CC BY
86
6 fí $ X tt В химии и химической технологии. Том XXV. 2011. № 5 (121)
УДК 615.262.1
В.В. Смагина, А.А. Фенин, Г.В. Авраменко
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва.
ЗАВИСИМОСТЬ АКТИВНОСТИ ПРОТЕАЗ ОТ СПОСОБА ИММОБИЛИЗАЦИИ ФЕРМЕНТА
It has been considered the impact of ionizing radiation on the hydrogel matrix containing polyvinylpyrrolidone, polyelectrolyte as carrier-cellulose derivatives, with the inclusión of a proteolytic enzyme - terrilitinom, identifies the key characteristics influencing tlie final activity of the drug
Рассмотрено воздействие ионизирующее излучения на гидрогелевую матрицу, содержащую поливинилпирролидон, полиэлектролит, в качестве носителя - производные целлюлозы, с включенным в него протеолитическим ферментом - террилитином, определены основные характеристики влияющие на конечную активность препарата
К настоящему времени очевидна актуальность внедрения в практику лечебно-профилактических средств, содержащих ферменты с
многоплановым действием, которые можно применять длительное время. Таким требованиям отвечают препараты системной энзимотерапии, относящиеся к группе гидролаз и представленные высокоочищенными протеиназами животного (химотрипсин, трипсин, эластаза), растительного (папаин, бромелаин) и микробного (террилитин) происхождения. Протеолитические ферменты относятся к средствам биологической антисептики и обладают антитоксическим, противовоспалительным, некролитическим действием. Механизмом воздействия протеолитических ферментов на инфицированную рану является гидролиз токсичных микробных метаболитов белковой природы. ,что способствует появлению грануляции в более ранние сроки и вызывает ускорение эпителизации. [1]
Перспективным направлением в разработке новых ранозаживляющих лекарственных препаратов является создание иммобилизованных, т. е. связанных ферментов - биокатализаторов нового поколения, отличающихся более высокой стабильностью. Важным этапом при разработке гидрогелей медицинского назначения является определение способа иммобилизации и оценка его влияния на стабильность ферментов.
В данной работе рассмотрено воздействие ионизирующего излучения на гидрогель, содержащий пол n-N-винил пиррол идон, полиэлектролит, в качестве носителя -производные целлюлозы, с включенным в него протеолитическим ферментом - террилитином.
Террилитин - ферментный препарат протеолитического действия, является продуктом жизнедеятельности плесневого гриба Aspergillus terrícola. Представляет собой комплекс гидролитических ферментов, содержащий три белковых компонента (протеазы I, II, III), обладающих протеолитической активностью, и один амилолитический компонент. [2]
Облучение образцов проводили на у-установке РХМ- у-20 в диапазоне доз от 15 до 35 кГр.
X U в химии и химической технологии. Том XXV. 2011. № 5 (121)
Материалы и методы.
Для получения гидрогелей были приготовлены водные растворы по методике последовательного ввода компонентов, содержащие поливинилпирролидон, (ПВП, степень полимеризации 200), гидроксиэтилцеллюлозу (ГЭЦ, степень полимеризации 550), гидроксипропилцеллюлозу (ГПЦ, степень полимеризации 550) альгинат натрия (степень полимеризации 500), фибринолитический энзим террилитин. Перед облучением ампулы с растворами запаивали без вакуумирования.
Доза поглощенного излучения является одним из основных параметров, определяющих количество межмолекулярных сшивок, приходящихся на одну полимерную молекулу. Для расчета поглощенной дозы использовались данные ферро-сульфатной дозиметрии. Чистые и сухие стеклянные пробирки заполняли дозиметрическим раствором состава: (1 - 5) • 10"3 М FeS04 + 10"3 М NaCl + 0,4 М H2S04 и облучали на этой же установке в идентичных условиях в течение 130 минут. Измерение концентрации ионов Fe3+, возникающих при облучении, производили на спектрофотометре при длине волны 303-305 нм, принимая молярный коэффициент ЭКСТИНКЦИИ 8 Fe3+ = 2174 ± 6,6 л/моль • см и толщину кюветы 1=1 см.
