CC BY
73
Статья
ИФН- у и указанных выше цитокинов активирует цитолитиче-ские реакции, ГЗТ и фагоцитоз, а ТЬ2 - антителообразование и продукцию медиаторов воспаления и аллергии. Поэтому на фоне снижения содержания интерферона-у у больных КПЛ идет снижение выраженности цитотоксической иммунной реакции и активности воспалительного процесса, что проявляется в более быстром клиническом эффекте у пациентов этих групп. Неотъемлемым звеном развития гуморального иммунного ответа и утилизации антигенов различного генеза является образование ЦИК. Их уровень позволяет интегрально оценить функциональное состояние иммунной системы, так как значимое повышение ЦИК свидетельствует о наличии специфического взаимодействия антиген-антитело, т.е. развитии иммунного ответа. ЦИК являются одним из важнейших факторов приводящих к активации системы комплемента по классическому пути [14].
Вместе с тем диагностическая и прогностическая значимость отдельных показателей иммунной системы остается недостаточно изученной, и это, в первую очередь, касается ЦИК. Последние практически участвуют во всех механизмах (гуморальных, клеточных и фагоцитарных) иммунного повреждения [10], и их качественный состав существенно влияет на клинику заболевания. Патогенные свойства ЦИК определяются их физико-химическими параметрами (размеры, состав, концентрация и способность фиксировать комплемент). Молекулярная масса ЦИК определяет их размер. Это является показателем патогенности [11] и скорости элиминации из организма: крупные ЦИК быстро элиминируются и сравнительно малопатогенны; мелкие ЦИК плохо элиминируются, могут откладываться субэндотели-ально, не способны активировать систему комплемента; ЦИК среднего размера обладают высокой комплементсвязывающей способностью и наиболее патогенны. Состав иммуноглобулинов влияет на размер ЦИК, их комплементсвязывающую активность, патофизиологические свойства, клиренс и т.п. [10].
Исходные значения ЦИК и содержание их на 10-е сутки лечения в сыворотке крови у больных обеими формами КПЛ не отличались от контрольного значения, а также между собой. У пациентов с обеими формами дерматоза на протяжении последующих этапов наблюдения на фоне традиционной терапии уровни ЦИК значительно повышались по сравнению с контролем, а у больных 1А группы через 6 месяцев и по сравнению с исходным значением. Дополнительное применение Реаферона-ЕС-липинта к концу стационарного этапа лечения приводило к нормализации данного показателя, а у пациентов 1Б группы значение ЦИК становилось достоверно ниже, чем в 1А. В обеих группах КПЛ, получавших только традиционную терапию, отмечалось постепенное снижение коэффициента ЦИК на протяжении всего периода наблюдения, в то время как на фоне иммуномодулятора этот показатель оставался относительно стабильным и несколько превышал таковые в группах сравнения, особенно через 6 месяцев после выписки из стационара. Это свидетельствует об относительном нарастании высокомолекулярных ЦИК по отношению к низкомолекулярным, что может привести к образованию нерастворимых иммунных комплексов и поддерживать активность иммуновоспалительного процесса у больных, получавших традиционную терапию. Появление нерастворимых иммунных комплексов может приводить к активации системы комплемента сначала по классическому, а затем по альтернативному пути [14]. В реализации системного воспалительного ответа при КПЛ основная роль принадлежит высокомолекулярным антигенам, таким как нуклеопротеиды и другие продукты клеточной деструкции. Средние молекулы в большей степени обеспечивают развитие эндотоксикоза и почти не отвечают за активацию фагоцитирующих клеток периферической крови.
На фоне иммуномодулирующей терапии снижается активность как цитотоксических, так и гуморальных иммунных реакций у больных с КПЛ, а также более быстрое купирование клинических проявлений, что позволяет рекомендовать применение рекомбинантного альфа2-интерферона в схему лечения данного дерматоза.
Литература
1. Абрамова Е.Й., Васьковская Г.П. // Вест. дерматол.-1973.- № 5.- С.42-45.
