CC BY
14
УДК 636.5:612.017
ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЙ СТАТУС У ДОМАШНИХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ КОМПЛЕКСНОГО ПРЕПАРАТА, ПОЛУЧЕННОГО ИЗ ОТХОДОВ БИОЛОГИЧЕСКОГО ПРОИЗВОДСТВА
СЕИН ОБ.,
доктор биологических наук, профессор, профессор кафедры хирургии и терапии, ФГБОУ ВО Курская ГСХА, тел. 53-15-55.
СУББОТИНА Н.Н.,
аспирант кафедры хирургии и терапии, ФГБОУ ВО Курская ГСХА, тел. 53-15-55.
Реферат. В статье приводится технология получения препарата для стимуляции неспецифической резистентности и обмена веществ у животных (Патент РФ №2473340. - Авт. Сеин О.Б. и др.). Данный препарат включает в свой состав янтарную кислоту, тканевый препарат АСД Ф-2 (антисептик-стимулятор Дорогова фракция 2), нуклеинат натрия, отходы биологической промышленности, полученные после культивирования перепелиных фибробластов на первичной культуральной среде МЕМ (минимальная среда Игла), синтетическую среду 199 и сыворотку крови крупного рогатого скота. Биохимический анализ используемых отходов биологического производства показал, что в их состав входят незаменимые и заменимые аминокислоты, комплекс минеральных компонентов, глюкоза, витамины, а так же продукты метаболизма культивируемых клеток, участвующих в регуляции метаболизма. Проверка полученного препарата на лабораторных животных подтвердила его безвредность и малотоксичность. Результаты научно-производственной апробации препарата на овцах свидетельствуют о том, что он обладает выраженным иммунностимулирующим действием. После его внутримышечного введения в дозе 3,0 мл/гол один раз в день трёхкратно с интервалом 3 дня в крови овец достоверно (р<0,05) повышалось содержание лейкоцитов, B-лимфоцитов и общих иммуноглобулинов, а также была выше бактерицидная, лизосомная и фагоцитарная активность крови по сравнению с контрольными животными. По мнению авторов, указанные изменения связаны с включением в состав изготовленного препарата иммуностимулятора нуклеината натрия, а также с продуктами метаболизма культивируемых клеток, которые также обладают иммуностимулирующим действием. Разработанный способ получения биостимулирующего препарата не требует квалифицированного обеспечения, дорогостоящего оборудования и дефицитных реактивов. Полученный препарат можно рекомендовать к использованию в практике ветеринарной медицины с целью профилактики иммунодефицитов и повышения естественной резистентности.
Ключевые слова: иммунобиологический статус, отходы биологического производства, комплексный препарат, кровь, биохимические показатели, лабораторные животные, овцы, биологическая стимуляция.
IMMUNOBIOLOGICAL STATUS IN DOMESTIC ANIMALS WHEN USING A COMPLEX PREPARATION OBTAINED FROM BIOLOGICAL WASTE
SEIN O.B.,
Doctor of Biological Sciences, Professor, Professor of the Department of Surgery and Therapy, Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education Kursk State Agricultural Academy, tel. 53-15-55.
SUBBOTINA N.N.,
postgraduate student of the Department of Surgery and Therapy, Kursk State Agricultural Academy, tel. 53-15-55.
Essay. The article provides a technology for obtaining a drug for stimulating nonspecific resistance and metabolism in animals (RF Patent No. 2473340. - Author Sein O.B. and others). This preparation includes succinic acid, tissue preparation ASD F-2 (Dorogov's antiseptic stimulator fraction 2), sodium nucleinate, biological industry waste obtained after cultivating quail fibroblasts on the primary culture
medium MEM (Eagle's minimum medium), synthetic medium 199 and bovine serum. Biochemical analysis of biological production waste used showed that they contain essential and non-essential ami-no acids, a complex of mineral components, glucose, vitamins, as well as metabolic products of cultivated cells involved in the regulation of metabolism. Testing of the resulting drug on laboratory animals confirmed its harmlessness and low toxicity. The results of scientific and industrial testing of the drug on sheep indicate that it has a pronounced immune-stimulating effect. After its intramuscular injection at a dose of 3.0 ml/head once a day three times with an interval of 3 days in the blood of sheep, the content of leukocytes, B-lymphocytes and total immunoglobulins significantly (p<0.05) increased, and bactericidal, lysosomal and phagocytic activity of blood compared with control animals. According to the authors, these changes are associated with the inclusion of sodium nucleinate in the composition of the manufactured immunostimulant preparation, as well as with metabolic products of cultured cells, which also have an immunostimulating effect. The developed method for obtaining a biostimulating drug does not require qualified support, expensive equipment and scarce reagents. The resulting drug can be recommended for use in the practice of veterinary medicine in order to prevent immunodeficiencies and increase natural resistance.
