CC BY
13
ИММУНОДИАГНОСТИКА ДИРОФИЛЯРИОЗА У СОБАК С ПРИМЕНЕНИЕМ ФРАКЦИОНИРОВАННОГО СОМАТИЧЕСКОГО АНТИГЕНА DIROFILARIA REPENS
Написаноеа Л. А.
ФГБНУ «ВНИИ фундаментальной и прикладной паразитологии животных и растений им. К.И. Скрябина» (napisanova@vniigis.ru)
Введение. Дирофиляриоз вызывается нематодами семейства Filariide рода Dirofilaria. Это единственный гельминтоз в умеренном климате с трансмиссивным путем передачи (через комаров). В настоящее время из-за изменения климата, изменения социально-экономических условий, миграции населения, наблюдается тенденция роста данного заболевания и продвижения его на северные территории России - граница дирофиляриоза уже достигла 53-57° с.ш. Вопросами этой патологии - распространением, диагностикой, путями передачи, эпизоотологией, эпидемиологией и другими занимались многие исследователи [1, 4-5, 7-8].
Для обнаружения дирофиляриоза собак используют неспецифические клинико-лабораторные методы и специфические методы. В клинической практике в последнее время в мире активно используют иммунодиагностические тесты на основе ИФА (ELISA). В России этот метод не получил пока широкого распространения из-за недостатка недорогих отечественных наборов на основе иммуноферментных тест-систем. Поэтому их разработку следует признать актуальной задачей. Тем более, что иммунодиагностические методы могут использоваться не только для постановки диагноза и предупреждения заболевания, но и установления истинного уровня распространения дирофиляриоза животных и людей в ходе мониторинговых исследований.
Диагностическая эффективность иммунологических реакций зависит от качественного состава используемых антигенов, поэтому выделение диагностически значимых антигенных компонентов является определяющим при разработке иммунотестов. Исходя из этого, мы приготовили экстракт из половозрелых Dirofilaria repens и провели его гель-хроматографию с целью разделения на фракции.
Материалы и методы. Экстракт готовили из половозрелых гельминтов D.repens (самки и самцы, 1/1) по методике, описанной в патенте [3]. Концентрацию белка в экстракте и полученных фракциях измеряли на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 280 нм.
Фракционирование соматического экстракта из дирофилярий проводили гель-хроматографией на колонке (Pharmacia) размером 16x70 мм, заполненной Superóse 12 Prep Grade и уравновешенной растворами натрия фосфата, натрия хлорида pH 7,0; и бромонитродиоксана. Фракции собирали по 2,8-3 мл в пробирку, а содержание белка в них контролировали на детекторе Uvicord S II (Pharmacia).
Концентрации и параметры для тест-системы на основе ИФА отрабатывали в предварительных опытах с использованием референс-сывороток от больных и здоровых собак. Антигенную активность полученных фракций устанавливали с
зоо
помощью иммуноферментной реакции (ИФР), также с референс-сыворотками от собак больных D.repens, здоровых и с гетерологичной инвазией [6].
Результаты. Исходная концентрация в экстракте D.repens составила 8,6 мг/мл. В процессе гель-хроматографии, получили 99 фракций с содержанием белка от 8,2 мкг/мл до 204 мкг/мл, вышедших в процессе хроматографии в виде 4 пиков. Антигенную активность определяли в ИФР по разнице оптической плотности (ОП) между референс-сыворотками [2]. Большинство фракций, в антигенном отношении, не представляли интереса, т. к. разница их ОП была незначительна, другая же часть фракций бала недостаточно специфичной и реагировала с большинством сывороток собак из группы с гетерологичной патологией. Наибольший интерес в диагностическом плане представляли четыре фракции, которые и были использованы в дальнейших исследованиях по оценке их диагностической эффективности.
Исследования проводили, используя ИФР, с сыворотками 54 собак: в их числе -14 проб сывороток собак, инвазированных дирофиляриями, 3 - дирофиляриями и другими гельминтами; 5 - от собак, зараженных бабезиями; 1 - токсокарами и трихурисами; 7 - от собак с непаразитарной патологией и 24 - от клинически здоровых животных. Чувствительность ИФР с фракционированным соматическим антигеном из половозрелых D.repens составила 76,47%, т.к. было получено 4 ложноотрицательных ответа из группы собак с дирофиляриозом. При определении специфичности мы учитывали результаты со всеми сыворотками собак с гетерологичной инвазией, клинически здоровых и с непаразитарной патологией в количестве 37 проб. В результате установили 6 ложноположительных ответов и специфичность составила 83,78%.
Таким образом, фракционированный соматический антиген из половозрелых дирофилярий вида D.repens имеет в своем составе как специфические антигенные компоненты, так и близкие по структуре антигенные дететминанты других инвазий и патологий, поэтому какая-то часть их может распознаваться сыворотками животных с разными патологиями.
Заключение. Чувствительность полученного фракционированного соматического антигена из половозрелых дирофилярий вида D.repens в этом опыте составила 76,47%; специфичность - 88,78%. Данный антиген может применяться для прижизненной диагностики дирофиляриоза с использованием иммуноферментного анализа.
Литература: 1.Архипова Д.Р., Архипов И.А. II Тр. Всер.ин-та гелминтол. -2004.-Т.40.-С. 18-22. 2.Бережко В.К., Написанова Л.А., Медведев А.Ю. и др.//Российская сельскохозяйственная наука.-2014.-1.-С. 71-74. З.Бережко В.К., Написанова Л.А., Хайдаров К.А., Ястреб В.Б., Медведев А.Ю. Способ получения антигена из сетарий для диагностики дирофиляриоза собак. - Патент на изобретение RUS 2487722, 12.07.2011-Бюл. №20,- 2013. 4.Бескровная Ю. Г., Нагорный С.А.//С6. мат. науч. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями».-М-2008.-Вып. 9.-С. 73-75. 5.Криворотова Е.Ю., Нагорный С.А.//Там же,- М - 2011-Вып. 12.-С.253-254. б.Написанова Л.А.: Автореф. дис. ... канд. биол. наук/ВИГИС-М.-2004.-24с. 7.Написанова Л.А., Бережко В.К., Хайдаров К.А., Медведев
301
А.Ю.//С6. мат. науч. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями».-М.-2008,- Вып. 9,- С. 320-322. 8.Ястреб В .Б .//Там же.-М.-2004.-Вып. 5.-С.443-445.
Immunodiagnosis of Dirofilaria repens infection among dogs using the fractionated somatic antigen. Napisanova L.A. All-Russian K.I. Skryabin Scientific Research Institute ofFundamental and Applied Parasitology of Animals and Plants.
Summary. One performed investigations on immunodiagnosis of D. repens infection in dogs using the fractionated somatic antigen. The sensitivity of the fractionated somatic antigen recovered from mature D.repens was 76,47%; specificity appeared to be 88,78%. That antigen could be used for vital diagnosis of Dirofilaria infection using an enzyme immunoassay.