3. Бубнова Л.Н. и др. // Мед.иммунология.- 1999.- № 3-4.-С.50-51.
4. Бутов Ю.С. Кожные болезни и инфекции, передающиеся половым путем.- М., 2002.
5. КетлинскийС.А., КалининаН.М.// Иммунология.- 1995.-№3.-С.30-44.
6. Кузнецов В.П. и др. // Ж. микробиол.- 1996.- № 5.-С. 104-110.
7. Ломоносов К.М. // Леч.врач.- 2003.- №9.- С.30-31.
8. Машкиллейсон А.Л. В кн.: Заболевания слизистой оболочки полости рта и губ.- М.- 1984.- С. 190-204.
9. Рабинович О.Ф.и др.// Стоматол.- 2000.- №6.- С.61-66.
10. Скрипкин Ю.К. и др. // Вестн. дерматол.- 1982.- № 8.-C.24-30.
11.Стручков П.В. Динамическое исследование патогенных свойств иммунных комплексов у больных с иммунокомплексны-ми заболеваниями легких: Автореф. дис. ... канд.мед.наук.- М., 1986.- 29c.
12.Чахкиев P.O. Роль клеточного и гуморального иммунитета в патогенезе красного плоского лишая: Автореф. дис... канд. мед.наук.- Киев, 1980.
13. Heinrich P.C. et al. // Biochem. J.- 1990.- Vol. 265.-P.621-636.
14. Miyaike J. et al. // Gut.- 2002.- Vol. 51.- P.591-596.
15. Rooney M. et al. // Rheumatol.lnt.- 1990.- №10.- P.217.
PARTICULARITIES OF CYTOKINE PROFILE IN THE PATIENTS WITH LICHEN RUBER PLANUS AND METHODS OF ITS CORRECTION BY REAFERON-EC- LIPINT
Y.V. NACHAROV, O.B. NEMCHININOVA, E.V. TICHONOVA Summary
Thus reaferon-EC- lipint together with immunomodulatory therapy decreases activity both cytotoxic and humoral immune reactions in the patients with lichen ruber planus and controls clinical manifestations. That is why one can recommend administration of recombinant a- interferon in managing of this dermatosis.
Key words: reaferon-EC- lipint, immunological efficacy
УДК 615.45.122;615.324
ИММОБИЛИЗАЦИЯ ТРИПСИНА В НЕКОТОРЫХ МАЗЕВЫХ ОСНОВАХ
В.В. ВЕРНИКОВСКИЙ1, Э.Ф. СТЕПАНОВА*
Для очищения раневых поверхностей предложено большое количество различных форм иммобилизованных протеолитиче-ских ферментов: перевязочные материалы, гелевые повязки, присыпки, пленки и др. Однако наиболее удобными формами в терапии раневого процесса остаются мягкие лекарственные формы: мази и гели. Ранее нами изучалась осмотическая активность ряда мазевых основ, используемых для создания лекарственных форм, применяемых в первую фазу раневого процесса [0]. В результате было выбрано несколько наиболее перспективных составов. Для дальнейшего сопоставления основ была определена протеолитическая активность получаемых при введении трипсина композиций, и рассчитан % сохранения активности для каждой из основ. Композиции, полученные при смешивании нативного трипсина и носителя, растворяли в фосфатном буферном растворе с соответствующей величиной pH. От полученных растворов отбирали пробы, используемые для дальнейших исследований. Протеолитическую активность определяли по методике, описанной в [0]. Как следует из представленных в табл. 1 данных, при включении трипсина в выбранные основы наибольший % сохранения активности соответствует сплаву полиэтиленоксидов. За ним следует гель натрия альгината и наименьший % сохранения активности зафиксирован при использовании комбинированной основы карбопола с ПЭО 400. Эти результаты могут быть объяснены тем, что и натрия альгинат и карбопол представляют собой полианиониты, на поверхности молекул которых сгруппи-
2. Базарный В.А. и др. // Клин. лаборат. диагностика.-1999.- № 11.- С.28.
