CC BY
36ВАКЦИНОЛОГИЯ И ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКА
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ
Е.М.Зайцев1, М.В.Брицина1, И.Г.Бажанова1, Н.У.Мерцалова1, М.Н.Озерецковская1, Е.В.Ермолова1, Н.Г.Плеханова3, Н.А.Михайлова1, В.А.Колышкин2, В.В.Зверев1
ДОКЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ АДСОРБИРОВАННОЙ КОКЛЮШНО-ДИФТЕРИЙНО-СТОЛБНЯЧНОЙ ВАКЦИНЫ (АКДС-ВАКЦИНЫ) С БЕСКЛЕТОЧНЫМ КОКЛЮШНЫМ КОМПОНЕНТОМ
1НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова, Москва, 2ООО «Биомед» им. И.И.Мечникова, с. Петрово-Дальнее, Московская обл., волгоградский научно-исследовательский противочумный институт
Цель. Оценка стандартности антигенного состава коклюшного компонента, полноты сорбции коклюшного, дифтерийного и столбнячного компонентов, специфической активности и безопасности экспериментальных серий АКДС-вакцины с бесклеточным коклюшным компонентом (АКбДС-вакцины). Материалы и методы. Содержание отдельных антигенов (коклюшного токсина, филаментозного гемагглютинина и агглютиногенов 1, 2, 3) в образцах бесклеточного коклюшного компонента АКбДС-вакцины и полноту сорбции коклюшного компонента АКбДС-вакцины определяли с помощью иммуноферментного анализа. Полноту сорбции дифтерийного и столбнячного компонентов определяли в реакции флоккуляции в реакции антитоксинсвязывания соответственно. Протективную активность АКбДС-вакцины изучали на модели развития менингоэнцефалита у мышей, зараженных нейротропной вирулентной культурой Bordetella pertussis (штамм 18323), защитную активность столбнячного компонента — по выживаемости мышей после введения столбнячного токсина, протективную активность дифтерийного компонента — по выживаемости морских свинок после введения дифтерийного токсина. Безопасность препаратов оценивали в тестах острой и хронической токсичности с проведением патоморфологических исследований, в том числе на неполовозрелых животных. Результаты. Все исследованные эспериментальные серии АКбДС-вакцины были стандартными по содержанию отдельных антигенов коклюшного микроба. Все компоненты АКбДС-вакцины полностью сорбировались на геле алюминия гидроксида. По протективной активности препараты АКбДС соответствовали требованиям ВОЗ. Препараты были нетоксичными в тестах острой и хронической токсичности, не вызывали патоморфологических изменений, в том числе и у неполовозрелых животных. Заключение. Экспериментальные образцы АКбДС-вакцины по специфической активности и безопасности соответствовали требованиям ВОЗ.
Журн. микробиол., 2013, № 6, С. 44—49
Ключевые слова: бесклеточный коклюшный компонент, дифтерийный и столбнячный анатоксины, острая и хроническая токсичность, иммуногенность, сорбция, патомор-фология и гистология
E.M.Zaitsev1, M.V.Britsina1, I.G.Bazhanova1, N.U.Mertsalova1, M.N.Ozeretskovskaya1, E.V.Ermolova1, N.G.Plekhanova3, N.A.Mikhailova1, V.A.Kolyshkin2, V.V.Zverev1
PRECLINICAL STUDIES OF AN ADSORBED DIPHTHERIA-TETANUS-PERTUSSIS VACCINE (ADTP-VACCINE) WITH ACELLULAR PERTUSSIS COMPONENT
1Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, 2Mechinikov Biomed Ltd., Petrovo-Dalneye, Moscow Region, 3Volgograd Research Institute of Plague Control, Russia
Aim. Evaluate standardness of antigenic composition of pertussis component, completeness of sorption of pertussis, diphtheria and tetanus components, specific activity and safety of experimental series ofADTP-vaccine with acellular pertussis component (ADTaP-vaccine). Materials
and methods. The content of separate antigens (pertussis toxin, filamentous hemagglutinin and agglutinogens 1, 2, 3) in samples of acellular pertussis component of ADTaP-vaccine and completeness of sorption of pertussis component of ADTaP-vaccine were evaluated by using enzyme immunoassay. Completeness of sorption of diphtheria and tetanus components were determined in flocculation reaction and antitoxin-binding reactions, respectively. Protective activity ofADTaP-vaccine was studied in model ofmeningoencephalitis development in mice infected with Bordetella pertussis (strain 18323) neurotropic virulent culture, protective activity of tetanus component — by survival of mice after administration of tetanus toxin, protective activity of diphtheria component — by survival of guinea pigs after administration of diphtheria toxin. Safety of preparations was evaluated in tests of acute and chronic toxicity with carrying out pathomorphology studies including immature animals. Results. All the studied experimental series of ADTaP-vaccine were standard by content of separate antigens of pertussis microbe. All the ADTaP-vaccine components were completely sorbed on aluminium hydroxide gel. By protective activity ADTaP preparations satisfied the WHO requirements. The preparations were non-toxic in acute and chronic toxicity and did not induce pathomorphology changes including immature animals. Conclusion. Experimental samples of ADTaP-vaccine by specific activity and safety satisfied WHO requirements.