Иммунофенотипическая диагностика минимальной остаточной болезни у больных хроническим лимфолейкозом как оценка эффективности ритуксимабсодержащих режимов терапии Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

Чуксина Ю.Ю.1, Яздовский В.В.2, Катаева Е.В.3, Голенков А.К.4 ©

1Старший научный сотрудник, к.м.н., лаб. клинической иммунологии и тканевого типирования; 2д.м.н., проф., руководитель лаб. клинической иммунологии и тканевого типирования; 3старший научный сотрудник, к.м.н., отделение клинической гематологии и иммунотерапии; 4д.м.н., проф., руководитель отделения клинической гематологии и

иммунотерапии.

ГБУЗ МО «Московский областной научно-исследовательский клинический институт

им. М.Ф. Владимирского», Москва

ИММУНОФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА МИНИМАЛЬНОЙ ОСТАТОЧНОЙ БОЛЕЗНИ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ЛИМФОЛЕЙКОЗОМ КАК ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ РИТУКСИМАБСОДЕРЖАЩИХ РЕЖИМОВ ТЕРАПИИ

Аннотация

В статье представлены результаты иммунофенотипической оценки минимальной остаточной болезни (МОБ) у больных В-клеточным хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ) в динамике проводимой иммунохимиотерапии с применением ритуксимаб-содержащих режимов: программы R-FC (Ритуксимаб, Флюдарабин, Циклофосфан) и поддерживающей терапии ритуксимабом. Метод 4-цветной проточной цитометрии по международному стандартизированному протоколу по чувствительности сопоставим с методом аллельспецифической полимеразной цепной реакции и позволяет детектировать 1 лейкозную клетку на 10.000 лейкоцитов. Выявлены новые иммунофенотипические показатели

качества достигнутой ремиссии, прогрессирования или рецидива заболевания.

Ключевые слова: В-клеточный хронический лимфолейкоз, проточная цитометрия, минимальная остаточная болезнь, терапия ритуксимабом

Keywords: chronic lymphocytic leukemia, flow cytometry, minimal residual disease, therapy with rituximab.

Введение. В-клеточный хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) развивается при накоплении медленно пролиферирующих долгоживущих CD5+B-клеток с дефектами апоптоза и характеризуется разнообразием клинической картины.

Стандартизированный подход к определению МОБ при В-ХЛЛ методом ПЦ был разработан и опубликован в 2007 году группой ученых из разных стран под руководством А.С. Rawstron.

Было выявлено, что чувствительность метода 4-цветной прочной цитометрии (ПЦ) сопоставима с методом аллель-специфической ПЦР, но имеет преимущества во времени, стоимости, применимости.

Одним из современных эффективных иммунотерапевтических режимов признан RFC, включающий ритуксимаб, флюдарабин, циклофосфан, который позволяет добиваться более чем у 40% пациентов эрадикации минимального остаточного заболевания [2, 2748; 3, 1171; 4, 4968]. В последние годы доказана роль минимальной остаточной болезни (МОБ) у пациентов ХЛЛ как независимого прогностического фактора при ВБП, показателя качества ремиссии и вектора для дальнейшей тактики лечения [1, 961].

При иммунофенотипическом исследовании на этапе диагностики нами была отмечена вариабельная экспрессия R-ИЛ-2 (CD25) на В-лимфоцитах у больных ХЛЛ, поэтому изучение возможной прогностической роли данного маркера в процессе лечения показалось нам актуальным.

© Чуксина Ю.Ю., Яздовский В.В., Катаева Е.В., Голенков А.К., 2015 г.

Цель исследования: выявление прогностической значимости иммунофено-

типических маркеров клеток В-ХЛЛ при оценке минимальной остаточной болезни после индукции R-FC у первичных и резистентных больных ХЛЛ.

Материалы и методы: Иммунофенотипическое исследование проводилось 60

больным ХЛЛ до начала лечения, в процессе и после проведения 6 курсов индукционной терапии R-FC. Клиническую эффективность лечения больных ХЛЛ оценивали по критериям NCI-WG (1996) как полную ремиссию (ПР), частичную ремиссию (ЧР), стабилизацию (СБ) и прогрессирование болезни (ПБ). Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови (ПК) на стадии диагностики проводилось методом 4-цветной проточной цитометрии (“Becton Dickinson”, США) с использованием МАТ к антигенам CD3, CD19, CD20, CD22, CD5, CD16, CD56, CD23, СD25, HLA-DR, CD38. Иммунофенотипическая диагностика минимальной остаточной болезни проводилась методом 4-цветной проточной цитометрии по стандартизированному европейско-американскому протоколу [1]. Выраженность экспрессии антигенов оценивалась по параметру средней интенсивности флюоресценции (MFI). Исследование образцов костного мозга проводилось с учетом гемодилюции [6, 20].