1ГОУ ВПО «Пятигорская государственная фармацевтическая академия», 357500, Пятигорск, пр. Кирова, 33. Тел.: (8793) 39-19-37.
В.В. Берниковский. Э.Ф. Степанова
рованы карбоксильные группы. В этом случае происходит образование ионных связей между данными функциональными группами и аминными группировками молекул сериновых протеаз, что приводит к снижению активности [0-0, 0].
Таблица 1
Результаты включения трипсина в выбранные основы (соотношение фермент — носитель 2:100)
Носитель Протеолитическая активность, ПЕ/г носителя % сохранения активности
Сплав ПЭО 400 - ПЭО 1500 (8:2) 2,1 85,5
Гидрогель натрия альгината с глицерином 1,7 69,2
Гидрогель карбопола с ПЭО 400 1,6 65,1
Примечание: Приведены усредненные данные 6 определений
Разница в активности при использовании альгинатного носителя и карбопола объясняется тем, что инкубация и измерения проводились при рН«8,0, а уже при pH > 8,4 молекула фермента несет одноименный с альгинатом суммарный отрицательный заряд [0]. Поэтому в области pH, при которой проводились измерения, комплекс фермент - альгинат начинает разрушаться с образованием свободных или непрочно связанных молекул фермента. Однако, как было показано ранее [0], сериновые про-теазы семейства трипсина могут образовывать достаточно устойчивые комплексы с производными синтетических поликислот (в том числе и полиакриловой) при значениях pH до 10,8 единицы, т.е. в условиях, когда оба вида макромолекул имеют одноименный заряд. Комплексы трипсиноподобных протеаз с альгинатами устойчивы только в области значений pH 2,9-8,4 [0]. Таким образом, более высокую активность в случае использования альгината натрия можно объяснить меньшей прочностью и количеством химических связей, образующихся между ним и молекулами трипсина, чем при аналогичном взаимодействии молекул трипсина и карбопола в данной области pH.
Молекулы полиэтиленоксидов имеют на поверхности гидроксильные группы, необратимо взаимодействующие с фенольными гидроксилами [0]. В молекуле трипсина согласно данным, представленным в работе [0], должно быть до 10 тиольных групп цистеина, около 30 алифатических О^групп, 3-7 фенольных групп остатков тирозина, 7-12 гуанидиновых групп остатков аргинина, свыше 10 аминогрупп и 40 карбоксильных групп. С учетом того, что молекула трипсина подвергается конформаци-онным изменениям, многие функциональные группы оказываются вовлеченными в образование третичной структуры и оказываются исключенными из возможных внешних взаимодействий. Таким образом, можно предположить, что между молекулами полиэтиленоксидов и трипсина не возникает прочных химических связей, а возникают, вероятно, только относительно слабые водородные связи, за счет чего и сохраняется более высокая протеолитическая активность. Это предположение подкрепляется тем, что в молекуле трипсина подавляющее число функциональных групп представлено алифатическими гидроксилами и карбоксильными группами, а, согласно [0], при сочетании ПЭО с подобными веществами возможно образование высокоструктурированных систем ПЭО за счет взаимодействия по водородным связям. Далее нами была проверена протеолитическая активность (ПА) и устойчивость иммобилизованного трипсина в условиях, близких к условиям раневого содержимого. Согласно работам [0, 0], pH раневого содержимого составляет около 5-6 единиц. В связи с этим в качестве среды инкубирования, моделирующей условия раны, был взят фосфатный буферный раствор с «промежуточным» значением pH, равным 5,5 единицы. Активность в условиях раны определяли аналогично определению активности при оптимальном значении pH. Рассчитывались такие показатели, как активность на 1 г носителя, % сохранения активности по отношению к нативному ферменту и к активности в оптимальных условиях. Данные представлены в табл. 2.
