CC BY
26© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
Е.М.Зайцев1, А.В.Поддубиков1, М.В.Брицина1, Н.У.Мерцалова1, М.Н.Озерецковская1, И.Г.Бажанова1, Н.Г.Плеханова2
ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЛИПОПОЛИСАХАРИДА BORDETELLA PERTUSSIS В СОСТАВЕ БЕСКЛЕТОЧНОЙ КОКЛЮШНОЙ ВАКЦИНЫ
1НИИ вакци и сывороток им. И.И.Мечникова, Москва; 2Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт
Цель. Исследование иммунобиологических свойств липополисахарида (ЛПС) Bordetella pertussis в составе бесклеточной коклюшной вакцины. Материалы и методы. Использовали экспериментальные серии бесклеточной коклюшной вакцины (БКВ), лиофилизирован-ный липополисахарид (ЛПС). Титр антител к ЛПС в сыворотках мышей оценивали с помощью ИФА с использованием пероксидазных коньюгатов антивидовых антител к IgG мышей. Активность ЛПС в препаратах комплекса антигенов B. pertussis определяли в количественном хромогенном ЛАЛ-тесте по конечной точке. Защитную активность БКВ определяли в тесте на мышах при интрацеребральном заражении вирулентной культурой В. рertussis штамм № 18323. Безопасность БКВ определяли в тесте изменения массы тела мышей. Результаты. Наличие ЛПС в составе БКВ было показано в иммуноэлектрофоре-зе с очищенным препаратом ЛПС В. рertussis в качестве контроля. Обработка формалином изменила иммунохимические свойства ЛПС БКВ, что привело к смещению полосы преципитации с коклюшной агглютинирующей сывороткой из стартовой зоны в катодную. В супернатантах коклюшных культур количество ЛПС составляло в среднем 49050±6774 ед. эндотоксина/мл (ЕЭ/мл). В препаратах БКВ количество ЛПС составляло в среднем 906±90 ЕЭ/ мл, т.е. снижалось более чем в 50 раз. В ИФА показано нарастание титров антител к ЛПС В. рertussis в сыворотках мышей после иммунизации БКВ, что свидетельствовало о наличии его в иммуногенной форме в составе комплексного препарата. Проведенные доклинические испытания показали протективную активность и специфическую безопасность экспериментальных серий БКВ. Заключение. Обезвреженный формалином препарат БКВ представляет собой комплекс белковых антигенов в ассоциации с ЛПС. Обработка формалином приводит к модификации молекулы ЛПС, сохраняющей антигенные свойства, но значительно менее токсичной.
Журн. микробиол., 2014, № 1, С. 20—24
Ключевые слова: Bordetella pertussis, бесклеточная коклюшная вакцина, липополисахарид, иммуногенность, безвредность
E.M.Zaitsev1, A.V.Poddubikov1, M.V.Britsina1, N.U.Mertsalova1, M.N.Ozeretskovskaya1, I.G.Bazhanova1, N.G.Plekhanova2
IMMUNOBIOLOGICAL PROPERTIES OF BORDETELLA PERTUSSIS LIPOPOLY-SACCHARIDE IN THE ACELLULAR PERTUSSIS VACCINE
1Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, ^Volgograd Research Institute of Plague Control, Russia
Aim. Study of Bordetella pertussis lipopolysaccharide (LPS) immunobiological properties in the acellular pertussis vaccine. Materials and methods. Experimental series of acellular pertussis vaccines (APV), lyophilized LPS were used. Antibody titers against LPS in mice sera were evaluated by using EIA with peroxidase conjugate of anti-species antibodies against mice IgG. LPS activity in B. pertussis antigen complex preparations was determined in quantitative chromogenic LAL-test by end point. APV protective activity was determined in mice test during intracerebral infection by B. pertussis strain No. 18323 virulent culture. APV safety was determined in the mice body weight change test. Results. The presence of LPS in APV was shown in immune electrophoresis with purified B. pertussis LPS preparation as a control. Formalin treatment changes immunochemical properties of APV LPS that lead to the shift of precipitation bands with pertussis ag-
glutinating sera from the start zone into cathode. The quantity of LPS in pertussis culture supernatants was on average 49050+6774 endotoxin units per ml (EU/ml). In APV preparations the quantity of LPS was on average 906+90 EU/ml, i.e. decreased by more than 50 times. An increase of antibody titers against B. pertussis LPS in mice sera after the APV immunization was shown in EIA, which gives evidence of its presence in immunogenic form in the complex preparations. The preclinical studies carried out show protective activity and specific safety of the experimental APV series. Conclusion. Formalin-neutralized APV preparation is a complex ofprotein antigens in association with LPS. Formalin treatment results in modification of LPS molecule that retains antigenic properties but is significantly less toxic.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2014, No. 1, P. 20-24