Результаты. У 50% пациентов выявлена 2 стадия, у 35% пациентов - 3 стадия, у 15% пациентов - 4 стадия ХЛЛ. Высокое содержание CD20+dim B-лимфоцитов ПК установлено у 99% пациентов в диапазоне от 50 до 96% позитивных клеток.

До начала терапии R-FC больные в дебюте заболевания составили 35%, больные с рецидивом заболевания составили 65%. В процессе проведенного лечения из 60 пациентов СБ отмечалась у 7 пациентов, ПБ зарегистрирована у 7 пациентов, ЧР достигли 15 пациентов после 2- 6 курсов, ПР определялась у 31 пациента, из них иммунофенотипическая ремиссия - у 30% к 5 - 6 курсам терапии.

Нами обнаружена вариабельная экспрессия CD25+ на В-лимфоцитах у больных ХЛЛ в дебюте заболевания (диапазон от 0,02% до 87% позитивных клеток). Появление на поверхности В-лимфоцитов R для ИЛ-2 (CD25) свидетельствует об усилении процессов их пролиферации, который запускается преимущественно ТЬ2-лимфоцитами или их предшественниками [5].

Больные ХЛЛ были разделены на группы в зависимости от исходного (выявленного при иммунофенотипической диагностике) количества CD25-позитивных и СD38-

позитивных В-лимфоцитов: 1 группа - менее 20% позитивных клеток и 2 группа - более 20% позитивных клеток. Данные по количеству CD38+и CD25+В-лимфоцитов у больных ХЛЛ до начала терапии представлены в таблице 1.

Таблица 1

Содержание CD38+H СВ25+В-лимфоцитов у больных ХЛЛ до начала терапии RFC

Число пациентов Дебют, п (%) Рецидив, п (%)

N= 60 21 (35%) 39 (65%)

Содержание СD38+/CD19+ клеток более 20% 9 (44%) 12 (31%)

Содержание CD25+/CD19+ клеток более 20% 8 (37%) * 36 (92%) *

Примечание: * р = 0,000013 (по Фишеру); Отношение шансов ^R=19,5)

Было обнаружено, что при наличии CD25+В-лимфоцитов более 20% вероятность возникновения рецидива была достоверно выше, чем при отсутствии экспрессии CD25 на В-

клетках (р=0,000013 по Фишеру; отношение шансов=19,5). Такой зависимости по экспрессии антигена CD38 на В-лимфоцитах установлено не было.

Уровень экспрессии известного прогностического фактора - CD38 на В-лимфоцитах до начала иммунохимиотерапии у больных 1-ой группы варьировал от 0,1 до 18%, у пациентов 2-ой группы уровень CD38+клеток составил от 20 до 88%. В группе с низкой экспрессией CD38+ общее число ответивших пациентов (достигших ЧР и ПР) было выше (93%), в группе с высокой экспрессией CD38+ общее число ответивших пациентов оказалось ниже - 73%, но достоверных различий между этими показателями выявлено не было. При достижении ЧР и ПР количество CD38-позитивных клеток достоверно снижалось в обеих группах пациентов и составило 0,52+-0,04% и 4,78+-0,09% соответственно.

Изменение количества CD25+/CD19+ лимфоцитов в зависимости от эффективности режима R-FC представлено на рисунке 2. В процессе достижения клинико-гематологической ремиссии и постепенной элиминации опухолевого клона (CD5+/CD23+/CD19+) уровень CD25+/CD19+ клеток достоверно (р<0,001) снижался при достижении больными ЧР (11,5+4,1%) и ПР (0,73+-0,13%). При ПБ, наоборот, выявлено существенное (р<0,005) увеличение числа CD25+B-лимфоцитов (46,8+-5,4%) по сравнению с уровнем до начала лечения (26,0+4,4%).

Был проведен анализ зависимости клинического эффекта терапии программы R-FC от исходного значения экспрессии CD25+/CD19+ у пациентов с ХЛЛ. Кроме того, у пациентов, достигших ПР, была проведена оценка МОБ методом 4-цветной проточной цитометрии по стандартизированному международному протоколу . Данные анализа представлены в таблице 2.