Как следует из данных, приведенных в табл. 2, при смещении pH в кислую сторону менее всего изменяется активность при использовании в качестве носителя гидрогеля натрия альгината с глицерином. Однако в абсолютных единицах наибольшая активность у композиции трипсин - сплав ПЭО. При использовании всех трех носителей протеолитическая активность композиций при pH 5,5 превышает таковую для нативного фермента.
Таблица 2
Результаты определения сравнительной активности иммобилизованных препаратов трипсина при pH 5,5
Носитель Протеолитическая активность, ПЕ/г носителя % сохранения активности % сохранения активности от активности композиции в оптимальных условиях
Сплав ПЭО 400 - ПЭО 1500 (8:2) 1,24 215,7 59
Гидрогель натрия альгината с глицерином 1,18 205,3 69,4
Гидрогель карбопола с ПЭО 400 0,87 151,4 54,4
Примечание: Приведены усредненные данные 6 определений
Включение трипсина в исследуемые носители хоть и приводит к некоторому снижению активности фермента в оптимальных условиях (pH 8,0, 37°С), однако оказывает стабилизирующее воздействие на трипсин при кислых значениях pH, приближенных к значениям pH раневого содержимого. Важным свойством иммобилизованного ферментного препарата является способность проявлять высокую активность в течение значительного времени. В связи с этим была проверена устойчивость иммобилизованных препаратов при pH 5,5 и 37°С в течение 4 часов (рис. 1).
ПА, % от тах
О Нативный трипсин —В—Сплав ПЭО —д—Натрия альгинат —X— Карбопол + ПЭО
0 60 120 180 240 *’ мин
Рис. 1. pH-стабильность иммобилизованных препаратов трипсина (pH 5,5;
Т = 37° С)
Через 4 часа инкубации в буферном растворе активность иммобилизованных препаратов колебалась от 58,3% до 75% от максимальной. Как видно из рисунка, кривые активности имели различный характер в зависимости от используемого носителя. Так, для альгината натрия и сплава ПЭО характер изменения активности в течение инкубирования был схожим, максимум протеолитической активности достигался через 60 минут после начала инкубирования и в дальнейшем снижался, достигая на 240 минуту величины 75% от максимума.
Интересен характер кривых, полученных для нативного трипсина и трипсина, включенного в композицию карбопола и ПЭО. Максимум протеолитической активности в этих случаях достигался через 120 минут, т.е. период «акклиматизации» ферментных препаратов занимал в 2 раза больше времени, чем в случае использования в качестве носителей альгината натрия и сплава ПЭО. Следует отметить, что, несмотря на схожую динамику изменения активности в период времени до 120 минут, при дальнейшем инкубировании кривые достаточно резко расходились и через 240 минут активность нативного трипсина составляла 86,5% от максимальной, а для трипсина, включенного в композицию карбопола и ПЭО 400 активность составляла всего 58,3%. Это может объясняться тем, что на активность трипсина, включенного в карбопол, оказывает влияние то, что в данных условиях достаточно активно протекает межмолекулярная реакция между молекулами трипсина и молекулами сополимера акриловой кислоты (карбопола), сопровождающаяся снижением активности фермента. Взаимодействие трипсина с полиэлектролитами кислотного характера сопровождается ускоренной авто-
Краткое сообщение
литической денатурацией по сравнению с нативным ферментом. Причем для жесткоцепного полиэлектролита - альгиновой кислоты - этот эффект менее выражен из-за не столь благоприятных условий для электростатического взаимодействия, чем в присутствии гибкоцепных сополимеров синтетических кислот [0].
Для облегчения сопоставления полученных иммобилизованных форм трипсина по динамике изменения активности были составлены аналогичные графики в координатах ПА, ПЕ/г включенного фермента - время, мин (рис. 2).