Key words: Bordetella pertussis, acellular pertussis vaccine, lipopolysaccharide, immunogenicity, safety
ВВЕДЕНИЕ
Успехи в области вакцинопрофилактики коклюша обеспечили контроль над этой инфекцией. Тем не менее, коклюш продолжает оставаться актуальной проблемой здравоохранения. Заболеваемость коклюшем сохраняет эпидемический характер с периодическими вспышками. Основные причины — недостаточный охват детского населения и отсутствие вакцин для профилактики коклюша у взрослых, что обусловлено относительно высокой реактогенностью АКДС вакцины с цельноклеточным коклюшным компонентом. Во многих странах разработаны и разрабатываются менее реактогенные вакцины с бесклеточным коклюшным компонентом. Существуют различные подходы к конструированию БКВ: сведение очищенных антигенов, использование комплексов протективных антигенов B. pertussis. При конструировании коклюшных вакцин наибольшее значение придается коклюшному токсину. Однако признано, что другие антигены B. pertussis также могут быть протективными. В частности, включение в состав вакцин филаментозного гемагглютинина, пертактина и фимбрий способствовало повышению эффективности препаратов. Предполагается, что наибольший протектив-ный эффект могут обеспечить вакцины, создающие иммунитет, близкий к естественному, формируемому при инфицировании B. pertussis. Определенная роль отводится ЛПС, являющемуся структурным компонентом клеточной стенки возбудителя коклюша. С ЛПС связывают реактогенность цельноклеточных коклюшных вакцин. С другой стороны, ЛПС является адъювантом, а также может иметь значение в защите от коклюшной инфекции. В связи с этим, предполагается, что включение ЛПС или аналогов ЛПС в нетоксичной форме в состав вакцин может повысить их иммуногенность [5].
В НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН разработан способ получения бесклеточной коклюшной вакцины, представляющей собой нативный комплекс антигенов возбудителя коклюша, содержащий наряду с белковыми антигенами определенное количество ЛПС [1].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Использованы экспериментальные серии БКВ, лиофильно высушенный ли-пополисахарид коклюшного микроба, полученный по методу Westphal O. [9].
В работе использованы мыши-гибриды F1(CBA/C57BL6) массой 12 — 14 и 14 — 16 г. Титры антител к ЛПС в сыворотках мышей, иммунизированных БКВ вну-трибрюшинно трехкратно в дозе 25 мкг белка оценивали на 14, 28 и 42 сутки после иммунизации с помощью твердофазного ИФА с использованием пероксидазных коньюгатов антивидовых антител к IgG мышей.
Иммуноэлектрофорез (ИЭФ) проводили в 1% геле агарозы в веронал -
мединаловом буфере (рН 8,6). В опытах использовали коклюшную агглютинирующую сыворотку (КАС) производства НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи.
Активность липополисахарида в препаратах комплекса антигенов B. pertussis определяли в количественном хромогенном ЛАЛ-тесте по конечной точке с использованием наборов фирмы «СатЬгех» (США).
Защитные свойства БКВ изучали на модели развития менингоэнцефалита у мышей, зараженных нейротропной вирулентной культурой B.pertussis штамм № 1832. Количество международных защитных единиц (МЗЕ) в 1,0 мл испытуемого препарата расчитывали по методу Вильсона — Вустера.
Безопасность БКВ определяли в тесте изменения массы тела мышей. Вакцину вводили внутрибрюшинно однократно в дозе 25 мкг белка (предполагаемая иммунизирующая доза для человека) в объеме 0,5 мл. Контролем были животные, которым вводили внутрибрюшинно по 0,5 мл физиологического раствора. Наблюдение за животными проводили в течение 7 суток, регистрируя массу тела и гибель мышей.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Результаты исследований показали наличие дуги преципитации в стартовой зоне на иммуноэлектрофореграммах комплекса антигенов до детоксикации, что свидетельствовало о присутствии в их составе электрически нейтрального компонента — липополисахарида. Наличие этого компонента в составе препаратов было подтверждено в ИЭФ с очищенным препаратом ЛПС В. рertussis, который формировал с коклюшной агглютинирующей сывороткой дугу преципитации в стартовой зоне геля (рис., слева). При этом дуги преципитации ЛПС соответствовали дугам преципитации комплекса антигенов В. рertussis в стартовой зоне геля.