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2013, No. 6, P. 44—49
Key words: acellular pertussis component, diphtheria and tetanus anatoxins, acute and chronic toxicity, immunogenicity, sorption, pathomorphology and histology
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время в практике здравоохранения как в России, так и за рубежом для вакцинопрофилактики коклюша используют АКДС-вакцину, которая состоит из цельных коклюшных микробов, обработанных формальдегидом или другим химическим веществом, столбнячного и дифтерийного анатоксинов. Многолетний период действия в стране общегосударственной системы иммунопрофилактики обеспечил стойкое многократное снижение заболеваемости и смертности от коклюша, дифтерии и столбняка. Однако эпидемический процесс коклюша продолжается, в том числе в странах с высоким уровнем вакцинации. Периодически происходят вспышки заболеваний коклюшем, особенно среди школьников среднего и старшего возраста, у которых регистрируют ослабление иммунитета к коклюшным антигенам. Коклюш регистрируют и среди взрослых, у которых заболевание протекает стерто, но они могут служить источником заражения неиммунных лиц. Поэтому актуально получение коклюшных вакцин, предусматривающих иммунизацию всех контингентов населения (в том числе детей старших возрастов и взрослых). Для вакцинации населения необходимы вакцины, обладающие выраженной протективной активностью в сочетании с низкими токсическими и аллергенными свойствами. В настоящее время во многих странах мира разрабатываются бесклеточные коклюшные вакцины (БКВ), реактогенность которых в целом ниже, чем цельноклеточной коклюшной вакцины [10]. Отечественных аналогов АКДС-вакцины с бесклеточным коклюшным компонентом в России нет.
В НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН разработана технология получения бесклеточной коклюшной вакцины, основанная на выделении природного комплекса основных коклюшных антигенов из среды культивирования коклюшных микробов, его очистки и сорбции [2]. Простота технологического процесса позволит снизить стоимость бесклеточной коклюшной вакцины в сравнении с зарубежными аналогами. Это позволяет использовать вакцины для массовой вакцинации детей, подростков и, в случае необходимости, взрослых людей.
Цель работы — исследование специфической активности и безопасности экспериментальных серий АКДС-вакцины с бесклеточным коклюшным компонентом (АКбДС-вакцины).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Анализ содержания отдельных антигенов (коклюшного токсина, филаментозно-го гемагглютинина, агглютиногенов 1, 2, 3) в образцах полуфабриката бесклеточного коклюшного компонента и определение полноты сорбции коклюшного компонента в АКДС-вакцине осуществляли в ИФА. Постановку реакции проводили в 96-луноч-ных полистироловых планшетах с плоским дном производства фирмы «Биомедикал» (Россия). Для адсорбции на полистироле, а также в составе пероксидазных коньюга-тов использовали гамма-глобулиновые фракции антисывороток к отдельным антигенам коклюшного микроба и комплексу антигенов. Результаты реакции учитывали с помощью спектрофотометра вертикального сканирования при длине волны 450 нм. Строили калибровочную кривую значений оптической плотности (ОП) при различных концентрациях референс-препаратов. Содержание антигенов коклюшного микроба в исследуемых образцах рассчитывали с помощью калибровочной кривой.
Полноту сорбции бесклеточного коклюшного компонента оценивали также методом Лоури [9] по отсутствию белка в надосадочной жидкости образцов АКбДС-вакцины. Содержание неадсорбированного дифтерийного анатоксина в надосадочной жидкости определяли при помощи реакции флокуляции [8]. Содержание неадсорбированного столбнячного анатоксина в надосадочной жидкости препарата определяли в реакции антитоксинсвязывания [7].