Keywords: immunobiological status, biological production waste, complex preparation, blood, biochemical parameters, laboratory animals, sheep, biological stimulation.
Введение. В процессе развития организм животных подвергается постоянному воздействию самых различных фактором внешней среды, к которым можно отнести природно-климатические условия, микроклимат животноводческих помещений, качество и полноценность рационов. Поэтому создание для животных благоприятных условий содержания, которые отвечали бы их биологическим особенностям, является одним из основных моментов повышения продуктивности животных, а также формирования высокой устойчивости к воздействию неблагоприятных фактором внешней среды. При этом значение естественной резистентности, необходимость профилактики инфекционных и незаразных заболеваний неизмеримо возрастает по мере интенсификации животноводства и увеличения концентрации животных [1, 2, 3].
В настоящее время в практике ветеринарной медицины широко используются различных иммуномодуляторы. Преимущественно это препараты тканевого, микробного и синтетического происхождения, которые отличаются по механизму действия. В основном они направлены на иммунологическую активацию иммунокомпетентных клеток-макрофагов различных субпопуляций и гуморальных факторов иммунной системы [4, 5, 6, 8].
С использованием иммуномодуляторов можно профилактировать и лечить заболевания у животных как инфекционной, так и незаразной этиологии [3, 7]. Важное значение иммуномодуляторы приобретают при выращивании молодняка, когда под действием различных стресс-факторов у животных часто
отмечается снижение резистентности и массовое проявление иммунодефицитов [3, 4]. В этой связи разработка и производство новых препаратов и способов, повышающих естественные факторы защиты организма у сельскохозяйственных животных, являются актуальной.
Материал и методы исследований. Экспериментальная часть работы состояла из двух этапов. Во время первого этапа был получен биологически активный препарат по разработанному нами способу (Патент РФ на изобретение №2473340. Авт. Сеин О.Б. и др.). Второй этап работы был посвящён апробации изготовленного препарата на лабораторных животных и овцах.
Исследования проводились в условиях кафедры хирургии и терапии и ветеринарной клиники Курской государственной сельскохозяйственной академии имени И.И. Иванова по общей схеме, предоставленной на рисунке 1.
В период проведения экспериментов осуществляли регулярное наблюдение за подопытными животными и устанавливали общие клинические показатели. У всех животных брали кровь с использованием вакуумных пробирок до и после применения препарата. В крови определяли общие гематологические параметры (скорость оседания эритроцитов, гематокрит, эритроциты, лейкоциты, гемоглобин). Биохимический анализ крови включал исследование содержания общего белка, белковых фракций, общего кальция, неорганического фосфора, глюкозы, ферментативную ак-втивность аминотрансфераз (АСТ, АЛТ), малонового диальдегида (МДА) [9].
Рисунок 1 - Общая схема исследований
Для исследования общих гематологических и биохимических показателей использовали общепринятые методики, биохимические наборы реактивов «Био-Ла-Тест» фирма «Ла-хема» (Чехия), «КлиниТест» (Россия) и автоматический биохимический анализатор ILAB-650.
Содержание иммуноглобулинов определяли цинксульфатным методом. Фагоцитарную активность нейтрофилов исследовали с использованием убитой культуры Staphylococcus aureus. Лизоцимную активность сыворотки крови устанавливали калориметрически с культурой клеток Micrococcus lysodecticus. Бактериальную активность сыворотки крови определяли с использованием культуры Staphylococcus aureus. T- и B-лимфоциты в крови подопытных животных исследовали методом реакции спонтанного розеткообразова-ния.