Профили дуг преципитации обезвреженных формалином препаратов комплекса коклюшных антигенов отличались от профилей дуг преципитации не обезвреженных препаратов. Не обезвреженные препараты формировали три основные группы дуг преципитации: в анодной, стартовой и катодной зонах. Обезвреженные препараты преципитировали только в анодной зоне (рис., справа).
Таким образом, обработка формалином приводила к изменению заряда компонентов не обезвреженного препарата, преципитировавших в анодной и катодной зонах, и к смещению их в анодную зону геля.
По данным ЛАЛ-теста, в супернатантах коклюшных культур активность ЛПС + 1 - +
а
Иммуноэлектрофореграмма БКВ до (слева) и после обезвреживания препарата формалином (справа).
Слева: траншея — коклюшная агглютинирующая сыворотка, лунка 1 — не обезвреженный препарат БКВ, 2 — ЛПС В. реЛи881$. Справа: траншея — коклюшная агглютинирующая сыворотка, лунка — обезвреженный препарат БКВ.
составляла в среднем 49050+6774 ЕЭ/мл, тогда как в конечных препаратах бесклеточных коклюшных вакцин активность ЛПС снижалась более, чем в 50 раз, и составляла в среднем 906+90 ЕЭ/ мл (р<0,001).
Результаты определения титров IgG к ЛПС В. рег1и8818 в сыворотках мышей, внутрибрюшинно иммунизированных препаратами БКВ, свидетельствовали о нарастании титров антител к ЛПС В. рег1и8818 после иммунизации БКВ (148+24, 310+52 и 138+36 на 14, 28 и 42 сут. после иммунизации соответственно). Различия с интактными мышами были достоверны (р<0,05), что указывало на наличие ЛПС в составе комплексного препарата в иммуногенной форме.
В ходе проведения исследований по изучению протективной активности препаратов БКВ показано, что препараты соответствовали требованиям ВОЗ и содержали не менее 8 МЗЕ в 1 мл.
Безопасность полученных препаратов коклюшной бесклеточной вакцины проверяли в тесте изменения массы тела мышей. Проведенные исследования показали, что при введении мышам БКВ в дозе 25 мкг через 3 суток после инъекции масса мышей в опытной и контрольной группах не уменьшилась. В течение 7 суток гибели мышей не наблюдали, прирост массы животных составил 80% от прироста массы контрольной группы, что соответствовало требованиям ВОЗ и свидетельствовало о безопасности исследованных препаратов БКВ [2].
ОБСУЖДЕНИЕ
Побочные эффекты цельноклеточных коклюшных вакцин связывают преимущественно с эндотоксином. Вместе с тем, ЛПС обладает выраженными иммуностимулирующими свойствами [5]. Включение обезвреженного ЛПС в состав бесклеточных коклюшных вакцин может способствовать повышению их про-тективной активности и снижению реактогенности [5 — 7]. Модификация молекулы ЛПС B. pertussis, в частности, взаимодействие липида А с циклодекстрином, приводит к снижению активности ЛПС в ЛАЛ-тесте [7]. Установлено, что коклюшная инфекция у людей сопровождается продукцией IgM, IgA и IgG к ЛПС [4]. Эндотоксин B. pertussis является основным модулятором иммунной системы хозяина в процессе инфекции. Модулирующая роль эндотоксина обусловлена, главным образом, влиянием липида А на То11-подобный рецептор 4 [8]. Мы исследовали иммунобилогические свойства ЛПС B. pertussis в составе комплекса антигенов коклюшного токсина, модифицированного обработкой формалином.
Результаты иммунохимического анализа БКВ до и после обезвреживания препарата формалином позволили получить новые данные об иммунобиологических и иммунохимических свойствах ЛПС B. pertussis. Результаты ИЭФ свидетельствовали о наличии ЛПС в не обезвреженных препаратах БКВ. Профили иммуно-электрофореграмм обезвреженных (формалинизированных) препаратов БКВ отличались от не обезвреженных сдвигом дуг преципитации в анодную зону. Причина этого явления, вероятно, обусловлена образованием жестких связей между отдельными антигенами и, в том числе, между белковыми антигенами и ЛПС.