Таблица 2

Зависимость эффекта терапии R-FC от исходного значения количества CD25+ В-лимфоцитов у

больных ХЛЛ

Показатели эффективности терапии Число пациентов ХЛЛ, уровень СБ25+клеток более 20% (n = 32) Число пациентов ХЛЛ, уровень СБ25+клеток менее 20% (n = 20)

Стабилизация болезни 3 (9,3%) 1 (5,0%)

Прогрессия болезни 5 (15,6%) 0 (0%)

Частичная ремиссия 11 (34,40%) 8 (40,0%)

Полная ремиссия, в том числе: 13 (40,6%) 11 (55,0%)

МОБ-позитивная 10 (77%) * 3 (27,3%) *

МОБ-негативная 3 (13 %) * 8 (72,7%) *

Примечание: * р = 0,0377 (по Фишеру); Отношение шансов (ОЯ= 8,9)

При сравнительной оценке эффективности терапии больных ХЛЛ в зависимости от исходного уровня CD25+ В-лимфоцитов было выявлено, что общее число ответивших на терапию (ЧР+ПР) существенно не отличалось в обеих группах пациентов, но прогрессирование болезни (5 пациентов) было зафиксировано только в группе с высоким исходным уровнем СD25+CD19+лимфоцитов, у пациентов с низким исходным уровнем экспрессии СD25+CD19+ прогрессии заболевания не отмечено.

При оценке МОБ у пациентов с полной клинико-гематологической ремиссией было обнаружено, что при наличии исходного уровня СD25+В-лимфоцитов более 20% вероятность достижения МОБ-негативной ПР была достоверно ниже, а вероятность достижения МОБ-позитивной ПР достоверно выше, чем у больных с отсутствием экспрессии CD25 на В-лимфоцитах.

Результаты иммунофенотипической оценки МОБ у больных ХЛЛ, достигших ПР и ЧР после индукции R-FC, позволили выделить группу пациентов, которым была показана дальнейшая поддерживающая терапия ритуксимабом.

Таблица 3

Оценка МОБ у больных ХЛЛ, получающих поддерживающую тарапию мабтерой (ПТМ) после

окончания 6 курсов R-FC

Клиникогематологическая эффективность до ПТМ после 6 курсов R-FC После проведения ПТМ

Клинико- гематоло- гическая эффектив- ность Результаты оценки МОБ Эрадикация МОБ: МОБ (-) по ПК и КМ

МОБ (-) по ПК МОБ(-) по КМ

ЧР, N= 7 МОБ(+) 4 пац. МОБ(-) 3 пац Лимфаденопатия, гепатоспленомегалия Достижение ПР - 6 пац (86%) 6 пац (100%) 5 пац/ 83% 5 пац. / 83%

ЧР- 1 пац. 1пац /100%

ПР, N= 4 МОБ(-) - 3 пац. МОБ(+) -1 пац. ПР - 4 пац 4 пац/100% 4 пац /100% 4 пац /100%

Из 11 пациентов, которым были проведены курсы поддерживающей терапии ритуксимабом, у 9 (82%) пациентов была достигнута иммунофенотипическая ремиссия и эрадикация МОБ.

Заключение.

1. Определен дополнительный иммунологический фактор неблагоприятного прогноза течения заболевания: увеличение экспрессии антигена CD25 на В-клетках может быть показателем прогрессирования и рецидива заболевания у пациентов ХЛЛ.

2. Уровень экспрессии CD25 на В-лимфоцитах при ХЛЛ уже на этапе первичной иммунофенотипической диагностики может быть маркером высокой вероятности рефрактерности к проводимому режиму терапии и низкого качества ремиссии заболевания.

3. Оценка МОБ позволяет определить качество ремиссии и выбрать индивидуальную тактику терапии.

Литература

1. A. C. Rawstron, N. Villamor, M. Ritgen, S.Bottcher, P. Ghia, JL Zehnder, G Lozanski, C. Moreno et al. International standardized approach for flow cytometric residual disease monitoring in chronic lymphocytic. Leukaemia (2007) 21, 956-964

2. del Poeta G, del Principe MI, Irno Consalvo MA, Maurillo L, Buccisano F, Venditti A, et al., The addition of of rituximab to fludarabine improves clinical outcome in untreated patients with ZAP-70negative chronic lymphocytic leukaemia. Cancer, 2005; 104: 2743-2752

3. Hallek V, Fisher K, Fingerle-Rowson G. et al. Addition of rituximab to fludarabine and cyclophosphamide in patients with chronic lymphocytic leukaemia: a randomized, open-label, phase 3 trial. Lancet, 2010; 376 (9747): 1164-74

4. Pavlovsky C, Pavlovsky S, Pardo ML, Sapia S, MonrealM, Corrado C, et al. Therapy with fludarabine, cyclophosphamide and rituximab (FCR) for relapsed or untreated progressive chronic lymphocytic leukaemia (CLL). Blood 2006; 108: 4968.

5. Ярилин А.А. Иммунология- М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010, с.453

6. Michael R. Loken, Ph. D. Denise A. Wells, Иммунология гемопоэза, 2010, с. 20