Полученные в ходе проведения экспериментов данные подверглись биометрической обработке (Рокицкий П.Р., 1973) с использованием ПЭВМ.
Результаты исследования. Для получения комплексного препарата смешивали янтарную кислоту, тканевый препарат АСД-2 (антисептик стимулятор Дорогова второй фракции), нуклеинат натрий и отходы биологической промышленности полученные после культивирования перепелиных фибробластов.
Использование указанных компонентов было обосновано их биологическими свойствами. В частности янтарная кислота является катализатором биоэнергетических процессов, обладает антиоксидантным действием, обезвреживает свободные радикалы, предотвращает разрушение эритроцитов, укрепляет иммунитет, участвует в нейтрализации токсинов, активирует ряд важнейших ферментов.
Включение в состав препарата нуклеината натрия значительно повышает его иммуностимулирующие свойства. Неклеинат натрия индуцирует лейкоцитарную реакцию, стимулирует гемопоэз, внутриклеточный метаболизм и нуклеиновый обмен. Он обладает активностью поликлонального иммуномодуля-тора, регулирует миграцию ^лимфоцитов и
процесс кооперации T- и B-лимфоцитов, стимулирует фагоцитарную активность макрофагов и продукцию факторов неспецифической защиты организма, особенно при иммуноде-фицитах [9].
Включение в комплексный препарат антисептика-стимулятора Дорогова Ф-2 способствует повышению тканевых ферментов: транспортной Na+ , К+ АТФ -азы, рибонуклеазы, щелочной фосфатазы, которые участвуют в активном транспорте ионов и питательных веществ через клеточные мембраны и в процессах фосфорилирования. Помимо этого стимулятор АСД Ф-2 улучшает трофику тканей, повышает уровень обменных процессов в здоровом организме и способствует восстановлению обмена до нормы при различных дистрофических состояниях.
Используемые при изготовлении комплексного препарата отходы биологической промышленности представляют собой субстрат, который получают после культивирования клеток в частности перепелиных фиб-робластов, в технологических условиях биофабрик. При культивировании клеток используется первичная культуральная среда, включающая синтетическую среду MEM (минимальная среда Игла), синтетическую среду 199 и сыворотку крови крупного рогатого скота. Данные среды содержат комплекс аминокислот, минеральных и витаминных компонентов в соотношениях, обеспечивающих оптимальный рост культуры клеток. После процесса культивирования в жидких отходах указанные вещества остаются практически в прежнем количестве и соотношениях. Помимо перечисленных выше компонентов, отходы культурального производства включают биологические продукты жизнедеятельности культивируемых клеток, которые выполняют роль естественных биостимуляторов [9].
Исследование биохимического состава отходов, полученных после культивирования клеток перепелиных фибробластов при производстве вакцины Марека в условиях Курской биофабрики показало, что отходы содержат комплекс биохимических компонентов, которые соответствуют компонентам первичной культуральной среде. При этом в процессе культивирования клетки продуцируют биохимические и биологически активные вещества, поступающие в окружающую среду, что повышает биологическую ценность отходов культурального производства.
Биохимический анализ отходов биологического производства, полученных при культивировании перепелиных фибробластов показал, что в их состав входят аминокислоты, в том числе незаменимые (аргинин, валин, лизин, треонин, гистидин, метионин, фенилала-нин). Из минеральных компонентов в отходах содержатся кальций, фосфор, магний, калий, натрий, хлориды. Отходы включают в свой состав также углеводы, которые представлены глюкозой, и комплекс витаминов (ретинол, тиамин, кальциферол, рибофлавин, аскорбиновая и пантотеновая кислоты). Отходы биологического производства, полученные при культивировании перепелиных фибробластов, ценны не только комплексом биохимических веществ, входящих в их состав, но и оптимальным соотношением этих веществ, что способствует их поступлению в организм после введения. Внешне отходы культурального производства представляют собой стерильную прозрачную жидкость розового цвета, без запаха.
Для получения 1 л комплексного биологически-активного препарата в стерильную стеклянную емкость последовательно вносили 6-7 г янтарной кислоты, 20-25 г нуклеината натрия, 30-35 мл АСД Ф-2 и доводили объем до 1 л добавлением отходов биологического производства, полученных при культивировании перепелиных фибробластов. При этом для обеспечения стерильности порошкообразные янтарную кислоту и нуклеинат натрия предварительно подвергали ультрафиолетовому облучению УФ - лампой ПРК-2, в течение 20-30 мин.