Мощность поглощенной дозы излучения на установке К-120.000 по дозиметру Фрике составляла 0,18 Гр/сек. Мощность дозы, поглощенная исследуемыми образцами:
Рейс, = К • Рдоз = 0,98 • 0,648 = 0,635 кГр/час Радиационно-химический выход поперечных связей при облучении полимерной системы является очень важным показателем, поскольку от плотности сшивания полимерной сетки зависит эффективность физической иммобилизации или удерживание террилитина, а, следовательно, и активность фермента. Для оценки плотности поперечных сшивок используются такие показатели, как выход гель-фракции и коэффициент равновесного набухания [3,4].
Для облученных образцов выход гель-фракции определяли с помощью золь-гель анализа. Для полного вымывания золь-фракции образцы находились в дистиллированной воде в течение 7 дней. Затем определяли массу набухших образцов (Msw)- После этого образцы сушили до постоянной массы с помощью вакуумной установки, состоящей из сушильного шкафа и вакуумного насоса.
Гель-фракцию определяли по следующей формуле:
gel(%)=Mdryl Мпол,- 100%, где Mdry - масса сухого геля после вымывания золь-фракции, г; Мпол. -навеска полимеров, г
Коэффициент равновесного набухания определяли как долю воды в облученном геле в условиях равновесного набухания:
Qs = (Msw - Mdry) / Mdry,
где Msw- масса набухшего геля, г
Активность террилитина определяли по методу Кунитца.
9
С й 6 X 11 в химии и химической технологии. Том XXV. 2011. №5(121)
Модифицированный метод с применением субстрата казеина основан на определении скорости ферментативной реакции гидролиза субстрата под действием исследуемых протеолитических ферментов. В качестве субстрата использовали 2 % раствор казеина в 0,2 М растворе фосфатного буфера при рН 8,0, коэффициент микромолярной экстинкции тирозина Кт составлял 1,186.
Результаты и обсуждение
После облучения образцы представляли собой компактные прозрачные студни.
На рис.1 изображена зависимость выхода гель-фракции от дозы облучения для образцов различного состава. Выход гель-фракции характеризует эффективность сшивания полимерных молекул, от которой, в свою очередь, зависит эффективность иммобилизации фермента в матрицу гидрогеля. Как видно из представленных ниже графиков, процентное содержание гель-фракции в облученных образцах возрастает с увеличением дозы облучения. При замене ГЭЦ на ГПЦ (образец 4) выход гель-фракции приближается к 100 %, что может затруднять десорбцию фермента к субстрату.
100 -, 95 -к 90-
Я'
| 85 --в-
5 »О-75 -70 -
0 5 10 15 20 25 30 35 40 О, кГр
Рис. 1. Зависимость выхода гель-фракции от дозы облучения.
Величиной, характеризующей плотность радиационно-химического сшивания, является коэффициент равновесного набухания полученной полимерной сетки. Плотность поперечных сшивок напрямую влияет на такие свойства гидрогелей, как механическая прочность и эластичность, проницаемость и коэффициент диффузии активного компонента. На рис.2 изображена зависимость коэффициента равновесного набухания от дозы облучения для образцов различного состава. Из полученных данных видно, что при увеличении дозы облучения способность гидрогеля к набуханию снижается за счет увеличения плотности поперечных сшивок. Образец, содержащий только ГЭЦ и ПВП, характеризуется средними значениями коэффициента равновесного набухания, что свидетельствует о невысокой пористости данного гидрогеля. Образцы, содержащие альгинат натрия,
♦ гэц+пвп
■ ГЭЦ +ПВП+0.2АЛГ А ГЕЦ+ПВП+0.5АЛГ
■ ГПЦ+ПВП
С Я 0 X 11 в химии и химической технологии. Том XXV. 2011. №5(121)
напротив характеризуются высокими показателями коэффициента равновесного набухания и высоко пористой полимерной структурой. Данная закономерность объясняться тем, что альгинаты, как полиэлектролиты, могут образовывать комплексы с ферментом и также характеризуются низкой способностью к образованию поперечных сшивок при облучении.
90 -.