Защитные свойства бесклеточного коклюшного компонента оценивали в соответствии с [1, 5, 3] на модели развития менингоэнцефалита у мышей, зараженных нейротропной вирулентной культурой Bordetella pertussis штамм 18323. Защитные свойства столбнячного компонента оценивали по выживаемости иммунизированных мышей после введения 100+25 LD50 столбнячного токсина, а дифтерийного компонента — по выживаемости иммунизированных морских свинок после введения 100+25 DLM дифтерийного токсина. Специфическую безопасность коклюшного компонента АКбДС-вакцины оценивали в тесте изменения массы тела мышей при внутрибрю-шинном введении препарата в дозе 25 мкг (предполагаемая прививочная доза для человека) [1, 4]. Специфическую безопасность столбнячного и дифтерийного компонентов изучали на морских свинках. Препарат считали безопасным, если морские свинки оставались здоровыми, прибавляли в массе тела на протяжении 30 дней наблюдения и у них отсутствоволи параличи, некрозы, изъязвления кожи и другие местные патологические явления.
Тест на острую токсичность проводили на мышах массой 18 — 20 г, на неполовозрелых мышах массой 8 — 10 г и на морских свинках массой 250 — 300 г. Формирование групп животных проводили методом случайной выборки. Вакцину вводили подкожно в дозе 25 мкг. Неполовозрелым мышам вводили вакцину в дозе 12,5 мкг. Ежедневно регистрировали гибель животных, их массу, а также наличие возможных клинических симптомов интоксикации. Материал для гистологического исследования забирали от животных через 24 ч и на 8 сутки. Хроническую токсичность определяли на мышах массой 14-16 г и на неполовозрелых мышах массой 8 — 10 г. Вакцину вводили в течение 10 дней. Общее количество вакцины, введенное одной мыши, равнялось 0,06 мкг,
что соответствовало дозе 25 мкг белка, предполагаемого для введения ребенку весом 6 кг. Для неполовозрелых мышей доза равнялась 0,03 мкг. Патоморфологи-ческие исследования проводили на 8 сутки при определении острой токсичности и на 10 и 18 сутки при определении хронической токсичности. Осуществляли стандартные патоморфологические исследования со взятием материала для приготовления гистологических препаратов. Местное действие оценивали на
Таблица 1. Содержание отдельных антигенов коклюшного микроба в полуфабрикате коклюшного компонента АКбДС-вакцины
Серии Содержание антигенов в мкг/мл (М+m)
препарата КТ ФГА Агглюти-ноген 1 Агглюти-ноген 2 Агглюти-ноген 3
1 214+7 615+9 230+19 69+5 81+4
2 209+4 603+9 217+8 68+4 84+4
3 211+7 622+13 228+12 61+5 78+6
морских свинках массой 250 г путем подкожного введения 50 мкг препарата. Неспецифическую воспалительную реакцию на введение препаратов оценивали с 1 по 7 сутки по величине инфильтрата.
РЕЗУЛ ЬТАТЫ
Результаты анализа содержания отдельных антигенов (коклюшного токсина (КТ), филаментозного гемагглютинина (ФГА), агглютиногенов 1, 2, 3 в образцах полуфабриката бесклеточного коклюшного компонента представлены в табл. 1.
Как следует из данных табл. 1, различия в содержании основных антигенов коклюшного компонента в трех сериях АКбДС-вакцины были статистически недостоверными, что позволяет сделать вывод о его стандартности .
Результаты определения полноты сорбции коклюшного, дифтерийного и столбнячного анатоксинов в АКбДС-вакцине приведены в табл.2.
Изучение полноты сорбции коклюшного компонента АКбДС-вакцины методом Лоури показало отсутствие белка в надосадочной жидкости трех серий препаратов АКбДС-вакцины, что свидетельствовало о полной сорбции коклюшного компонента на геле алюминия гидроксида. Аналогичные исследования в ИФА также подтвердили полную сорбцию бесклеточного коклюшного компонента на геле алюминия гидроксида. Полнота сорбции дифтерийного анатоксина показана в реакции флокуляции, а столбнячного анатоксина — в реакции антитоксинсвязывания (табл. 2) Таким образом, все компоненты АКбДС-вакцины полностью сорбировались на геле алюминия гидрок-сида.