Выбранные количества янтарной кислоты, нуклеината натрия и АСД Ф-2, входящих в препарат, было определено опытным путем и обосновано тем, что данное соотношение компонентов обеспечивает синергетический эффект при внутримышечном введение препарата. При уменьшении нуклеината натрия (менее 20-25 г) снижается иммуностимулирующие свойства препарата, а уменьшение янтарной кислоты (менее 10-15 г) и АСД Ф - 2 (менее 30-35 мл) сопровождается снижением ростостимулирующего действия препарата. Увеличение указанных компонентов выше верхних значений не оказывало существенных изменений свойств препарата.
Изготовленный препарат представлял собой прозрачную жидкость светло желтого цвета, со слабым специфическим запахом и
рН 6,8-7,0. Расфасовывали препарат во флаконы из темного стекла емкостью по 50 или 100 мл, которые закрывали резиновыми пробками и обкатывали алюминиевыми колпачками.
Общие свойства и стабильность препарата определяли согласно положениям Государственной фармакопеи. Критериями служили такие параметры, как внешний вид, прозрачность, окраска, токсичность, отсутствие механических включений.
Сроки хранения препарата определяли методом «ускоренного старения», а также путем длительного хранения, для чего экспериментальные образцы были заложены на хранение при комнатной температуре и в холодильнике при 4-8°С. Каждые 3 месяца проводилась проверка препарата на бактериальную загрязненность с использованием сред Эндо и МПА. Проверка показала, что при хранении исходные параметры препарата остаются без существенных изменений в течение 12 мес.
Исследование препарата на пирогенность проводили на 10 здоровых кроликах (5 самок, 5 самцов) с массой тела 2,4±0,11 кг. Все кролики находились в стереотипных условиях и получали одинаковый рацион.
Изготовленный препарат вводили кроликам в ушную вену в дозе 1 мл/кг. До и после введения препарата у кроликов измеряли температуру тела и брали кровь через 1, 3 и 6 часов.
Было установлено, что после введения препарата повышение суммарного показателя температуры тела у 10 подопытных кроликов находилось в пределах физиологических норм. Увеличение содержания лейкоцитов после введения препарата по сравнению с фоновыми значениями было недостоверным ф>0,05). Проведенные исследования показали, что изготовленный препарат является апи-рогенным.
Местное действие препарата на слизистые оболочки определяли путем его однократного внесения в конъюнктивальный мешок кроликов в количестве 1 -2 капель. С этой целью оттягивали внутренний угол конъюнктивального мешка и вносили препарат, а затем в течение 1 мин зажимали слезно-носовой канал и наблюдали за поведением кроликов. В первые 1 -2 часа отмечалась слабая гиперемия конъюнктивы, после чего она исчезала. Других изменений выявлено не было.
Острую токсичность изготовленного препарата определяли на 60 беспородных мышах,
30 морских свинках и 10 кроликах, которые содержались в условиях вивария и ветеринарной клиники Курской государственной сельскохозяйственной академии имени И.И. Иванова.
Препарат вводили внутримышечно, а также внутрижелудочно с использованием шприца с резиновой насадкой. После введения препарата за опытными животными наблюдали в течение 10 суток, отмечая время наступления токсикоза. Среднесмертельную дозу (LD50) рассчитывали по формуле Кербера, а ее среднюю ошибку - по формуле Гаддэма. В процессе эксперимента учитывали общее состояние животных, особенности их поведения, интенсивность и характер двигательной активности, тонус скелетной мускулатуры, реакцию на тактильные, звуковые и световые раздражители. Исследования LD50 показали, что изготовленный препарат относится к малотоксичным соединениям.
Хроническую токсичность устанавливали на 20 белых мышах, 20 крысах и 10 кроликах. Препарат вводили подкожно в течение 30 дней с интервалом одни сутки в дозе, составляющей 1/3 дозы, испытанной в остром опыте. Длительное применение препарата не вызывало гибели животных и не сопровождалось клиническими изменениями за весь период наблюдений.