гэц+пвп
ГЭЦ+ПВП+0,2АЛГ ГЕЦ+ПВП+0.5АЛГ ГПЦ+ПВП
30 -20 -10 -0 -
0 5 10 15 20 25 30 35 40 О, кГр
Рис.2. Зависимость коэффициента равновесного набухания от дозы облучения для образцов различного состава
Для дальнейшего рассмотрения образец 4 не использовался, поскольку после облучения плотность полимерной сшивки слишком велика, что затрудняет десорбцию фермента к субстрату. Из данных, представленных в таблице: видно, что активность фермента сохраняется на достаточно высоком уровне при включении террилитина в матрицу гидрогеля. Изначально рассчитанная активность фермента составляла 2 ПЕ/мг В присутствии альгината натрия относительная протеолитическая активность гораздо выше, поскольку введение в систему полиэлектролита приводит к повышению стабилизации фермента, что соотносится с полученными ранее данными по расчету коэффициента равновесного набухания.
Относительная протеолитическая активность в образцах различного состава
Б, кГр
№ 15 20 25 30 35
Р А, А ¿мугн А, А А, А А, А А, А
ПЕ/мг ПЕ/мг % ПЕ/м г % ПЕ/мг % ПЕ/ мг %
1 1,248 88,5 1,089 77,3 0,904 64,1 0,730 51,8 0,56 39,4
2 1,509 96,1 1,441 91,8 1,358 86,5 1,309 83,4 1,22 77,6
3 1,665 96,8 1,622 94,3 1,579 91,8 1,529 88,9 1,48 85,8
(Л
а
80 -70 -60 50 -40 -
9
0 it & I U в химии и химической технологии. Том XXV. 2011. № 5 (121)
Выводы:
1. При использовании метода радиационного сшивания важно достичь оптимального значения плотности радиационно-химического сшивания. Оптимальный диапозон доз для данных систем составил 20 + 5 кГр.
2. В полимерных гидрогелях комплексообразование террилитина с альгинатом натрия, может происходить в результате перезарядки части групп белка вследствие воздействия электростатического поля ионогенной матрицы, а также в результате образования водородных связей. Протеолитическая активность в таких системах сохраняется на высоком уровне до и после облучения.
Библиографические ссылки
1. Химическая энзимология /И.В. Березин, К. Мартинек. М., 1983. С. 27
2. Террилитин и его клиническое применение / Г.Е. Гринберг, Г.А. Михайлец, М.С. Поляк [и др.]; М., 1980. 57. С. 84.
3. Пикаев А.К. Современная радиационная химия. М.: Наука, 1987. 448 с.
4. Кудряшов Ю.Б. Радиационная биофизика (ионизирующее излучение). М.: ФИЗМАТ ЛИТ, 2003. 442 с.
УДК 547.584:547.979.733
12 1 2* В.В. Усольцева , Е.К. Крылова , Г.В. Авраменко , В.М. Негримовский
1 Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия
2 Научно-исследовательский институт органических полупродуктов и красителей, Москва, Россия
СИНТЕЗ ПРОИЗВОДНЫХ 3,5-ДИБРОМФТАЛЕВОЙ КИСЛОТЫ
Two methods of synthesis of 3,5-dibromophthalic acid derivatives were elaborated. 3,5-Dibromophthalic acid was obtained by bromination of 3,4-dimethylaniline, dezamination and oxidation of intermediary formed 3,5-dibromo-o-xylene in optimal conditions with 34 % total yield. 3,5-Dibromo-2-cyanobenzamide was obtained from anthranilic acid by bromination, amidation, consecutive substitution of amino group for iodine and for cyano group.
Разработаны два метода получения производных 3,5-дибромфталевой кислоты. Бромированием 3,4-диметиланилина, дезаминированием и последующим оксилением промежуточно образующегося 3,5-дибром-о-ксилола в оптимальных условиях с суммарным выходом 34 % получена 3,5-дибромфталевая кислота. Бромированием антраниловой кислоты, ее амидированием и последовательной заменой аминогруппы на иод и затем на цианогруппу получены 3,5-дибром-2-цианобензойная кислота и ее амид.
Со времени открытия фталоцианинов прошло уже более 80 лет, но их привлекательность в качестве объектов исследования продолжает расти, что объясняется постоянным расширением их применения в различных об-
