, данная тест-система и методика в целом применимы для разработки и контроля качества вакцин против escape-мутантов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Mahamat G., Kenmoe S., Akazong E.W., Ebogo-Belobo J.T., Mba-ga D.S., Bowo-Ngandji A., et al. Global prevalence of hepatitis B virus serological markers among healthcare workers: A systematic review and meta-analysis. World J. Hepatol. 2021; 13(9): 1190202. https://doi.org/10.4254/wjh.v13.i9.1190
2. Polaris Observatory Collaborators. The case for simplifying and using absolute targets for viral hepatitis elimination goals. J. Viral. Hepat. 2021; 28(1): 12-9. https://doi.org/10.1111/jvh.13412
3. Han Q., Zhang C., Zhang J., Tian Z. The role of innate immunity in HBV infection. Semin. Immunopathol. 2013; 35(1): 23-38. https:// doi.org/10.1007/s00281-012-0331-y
4. Araujo N.M., Teles S.A., Spitz N. Comprehensive Analysis of Clinically Significant Hepatitis B Virus Mutations in Relation to Genotype, Subgenotype and Geographic Region. Front. Microbiol. 2020; 11: 616023. https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.616023
5. Баженов А.И., Эльгорт Д.А., Фельдшерова А.А., Будниц-кая П.З., Никитина Г.И., Хац Ю.С., и др. Выявление антител к мутантным формам HBsAg у лиц, иммунизированных против гепатита В вакцинами разных субтипов. Эпидемиология и Вак-цинопрофилактика. 2011; 5 (60): 49-53.
6. Hossain M.G., Ueda K. A meta-analysis on genetic variability of RT/HBsAg overlapping region of hepatitis B virus (HBV) isolates of Bangladesh. Infect. Agent. Cancer. 2019; 14: 33. https://doi. org/10.1186/s13027-019-0253-6
7. Konopleva M.V., Belenikin M.S., Shanko A.V., Bazhenov A.I., Kiryanov S.A., Tupoleva T.A., et al. Detection of S-HBsAg Mutations in Patients with Hematologic Malignancies. Diagnostics (Basel). 2021; 11(6): 969. https://doi.org/10.3390/diagnostics11060969
8. Семененко Т.А., Ярош Л.В., Баженов А.И., Никитина Г.Ю., Клейменов Д.А., Эльгорт Д.А., и др. Эпидемиологическая оценка распространенности «скрытых» форм и HBsAg-мутантов вируса гепатита В у гематологических больных. Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. 2012; 6 (67): 9-14.
9. Hsu H.Y., Chang M.H., Ni Y.H., Chen H.L. Survey of hepatitis B surface variant infection in children 15 years after a nationwide vaccination programme in Taiwan. Gut. 2004; 53(10): 1499-503. https://doi.org/10.1136/gut.2003.034223
10. Komatsu H., Inui A., Umetsu S., Tsunoda T., Sogo T., Konishi Y., et al. Evaluation of the G145R Mutant of the Hepatitis B Virus as a Minor Strain in Mother-to-Child Transmission. PLoS One. 2016; 11(11): e0165674. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0165674
11. Weber B. Genetic variability of the S gene of hepatitis B virus: clinical and diagnostic impact. J. Clin. Virol. 2005, 32(2): 102-12. https://doi.org/10.1016/jjcv.2004.10.008
12. Deguchi M., Kagita M., Yoshioka N., Tsukamoto H., Takao M., Tahara K., et al. Evaluation of the highly sensitive chemilumines-cent enzyme immunoassay "Lumipulse HBsAg-HQ" for hepatitis B
virus screening. J. Clin. Lab. Anal. 2018; 32(4): e22334. https://doi. org/10.1002/jcla.22334
13. Коноплева М.В., Борисова В.Н., Соколова М.В., Фельдшерова А.А., Крымский М.А., Семененко Т.А., и др. Сравнительная характеристика антигенных свойств рекомбинантных и натив-ных HBs-антигенов с мутацией G145R и оценка их иммуно-генности. Вопросы вирусологии. 2017; 62(4): 179-86. https://doi. org/10.18821/0507-4088-2017-62-4-179-186