Анафилактогенность препарата исследовали на 20 морских свинках, которым в правую ушную раковину внутрикожно инъецировали по 0,1 мл изготовленного препарата. Контрольным свинкам вводили стерильный изотонический раствор натрия хлорида (физраствор). Через 12 дней в конъюнктивальный мешок правого глаза закапывали по одной капле препарата. Одновременно свинкам суб-плантарно в правые лапки вводили по 0,1 мл препарата. При оценке реакции учитывали воспаление конъюнктивы и наличие отека лап. После введение препарата у подопытных лабораторных животных не наблюдалось аллергической реакции, что свидетельствует об отсутствие в изготовленном препарате гетерогенного белка.
Во втором эксперименте изучали иммуностимулирующие свойства изготовленного препарата. Исследования проводили на овцах романовской породы, которые содержались в условиях ветеринарной клиники.
Таблица 1 - Иммунологические показатели у овец после введения изготовленного препарата и препарата-прототипа ___
Показатели До введения препарата Через 5 дней Через 10 дней
1 группа (изготовленный препарат)
Лейкоциты, , х109/л 7,0±0,11 8,1±0,18*^ 8,3±0,17*ф
БАСК, % 32,5±0,83 34,7±0,64 36,7±0,71*^
ЛАСК, % 14,4±0,14 16,2±0,19*^ 17,5±0,21*^
ФАЛ, % 21,5±0,43 23,8±0,44*^ 26,0±0,30*^
B-лимфоциты 20,5±0,10 21,5±0,20 22,7±0,18*^
^лимфоциты 49,7±1,11 51,9±2,45 53,0±1,11**
Общие иммуноглобулины, мг/л 18,3±0,27 19,9±0,29*^ 20,5±0,26*^
2 группа (препарат-прототип)
Лейкоциты, , х109/л 6,8±0,09 7,9±0,18** 8,1±0,25*
БАСК, % 34,5±0,86 34,4±0,76 35,3±0,56*
ЛАСК, % 13,6±0,21 14,9±0,16* 15,4±0,21*
ФАЛ, % 21,7±0,28 23,3±0,30*^ 24,8±0,25*
B-лимфоциты 20,4±0,44 21,1±0,55 22,0±0,77
^лимфоциты 48,5±1,35 50,8±2,10 51,9±2,19
Общие иммуноглобулины, мг/л 18,2±0,28 18,9±0,33 19,8±0,16
3 группа (контрольная)
Лейкоциты, , х109/л 7,5±0,15 7,1±0,16 7,3±0,25
БАСК, % 33,8±1,07 33,1±0,65 33,5±0,97
ЛАСК, % 14,1±0,18 13,7±0,34 14,2±0,51
ФАЛ, % 22,0±0,46 21,4±0,45 20,4±0,49*
B-лимфоциты 21,1±0,51 20,0±0,22 21,0±0,16
^лимфоциты 50,3±1,11 49,8±1,86 50,4±0,89
Общие иммуноглобулины, мг/л 18,6±0,39 18,1±0,37 18,7±0,45
Примечание: * - при p<0,05 по сравнению с соответствующими показателями до введения препарата; • - при p<0,05 по сравнению с контролем
Было сформировано три группы. Овцам 1 группы внутримышечно инъецировали изготовленный препарат в дозе 3,0 мл/гол один раз в день трехкратно с интервалом 3 дня. Овцам 2 группы вводили препарат-прототип [10] в дозе 3,0 мл/гол в той же последовательности, что и животным 1 группы. Овцы 3 группы являлись контрольными, им вводили 3,0 мл/гол стерильного изотонического раствора хлорида натрия. Содержание и кормление овец всех групп было одинаковым.
В ходе проведенных исследований было установлено, что изготовленный препарат обладает выраженным иммуностимулирующим действием, которое превосходило по многим параметрам препарат-прототип (таблица 1). Так, в крови овец 1 группы содержание лей-
коцитов, В-лимфоцитов и общих иммуноглобулинов было достоверно ф<0,05) больше, а бактерицидная, лизоцимная и фагоцитарная активность крови выше, чем у овец 2 и 3 группы. Это связано с включением в состав изготовленного препарата иммуностимулятора нуклеоната натрия, а также с продуктами метаболизма культивируемых клеток, которые также обладают иммуностимулирующим действием.