Результаты изучения специфической активности бесклеточного коклюшного компонента АКбДС-вакцины приведены в табл. 3.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что специфическая активность АКбДС-вакцины с бесклеточным коклюшным компонентом соответствовала требованиям ВОЗ и составляла от 8,8 до 13,6 международных защитных единиц (МЗЕ).
Защитная активность столбнячного компонента 3 серий АКбДС-вакцины составляла 80 — 90%, а дифтерийного компонента — 100%, что соответствует требованиям НТД для производства АКДС-вакцины.
Проверка АКбДС-вакцины на специфическую безопасность показала, что все изученные серии были безопасны. Показано, что увеличение средней массы тела мышей в трех опытных группах через 7 дней составляло более 60 % от увеличения средней массы тела животных контрольной группы. Морские свинки остались здоровыми, прибавляли в массе тела на протяжении 30 дней наблюдения, и у них отсутствовали параличи, некрозы, изъязвления и другие местные патологические явления. Гибели подопытных животных на протяжении всего исследования выявлено не было.
В опытах острой токсичности статистически значимых различий между животными, получавшими тестируемый препарат, и животными, получавшими препарат сравнения, по приросту массы тела ни в одной из исследуемых групп, выявлено не было.
Таблица 2. Эффективность сорбции компонентов АКбДС-вакцины на геле алюминия гидроксида
Компоненты АКбДС-вакцины, сорбированные на 1 мг геля алюминия гидроксида в одной иммунизирующей дозе для человека (0,5 мл)
Серии вакцины Дифтерийный анатоксин — 15 У Столбнячный анатоксин — 5 ЕС Бесклеточный коклюшный компонент — 25 мкг белка
Кол-во Кол-во выживших мышей (абс./%) По методу Лоури В ИФА
несорбиро-ванных Lf в 1 мл надосадочной жидкости Степень сорбции Степень сорбции Кол-во белка в надосадочной жидкости Степень сорбции Кол-во мкг белка в надосадочной жидкости Степень сорбции
1 не более 1 полная 4/100 полная 0 100% полная 0—0,1 >99,6% полная
2 не более 1 полная 4/100 полная 0 100% полная 0—0,05 >99,8% полная
3 не более 1 полная 4/100 полная 0 100% полная 0—0,05 >99,2% полная 47
В опытах хронической токсичности введение исследуемых трех серий препаратов АКбДС-вакцины не вызывало клинические признаки интоксикации подопытных животных. Во всех группах внутренние органы животных имели все характерные признаки, расположение и строение. При патологоморфоло-гическом исследовании лабораторных животных на различных сроках исследования не было обнаружено каких-либо значимых патологических изменений.
Таким образом, проведенное микроскопическое исследование тканей экспериментальных животных после введения 3 серий АКбДС-вакцины и контрольных препаратов показало, что данный вакцинный препарат не вызывает развития патологических, в том числе, воспалительных, дистрофических и некротических изменений во внутренних органах животных.
ОБСУЖДЕНИЕ
Реактогенность АКДС-вакцины обусловлена корпускулярным коклюшным компонентом, представляющим собой суспензию убитых микробных клеток. Замена корпускулярного коклюшного компонента на нетоксичный бесклеточный коклюшный компонент дает возможность снизить реактогенность АКДС-вакцины, что позволит увеличить охват прививками за счет иммунизации детей, имеющих противопоказания к вакцинации корпускулярной АКДС-вакциной. Повышение охвата вакцинацией детей младшего возраста в России позволит снизить заболеваемость, летальность и частоту осложнений при коклюшной инфекции. В ряде стран производятся бесклеточные коклюшные вакцины, содержащие от одного до пяти антигенов коклюшного микроба. В России зарегистрированы вакцины «Инфанрикс» (Бельгия) и «Пентаксим» (Франция). Широкое применение этих вакцин ограничено относительно высокой стоимостью. Аналогов отечественной АКДС-вакцины с бесклеточным коклюшным компонентом в России не существует. В связи с этим, необходимым является создание отечественного препарата для вакцинации и ревакцинации против коклюша.
В НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН селекционирован штамм В.регШ8818 — продуцент основных протективных антигенов коклюшного микроба. Разработана схема выделения и обезвреживания комплекса основных протективных антигенов коклюшного микроба (коклюшный токсин, филаментозный гемагглюти-нин, агглютиногены 1, 2, 3), обеспечивающая получение нетоксичного и иммуноген-ного препарата, соответствующего требованиям ВОЗ. Разработаны тест-системы для контроля качества вакцин (определение содержания протективных антигенов: коклюшного токсина, филаментозного гемагглютинина и агглютиногенов 1, 2, 3), а также контроля полноты сорбции коклюшного компонента.
Поскольку цель настоящей работы заключалась в проведении доклинических испытаний препарата экспериментальных серий АКбДС-вакцины, изготовленных в условиях производства, в ходе исследований был разработан оптимальный способ сорбции бесклеточного коклюшного компонента, дифтерийного и столбнячного анатоксинов на геле алюминия гидроксида, обеспечивающий стабильность защитных
Таблица 3. Специфическая (протективная) активность бесклеточного коклюшного компонента АКбДС-вакцины
Серии препарата Доза препарата в мл Кол-во выживших мышей к общему числу ЕД50 (штатах) в мл Кол-во МЗЕ* в 1 мл
1 0,05 13/16 0,017 8,8
0,01 4/16 0,012-0,024
0,002 2/16
2 0,05 12/16 0,016 9,4
0,01 6/16 0,011-0,023
0,002 2/16
3 0,05 14/16 0,011 13,6
0,01 7/16 0,008-0,015
0,002 2/16
ОСО 0,0156 13/16 0,005
0,0033 6/16 0,003-0,007
0,00066 3/16
Примечание. * Статистическая обработка по методу Вильсон-Вустер.
свойств всех компонентов ассоциированного препарата. Разработан способ лиофи-лизации адсорбированной АКДС-вакцины с бесклеточным коклюшным компонентом. В условиях производства изготовлены три серии опытно-промышленных серий АКДС-вакцины с бесклеточным коклюшным компонентом.
Доклинические испытания опытно-промышленных серий АКДС-вакцины с бесклеточным коклюшным компонентом включали контроль качества серий вакцины, оценку защитной активности и безопасности препарата. В результате проведенных исследований было показано, что исследованные серии АКбДС-вакцины были стандартны по содержанию коклюшных антигенов и полностью сорбировались на геле алюминия гидроксида. По протективной активности препараты соответствовали требованиям ВОЗ и содержали не менее 8 МЗЕ в 1 мл. Препараты были нетоксичными в тестах острой и хронической токсичности, не вызывали патоморфологических изменений, в том числе у неполовозрелых животных.
В целом приведенные данные свидетельствуют о специфической активности и безопасности экспериментальных серий АКбДС-вакцины. Полученные результаты указывают на целесообразность проведения клинических испытаниях препарата на добровольцах.
ЛИТЕРАТУРА
1. Государственные испытания и регистрация новых медицинских иммунобиологических пре-паратов.Санитарные правила СП 3.3.2.5.61-96. М., МЗ России, 1998.
2. Захарова Н.С., Брицина М.В., Мерцалова Н.У., Бажанова И.Г., Озерецковская М.Н., Зайцев Е.М., Поддубиков А.В., Семенов Б.Ф. Отечественная бесклеточная коклюшная вакцина. Журн. микробиол. 2008, 1: 35-41.
3. Инструкция по отбору, проверке и хранению производственных штаммов коклюшных бактерий Минздрав СССР. М., АМН, 1987.
4. Комитет экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов. Серия технических докладов 800. Женева, ВОЗ, 1992, с. 80-170.
5. Методические рекомендации «Доклинические испытания эффективности и безопасности новых иммунобиологических лекарственных препаратов». М., 2010.
6. Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям. МУК 4.1/4.2.588-96. М., МЗ России, 1998.
7. Промышленный регламент № ПР 1895039-10-07 на производство анатоксина столбнячного очищенного адсорбированного жидкого (АС-анатоксина).
8. Регламент производства № 1512-04 «Анатоксин дифтерийный счищенный адсорбированный с уменьшенным содержанием антигена жидкий», 2005.
9. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin reagent. J.Biol.Chem. 1951, 193: 265-275.
10. Plotmn S., Orenstein W., Offit P. Vaccines. 2008.
Поступила 18.06.13
Контактная информация: Зайцев Евгений Михайлович, д.м.н., 105064, Москва, М. Казенный пер, 5А, р.т. (495)916-22-63
4. ЖМЭИ 6 № 5187 49