14. Cuestas M.L., Mathet V.L., Oubina J.R. Specific primer sets used to amplify by PCR the hepatitis B virus overlapping S/Pol region select different viral variants. J. Viral. Hepat. 2012; 19(10): 754-6. https://doi.org/10.1111/j.1365-2893.2012.01614.x
15. Zhang M., Gong Y., Osiowy C., Minuk G.Y. Rapid detection of hepatitis B virus mutations using real-time PCR and melting curve analysis. Hepatology. 2002; 36(3): 723-8. https://doi.org/10.1053/ jhep.2002.35346
16. Osiowy C. Sensitive Detection of HBsAg Mutants by a Gap Ligase Chain Reaction Assay. J. Clin. Microbiol. 2002; 40(7): 2566-71. https://doi.org/10.1128/JCM.40.7.2566-2571.2002
17. Nainan O.V., Khristova M.L., Byun K., Xia G., Taylor P.E., Stevens C.E., et al. Genetic variation of hepatitis B surface antigen coding region among infants with chronic hepatitis B virus infection. J. Med. Virol. 2002; 68(3): 319-27. https://doi.org/10.1002/jmv.10206
18. Osiowy C. Detection of HBsAg mutants. J. Med. Virol. 2006; 78(S1): S48-51. https://doi.org/10.1002/jmv.20607
19. Gauthier M., Bonnaud B., Arsac M., Lavocat F., Maisetti J., Kay A., et al. Microarray for hepatitis B virus genotyping and detection of 994 mutations along the genome. J. Clin. Microbiol. 2010; 48(11): 4207-15. https://doi.org/10.1128/JCM.00344-10
20. Баженов А.И., Коноплева М.В., Эльгорт Д.А., Фельдшерова А.А., Будницкая П.З., Никитина Н.И., и др. Алгоритм серологического поиска и оценка распространенности серологически значимых HBsAg-мутаций у хронических носителей вируса гепатита В. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2007; 6: 30-7.
21. Tijssen P., Kurstak E. Highly efficient and simple methods for the preparation of peroxidase and active peroxidase-antibody conjugates ensyme immunoassays. Anal. Biochem. 1984; 136 (2): 451-7. https://doi.org/10.1016/0003-2697(84)90243-4
22. Pumpens P., Grensa E., Nassal M. Molecular Epidemiology and Immunology of Hepatitis B Virus Infection. Intervirology. 2002; 45: 218-32.
23. Zheng X., Weinbergerc K.M., Gehrked R., Isogawa M., Hilkene G., Kempera T., et al. Mutant hepatitis B virus surface antigens (HBsAg) are immunogenic but may have a changed specificity. Virology. 2004; 329: 454-64. https://doi.org/10.1016/j.vi-rol.2004.08.033
24. Weber B. Genetic variability of the S gene of hepatitis B virus: clinical and diagnostic impact. J. Clin. Virol. 2005; 32: 102-12. https:// doi.org/10.1016/j.jcv.2004.10.008
25. Norder H., Hammas B., Lofdahl S., Courouce A.M., Magnius L.O. Comparison of the amino acid sequences of nine different serotypes of hepatitis B surface antigen and genomic classification of the corresponding hepatitis B virus strains. J. Gen. Virol. 1992; 73(5): 1201-8. https://doi.org/10.1099/0022-1317-73-5-1201
26. Norder H., Courouce A.M., Coursaget P., Echevarria J.M., Lee S.D., Mushahwar I.K., et al. Genetic diversity of hepatitis B virus strains derived worldwide: genotypes, subgenotypes, and HB-sAg subtypes. Intervirology. 2004; 47(6): 289-309. https://doi. org/10.1159/000080872
27. Pult I., Chouard T., Wieland S., Klemenz R., Yaniv M., Blum H.E. A hepatitis B virus mutant with a new hepatocyte nuclear factor 1 binding site emerging in transplant-transmitted fulminant hepatitis B. Hepatology. 1997; 25(6): 1507-15. https://doi.org/10.1002/hep.510250633
REFERENCES
1. Mahamat G., Kenmoe S., Akazong E.W., Ebogo-Belobo J.T., Mbaga D.S., Bowo-Ngandji A., et al. Global prevalence of hepatitis B virus serological markers among healthcare workers: A systematic review and meta-analysis. World J. Hepatol. 2021; 13(9): 1190-202. https://doi.org/10.4254/wjh.v13.i9.1190