Заключение. Проведённые исследования на разных видах животных показали, что разработанный способ позволяет получить препарат обладающий выраженным стимулирующим действием на иммунологический и биохимический статус животных. При использовании способа не требуется квалифицированного обеспечения, дорогостоящего и
дефицитного оборудования. Компоненты, входящие в состав препарата, легкодоступные, имеют небольшую стоимость. Всё это
позволяет использовать разработанный способ в условиях производственных отделов ветеринарных лабораторий.
Список использованных источников
1. Герберт У.Д. Ветеринарная иммунология. - М.: Колос, 1974. - 311 с.
2. Карпуть И.М. Иммунология и иммунопатология болезней молодняка. - Минск: Ураджай, 1993. - 288 с.
3. Шахов А.Г. Этиология и профилактика желудочно-кишечных и респираторных болезней телят и поросят // Ветеринарный консультант. - 2003. - №1. - С.11-13.
4. Шахов А.Г., Ануфриев А., Ануфриев П.А. Факторные инфекции свиней // Животноводство России. Спец. Выпуск по свиноводству. - 2005. - С.24-27.
5. Бакшеев А.Ф., Ефанов Н.В., Смирнов П.Н. и др. Иммунология свиньи. - Новосибирск, 2003. - 143 с.
6. Федоров Ю.Н. Иммунопрофилактика болезней новорождённых телят // Ветеринария. -1996. - №11. - С.3-6.
7. Попов В.С., Самбуров Н.В., Воробьёва Н.В. Коррекция метаболизма у свиней с применением иммунобиологических препаратов и кормовых средств. - Курск: Изд-во Курск. гос. с.-х. ак., - 2014. - 200 с.
8. Евглевский А.А. и др. Патент РФ №2237485. - 2004. Способ получения препарата для повышения резистентности организма животных.
9. Сеин О.Б. и др. Патент РФ №2473340. - 2013. Способ получения препарата для стимуляции неспецифической резистентности и обмена веществ у животных.
10. Лебедев А.Ф. и др. Патент РФ № 2303979. - 2007. Способ получения препарата «Янтарный биостимулятор» для повышения резистентности организма животных.
Spisok ispoFzovanny'x istochnikov
1. Gerbert U.D. Veterinarnaya immunologiya. - M.: Kolos, 1974. - 311 s.
2. Karput I.M. Immunologiya i immunopatologiya boleznej molodnyaka. - Minsk: Uradzhaj, 1993. - 288 s.
3. Shaxov A.G. E'tiologiya i profilaktika zheludochno-kishechny'x i respiratorny'x boleznej telyat i porosyat // Veterinarny'j konsuFtant. - 2003. - №1. - S.11-13.
4. Shaxov A.G., Anufriev A., Anufriev P.A. Faktorny'e infekcii svinej // Zhivotnovodstvo Rossii. Specz. Vy'pusk po svinovodstvu. - 2005. - S.24-27.
5. Baksheev A.F., Efanov N.V., Smirnov P.N. i dr. Immunologiya svin'i. - Novosibirsk, 2003. -143 s.
6. Fedorov Yu.N. Immunoprofilaktika boleznej novorozhdyonny'x telyat // Veterinariya. - 1996. - №11. - S.3-6.
7. Popov V.S., Samburov N.V., Vorob'yova N.V. Korrekciya metabolizma u svinej s prime-neniem immunobiologicheskix preparatov i kormovy'x sredstv. - Kursk: Izd-vo Kursk. gos. s.-x. ak., -2014. - 200 s.
8. Evglevskij A.A. i dr. Patent RF №2237485. - 2004. Sposob polucheniya preparata dlya povy'sheniya rezistentnosti organizma zhivotny'x.
9. Sein O.B. i dr. Patent RF №2473340. - 2013. Sposob polucheniya preparata dlya stimulyacii nespecificheskoj rezistentnosti i obmena veshhestv u zhivotny'x.
10. Lebedev A.F. i dr. Patent RF № 2303979. - 2007. Sposob polucheniya preparata «Yantar-ny'j biostimulyator» dlya povy'sheniya rezistentnosti organizma zhivotny'x.