Приведенные данные позволяют сделать вывод о том, что обезвреженный формалином препарат представляет собой не смесь отдельных антигенов, а комплекс белковых антигенов с ЛПС. Обработка формалином приводит к определенной модификации молекулы ЛПС. По данным ЛАЛ-теста активность ЛПС в обезвреженных препаратах снижалась не менее, чем в 50 раз. Иммунизация мышей БКВ сопровождалась достоверным нарастанием титров антител к ЛПС. Таким образом, можно предположить, что обезвреженные препараты БКВ содержат измененную форму ЛПС, сохраняющую антигенные свойства, но значительно
менее токсичную, что подтверждается данными о протективных свойствах и безопасности обезвреженных препаратов БКВ в опытах in vivo.
Полученные результаты свидетельствуют о необходимости дальнейшего изучения иммунобиологических свойств детоксицированного ЛПС B. pertussis для обоснования целесообразности его присутствия в составе бесклеточной коклюшной вакцины.
ЛИТЕРАТУРА
1. Захарова Н.С., Брицина М.В., Мерцалова Н.У. и др. Отечественная бесклеточная коклюшная вакцина. Журн. микробиол. 2008, 1: 35-41.
2. Комитет экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов (Сороковой доклад). Серия технических докладов 800. ВОЗ, Женева, 1992.
3. Allen A.G., Thomas R.M., Cadisch J.T., Maskell D. J. Molecular and functional analysis of the lipopolysaccharide biosintes locus wlb from Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis and Bordetella bronchiseptica. Mol. Microbiol. 1998, 29 (1): 27-38.
4. Chodorowska M. Humoral reaction to Bordetella pertussis antigens: pertussis toxin, filamentous hemagglutinin and lipopolysaccyaride in children with clinical symptoms of whooping cough. II. Occurrence and level of B. pertussis antigens in children with suspected whooping cough. Med. Dosw. Microbiol. 1999, 51 (3 — 4): 269-280.
5. Geurtsen J., Banus H.A., Gremmer E.R. et al. Lipooligosaccharide analogs improve efficacy of acellular pertussis vaccine and reduce type I hypersensitivity in mice. Clin. Vac. Immunol. 2007, 14 (7): 821-829.
6. Ibsen P., M0ller S., Heron I. Lipopolysacharides in a traditional pertussis vaccines. J. Biol. Stand. 1988, 16 (4): 299 — 309.
7. Ibsen P., Schou C., Au-Jensen M., Heron I. The effect of cyclodextrin on lipopolysaccharide production in cultures of Bordetella pertussis. J. Biol. Stand.1989, 17(4):321-330.
8. Marr N., Hajjar A.M., Shah N.R. et al. Substitution of the Bordetella pertussis lipid A phosphate groups with glucosamine is required for robust NF-kappa B activation and release of proinflammatory cytokines in cells expressing human but not murine toll-like receptor 4-MD-2-CD14. Infect. Immun. 2010, 78 (5): 159-171.
9. Westphal O., Jann K. Bacterial lipopolysaccharides extraction with phenol — water and father application of the procedure. In: Methods in Carbohydrate Chemistry. Whistler R.L., Wolfrom M.L. (ed.). New York, Academic Press, 1965.
Поступила 12.02.13
Контактная информация: Зайцев Евгений Михайлович, к.м.н., 105064, Москва, М. Казенный пер., 5А, р.т. (495)916-22-63
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
Э.А.Ахматов1, Н.П.Уткина2, Е.А.Ильиньх2, Е.А.Сорокина1, Е.С.Маракасова1, Е.А.Курбатова1, О.В.Лебединская2, Н.К.Ахматова1
ВЛИЯНИЕ РАЗНЫХ СПОСОБОВ АППЛИКАЦИИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЛИГАНДОВ НА ЭКСПРЕССИЮ ЦИТОКИНОВ
1НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, Москва, 2Пермская государственная медицинская академия
Цель. Изучение продукции цитокинов у мышей при вакцинации поликомпонентной вакциной Иммуновак-ВП-4, содержащей лиганды к TLRs, при разных способах введения. Материалы и методы. Мышам подкожным, интраназальным или пероральным методами вводили Иммуновак-ВП-4. Назально препарат вводили в разовой дозе 500 мкг в объеме 30 мкл. Пероральная разовая доза составила 2000 мкг в объеме 0,5 мл. Подкожно препарат вводили по 200 мкг. Цитокины в сыворотках крови определяли с помощью ИФА через 8 ч после введения вакцины. Результаты. У мышей через 8 часов после однократного введения Иммуновак-ВП-4 достоверно повышался уровень ^-10, ^-6, ^-12, ^-5. Но при