ПА, ПЕ/г фермента
0 60 120 180 240 t, мин
Рис. 2. Сравнительная динамика активности иммобилизованных форм трипсина (pH 5,5; Т = 37°С; активность указана в абсолютных единицах)
Из рис. 2 видно, что наибольшая величина активности достигается при использовании в качестве носителя сплава ПЭО. Незначительно уступает по активности трипсин, иммобилизованный в геле альгината натрия. Эти две основы наиболее перспективны для дальнейших исследований. Активность композиции, полученной при включении трипсина в гель карбопола и ПЭО, существенно уступает не только первым двум составам, но и раствору нативного фермента. Приведенные данные свидетельствуют о возможности получения стабильных иммобилизованных форм трипсина в традиционных мазевых основах и о целесообразности дальнейшего медико-биологического и фармакологического изучения соответствующих лекарственных форм.
Литература
1. Белов А.А. и др. // Хим.-фармац. журн.- 1992.- Т.26, №11/12.- С. 101-103.
2. Бессмертная Л.Яи др.- Биохимия.- 1977.- Т.42.- С. 1825.
3. Биотехнология: Учеб. пособие для вузов. В 8 кн. / Под ред. Н. С. Егорова, В. Д. Самуилова. Кн. 7: Иммобилизованные ферменты / И.В. Березин и др.- М.: Высш. Шк., 1987.- 159 с.
4. Верниковский В.В. // Изв. вузов. Сев.-Кавк. регион. Ес-теств. науки. Спецвыпуск. Фармакология.- 2006.- С. 31-32.
5. Давиденко Т.И. // Хим.-фармац. ж.- 1999.- Т.33, №9.- С. 27-29.
6. Иванова Г.П.и др. // Биоорган. химия.- 1977.- Т.3, №1.-
С. 127-132.
7. Комиссарова А.Л. и др. // Хим.-фармац. журн.- 1981.-Т.5, №1.- С. 56-60.
8. Кравченко И.А., Давиденко Т.И. // Фармакол.- 1993.-№10-11.- С. 46-52.
9. Марченко Л.Г. и др. Технология мягких лекарственных форм: Учеб. пособие.- СПб.: СпецЛит, 2004.- 174 с.
10. Миргородская О.А. и др. // Биоорган. химия.- 1976.- Т.2, №12.- С. 1695-1696.
11. Полимеры в фармации / Под ред. А.И. Тенцовой, М.Т. Алюшина.- М.: Медицина, 1985.- 256 с.
THE IMMOBILIZATION OF TRYPSIN IN THE SOME OINTMENT’S BASES
V.V. VERNIKOVSKY, E.F. STEPANOVA
Summary
The immobilization of trypsin in the some ointment’s bases was carried out. For received ferment preparations were checked both activity and conservation of activity in optimal conditions. Also proteoclastic activity and dynamics of change of activity in the conditions modelling wound’s contents was investigated. On the establishment of the received data was chosen the optimal basis - an alloy of polyethyleneoxides. Received immobilized forms were recommended for the further medicobiological and pharmacological studying.
Key words: immobilization, trypsin, ointment’s bases, proteo-clastic activity, wound-cleaning drugs.
УДК 662.66:543.83
ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ МИНЕРАЛЬНОГО ВЕЩЕСТВА ШУНГИТОВОЙ ПОРОДЫ ЗАЖОГИНСКОГО МЕСТОРОЖДЕНИЯ
КАРЕЛЬСКОГО ЗАОНЕЖЬЯ
В.В. ПЛАТОНОВ, Д.В. ПРОКОПЧЕНКОВ, В.А. ПРОСКУРЯКОВ,
А.И. СЫЧЁВ, Т.В. ЧЕСТНОВА, А.Ю. ШВЫКИН
Шунгитовые породы (ШП) - уникальные представители каустобиолитов протерозойского возраста (свыше 2 млрд. лет), не имеющие аналогов. Будучи промежуточными продуктами между аморфным углеродом и графитом, включая некристаллический фуллереноподобный углерод с метастабильной молекулярной структурой, не склонной к графитации, ШП - продукты метаморфического воздействия магматических пород на битуминозные осадки [1]. ШП - единственные породы в мире, содержащие в своём составе фуллерены в заметных концентрациях [2].