2. Polaris Observatory Collaborators. The case for simplifying and using absolute targets for viral hepatitis elimination goals. J. Viral. Hepat. 2021; 28(1): 12-9. https://doi.org/10.1111/jvh.13412
ORIGINAL RESEARCH
3. Han Q., Zhang C., Zhang J., Tian Z. The role of innate immunity in HBV infection. Semin. Immunopathol. 2013; 35(1): 23-38. https:// doi.org/10.1007/s00281-012-0331-y
4. Araujo N.M., Teles S.A., Spitz N. Comprehensive Analysis of Clinically Significant Hepatitis B Virus Mutations in Relation to Genotype, Subgenotype and Geographic Region. Front. Microbiol. 2020; 11: 616023. https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.616023
5. Bazhenov A.I., Elgort D.A., Feldsherova A.A., Budnitskaya P.Z., Nikitina G.I., Hats Yu.S., et al. Detection of antibodies to HBsAg mutant forms in individuals immunized of different subtypes hepatitis B vaccines [Vyyavlenie antitel k mutantnym formam HBsAg u lits, immunizirovannykh protiv gepatita B vaktsinami raznykh sub-tipov]. Epidemiologiya i Vaktsinoprofilaktika. 2011; 5(60): 49-53 (in Russian).
6. Hossain M.G., Ueda K. A meta-analysis on genetic variability of RT/HBsAg overlapping region of hepatitis B virus (HBV) isolates of Bangladesh. Infect. Agent. Cancer. 2019; 14: 33. https://doi. org/10.1186/s13027-019-0253-6
7. Konopleva M.V., Belenikin M.S., Shanko A.V., Bazhenov A.I., Kiryanov S.A., Tupoleva T.A., et al. Detection of S-HBsAg Mutations in Patients with Hematologic Malignancies. Diagnostics (Basel). 2021; 11(6): 969. https://doi.org/10.3390/diagnostics11060969
8. Semenenko T.A., Yarosh L.V., Bazhenov A.I., Nikitina G.Yu., Klei-menov D.A., Elgort D.A., et al. Epidemiological evaluation of the prevalence of «occult» forms and HBsAg mutants of hepatitis B virus in hematological patients [Epidemiologicheskaya otsenka ras-prostranennosti «skrytykh» form i HBsAg-mutantov virusa gepatita B u gematologicheskikh bol'nykh]. Epidemiologiya i Vaktsinoprofilaktika. 2012; 6 (67): 9-14 (in Russian).
9. Hsu H.Y., Chang M.H., Ni Y.H., Chen H.L. Survey of hepatitis B surface variant infection in children 15 years after a nationwide vaccination programme in Taiwan. Gut. 2004; 53(10): 1499-503. https://doi.org/10.1136/gut.2003.034223
10. Komatsu H., Inui A., Umetsu S., Tsunoda T., Sogo T., Konishi Y., et al. Evaluation of the G145R Mutant of the Hepatitis B Virus as a Minor Strain in Mother-to-Child Transmission. PLoS One. 2016; 11(11): e0165674. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0165674
11. Weber B. Genetic variability of the S gene of hepatitis B virus: clinical and diagnostic impact. J. Clin. Virol. 2005, 32(2): 102-12. https://doi.org/10.1016/jjcv.2004.10.008
12. Deguchi M., Kagita M., Yoshioka N., Tsukamoto H., Takao M., Tahara K., et al. Evaluation of the highly sensitive chemilumines-cent enzyme immunoassay "Lumipulse HBsAg-HQ" for hepatitis B virus screening. J. Clin. Lab. Anal. 2018; 32(4): e22334. https://doi. org/10.1002/jcla.22334
13. Konopleva M.V., Borisova V.N., Sokolova M.V., Feldsherova A.A., Krymskij M.A., Semenenko T.A., et al. A comparative characteristic of antigenic properties of recombinant and native HBs-anti-gens with G145R mutation and evaluation of their immunogenicity [Sravnitel'naya kharakteristika antigennykh svoystv rekombinant-nykh i nativnykh HBs-antigenov s mutatsiey G145R i otsenka ikh immunogennosti]. Voprosy virusologii. 2017; 62(4): 179-86. https:// doi.org/10.18821/0507-4088-2017-62-4-179-186 (in Russian)