Долгие годы шунгитовой водой и препаратами на основе ШП лечат широкий спектр заболеваний: псориаз, красная волчанка, диффузный нейродермит, экземы, артриты и полиартриты нетуберкулёзного происхождения, гематогенный остеомиелит, хронический гастрит, холецистит, дискинезию желчных путей, радикулиты, плекситы, полиневриты лицевого, тройничного нервов, болезни уха, горла и носа, органов дыхания, крови, системы кровообращения, пороки сердца, гипертонию, облитери-рующий атеросклероз сосудов нижних конечностей при отсутствии трофических нарушений [1,3]. Однако до настоящего времени практически отсутствует объяснение, в чём причина столь уникальных свойств ШП. Одним из возможных объяснений их высокой биологической активности является ссылка на присутствие в них фуллеренов [1-3]. Исследования биологической активности водорастворимых производных фуллеренов С60 и С70 показали, что они нетоксичны, не подавляют здоровые клетки, а наоборот, способствуют нормальному функционированию всех физиологических систем организма, являются высокоэффективными и длительно действующими антиоксидантами [2]. Приняв во внимание количественное содержание фуллереновых структур в составе органической массы (ОМ) ШП (до 2 масс. %), трудно объяснить наблюдаемый лечебный эффект препаратов на основе ШП только присутствием фуллеренов. Следует учитывать весь комплекс биоактивных соединений, входящих в состав ОМ и минеральной составляющей ШП.
В настоящем сообщении приводятся данные комплексного изучения минералогического и химического состава минерального вещества ШП Зажогинского месторождения Карельского Заонежья с привлечением газохроматографического элементного (ГХЭА), термогравиметрического (ТГ), рентгенофазового (РФА), рентгено-флуоресцентного (РФЛА), эмиссионного спектрального (ЭСА), атомно-абсорбционного (ААС) и масс-
спектрометрического с ионизацией пробы в индуктивно связанной плазме (1СР-М8) анализов, экстракции ШП дистиллированной водой, хлороводородной кислотой и смесью концентрированных HCl и HNOз («царской водкой»). Элементный состав ОМ ШП был установлен методом ГХЭА (масс. % daf): С (95,45); Н (0,30); N (0,60); О+8 (3,65). Содержание ОМ и минеральной составляющих ШП было установлено методом ТГ и составляет, соответственно, 30,21 и 69,79 (мас. % сухой ШП). Согласно данным РФА, основу минерального вещества ШП составляют силикаты магния типа: 3MgO•4SiO2•6H2O и 3MgO•2SiO2•6H2O. Кроме того, присутствуют свободный а^Ю2 (кварц), a-Fe2Oз, ТЮ2 (рутил), 8MgO•4SiO2•Mg(F,OH), a-Al2Oз и a-Cr2Oз. Методом ЭСА в составе ШП качественно были идентифицированы: Са, Mg, А1, Si, Mn, Т^ Fe, Сг, №, Р^ Си, Со, Mo, Ъп, Ъг, ИЬ, И, А^ Аи, Ьа, Се, Ш, №, К, Св, и Sn, Sb, Os, ", и V. Метод РФЛА позволил оценить количественное содержание отдельных элементов, как, например, (мас. % в золе ШП): Mg (1,25), А1 (15,03), Si (47,62), Са (4,63), Mn (0,14), Т (0,95), Fe (12,52). Наиболее подробная качественная и количественная характеристика минерального вещества ШП была получена методом ICP-MS: весьма широкий спектр химических элементов, присутствующих в ШП (всего - 62 элемента). Основу минерального вещества ШП составляют N (7038,73), Mg (6039,23), А1 (37861,67), К (13628,30), Са (4436,61), Т (1412,66), Fe (40225,93), Си (110,96), Ав (96,44), Ва (250,92), V (127,10), Mn (128,30), Ъп (76,45), Ъг (41,64), РЬ (41,23), Сг (68,61), мкг/г. Достаточно высоко содержание Se