14. Cuestas M.L., Mathet V.L., Oubina J.R. Specific primer sets used to amplify by PCR the hepatitis B virus overlapping S/Pol region
select different viral variants. J. Viral. Hepat. 2012; 19(10): 754-6. https://doi.Org/10.1111/j.1365-2893.2012.01614.x
15. Zhang M., Gong Y., Osiowy C., Minuk G.Y. Rapid detection of hepatitis B virus mutations using real-time PCR and melting curve analysis. Hepatology. 2002; 36(3): 723-8. https://doi.org/10.1053/ jhep.2002.35346
16. Osiowy C. Sensitive Detection of HBsAg Mutants by a Gap Ligase Chain Reaction Assay. J. Clin. Microbiol. 2002; 40(7): 2566-71. https://doi.org/10.1128/JCM.407.2566-2571.2002
17. Nainan O.V., Khristova M.L., Byun K., Xia G., Taylor P.E., Stevens C.E., et al. Genetic variation of hepatitis B surface antigen coding region among infants with chronic hepatitis B virus infection. J. Med. Virol. 2002; 68(3): 319-27. https://doi.org/10.1002/jmv.10206
18. Osiowy C. Detection of HBsAg mutants. J. Med. Virol. 2006; 78(S1): S48-51. https://doi.org/10.1002/jmv.20607
19. Gauthier M., Bonnaud B., Arsac M., Lavocat F., Maisetti J., Kay A., et al. Microarray for hepatitis B virus genotyping and detection of 994 mutations along the genome. J. Clin. Microbiol. 2010; 48(11): 4207-15. https://doi.org/10.1128/JCM.00344-10
20. Bazhenov A.I., Konopleva M.V., Elgort D.A., Feldsherova A.A., Budnitskaya P.Z., Nikitina N.I., et al. Algorithm of serologic screening and assessment of prevalence of serologically meaningful mutations of HBsAg in hepatitis B virus carriers [Algoritm se-rologicheskogo poiska i otsenka rasprostranennosti serologicheski znachimykh HBsAg-mutatsiy u khronicheskikh nositeley virusa gepatita B]. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 6: 30-7 (in Russian).
21. Tijssen P., Kurstak E. Highly efficient and simple methods for the preparation of peroxidase and active peroxidase-antibody conjugates ensyme immunoassays. Anal. Biochem. 1984; 136 (2): 451-7. https://doi.org/10.1016/0003-2697(84)90243-4
22. Pumpens P., Grensa E., Nassal M. Molecular Epidemiology and Immunology of Hepatitis B Virus Infection. Intervirology. 2002; 45: 218-32.
23. Zheng X., Weinbergerc K.M., Gehrked R., Isogawa M., Hilkene G., Kempera T. et al. Mutant hepatitis B virus surface antigens (HBsAg) are immunogenic but may have a changed specificity. Virology. 2004; 329: 454-64. https://doi.org/10.1016/j.virol.2004.08.033
24. Weber B. Genetic variability of the S gene of hepatitis B virus: clinical and diagnostic impact. J. Clin. Virol. 2005; 32: 102-12. https:// doi.org/10.1016/jjcv.2004.10.008
25. Norder H., Hammas B., Lofdahl S., Courouce A.M., Magnius L.O. Comparison of the amino acid sequences of nine different serotypes of hepatitis B surface antigen and genomic classification of the corresponding hepatitis B virus strains. J. Gen. Virol. 1992; 73(5): 1201-8. https://doi.org/10.1099/0022-1317-73-5-1201
26. Norder H., Courouce A.M., Coursaget P., Echevarria J.M., Lee S.D., Mushahwar I.K. et al. Genetic diversity of hepatitis B virus strains derived worldwide: genotypes, subgenotypes, and HB-sAg subtypes. Intervirology. 2004; 47(6): 289-309. https://doi. org/10.1159/000080872
27. Pult I., Chouard T., Wieland S., Klemenz R., Yaniv M., Blum H.E. A hepatitis B virus mutant with a new hepatocyte nuclear factor 1 binding site emerging in transplant-transmitted fulminant hepatitis B. Hepatology. 1997; 25(6): 1507-15. https://doi.org/10.1002/ hep.510250633
