CC BY
207
УДК 615.454.811.014.015
ИДЕНТИФИКАЦИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА ФЛАВОНОИДОВ В КОМПЛЕКСНЫХ ФИТОПРЕПАРАТАХ
МЛ. Огай 1 Э.Ф. Степанова 2 Л.П. Ларионов 3 А.Ю.Петров 3
1 Воронежский государственный университет
2 Пятигорская государственная фармацевтическая академия
3 Уральская государственная медицинская академия, г. Екатеринбург
e-mail: [email protected]
Поиск средств или их комбинаций, обладающих комплексным профилактическим и терапевтическим потенциалом — актуальная проблема. Предложены составы фитопрепаратов — фитогелей 1 и 2 на основе комплексных извлечений из лекарственного растительного сырья, обладающих ранозаживляющей активностью и предложены методики стандартизации — методами ТСХ и СФ. Для количественного определения суммы флавоноидов в фитогелях 1 и 2 была изучена возможность использования метода спектрофотометрии.
Ключевые слова: фитопрепараты, фитогели, флавонои-ды, аллоксановый диабет.
В настоящее время первостепенное внимание уделяется поиску средств или их комбинаций, обладающих комплексным профилактическим и терапевтическим потенциалом [1].
В последние десятилетия наблюдается повышенный интерес к лекарственным препаратам, получаемым из растительного сырья. Эта тенденция перспективно развивается в странах, традиционно использующих лекарственное растительное сырье в большом ассортименте (Китай, Корея, Вьетнам, Индия и др.), а также в странах, имеющих большие возможности для химического синтеза лекарственных соединений (США, Япония и др). Возрастающие требования к качеству лекарственных средств, в том числе на основе сырья растительного происхождения, вызвало необходимость разработки более совершенных методов и методик стандартизации фитопрепаратов. Эта задача может быть решена с использованием основных классов действующих веществ, входящих в состав готовой лекарственной формы, таких как флавоноиды, сапонины, органические кислоты и др.
Проблема качественного и количественного определения (В.В. Дячок и соавторы, 2004) всех составляющих является достаточно сложной задачей и с точки зрения выбора аналитического метода, и его инструментального оформления. Комплексные фитопрепараты были до недавнего времени мало представлены с точки зрения качественного и количественного определения.
Объективно обоснованным решением задач такого типа является определение действующих веществ по наиболее весомому или характерному составляющему компоненту (например, флавоноидов по рутину или кверцетину).
Методы исследования. В состав разработанных фитогелей входили спиртовые извлечения из лекарственного растительного сырья. Фитогель 1 включает спиртоводное извлечение из зверобоя продырявленного, прополис и облепиховое масло, и вспомогательные вещества; фитогель 2 — спиртоводные извлечения из лавра благородного, эхинацеи пурпурной, солодки голой, донника лекарственного, сок алоэ, индивидуальный препарат таурин и комплекс вспомогательных веществ. Фитогель-1: смешивали спиртоводное извлечение зверобоя, настойку прополиса, облепиховое масло (комплексное извлечение 1). В качестве основы использовали сплав ПЭГ-400 и ПЭГ-1500. Фитогель-2: смешивали спиртоводные извлечения эхинацеи, лавра, донника и солодки (комплексное извлечение 2), сок алоэ и таурин и вводили в основу — сплав ПЭГ-400 и ПЭГ-1500. Ранее была доказана ранозаживляющая активность разработанных гелей, у животных с экспериментальной патологией — аллоксановым диабетом [2].
Для качественного анализа индивидуальных и комплексных спиртовых извлечений использовали метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) [3]. Фитохимическое исследование проводили путем экстрагирования образцов сырья 40% этиловым спиртом с последующим хроматографированием в тонком слое сорбента (система — н-бутанол: ледяная уксусная кислота: вода = 5:1:1). На линию старта пластинки фирмы «Бо^М» размером 10х10 см со слоем силикагеля марки СТХ-1А (УФ индикатор - УФ-254) наносили микропипеткой по 30 мкл спиртовых извлечений из зверобоя, прополиса, эхинацеи, лавра, донника, солодки, комлексные извлечения 1 и 2, а также 10 мкл 1% раствора свидетеля - рутина. Хроматографическую пластинку помещали в камеру, которую предварительно насыщали парами элюэнта в течение 6 ч, а затем хроматографировали восходящим способом. Когда фронт элюэнта проходил фронт 10 см, пластинку вынимали, сушили на воздухе до исчезновения запаха растворителей и рассматривали в видимом и УФ-свете при длине волны 254 нм. В видимом свете обнаружены зоны желтого цвета, в УФ-свете они проявляются в виде пятен с синей флуоресценцией. Затем пластинки опрыскивали 0,1%-м раствором ванилина в концентрированной серной кислоте, нагревали 3 мин при 80 0С и рассматривали в видимом свете. На хроматограмме обнаружены зоны, для которых значения Rf совпадают с таковыми для рутина ^=0,31).
Спектрофотометрический анализ (СФ) используется для установления качественного и количественного состава, подлинности лекарственных средств, определения степени их чистоты. СФ характеризуется чувствительностью и высокой точностью. Данный метод анализа используют для количественного определения ингредиентов в одно- и многокомпонентных составах. В последних, в том случае, если спектр поглощения анализируемого компонента имеет участок, свободный от наложения светопо-глощения мешающих ингредиентов (либо поглощение очень мало, что ими можно пренебречь).
Для количественного определения суммы флавоноидов в фитогелях 1 и 2 была изучена возможность использования метода спектрофотометрии (СФ) на приборе СФ-46 ломо [4, 5].
Для спектрофотометрического анализа количественного содержания суммы флавоноидов нами исследованы спектры поглощения фитогелей 1 и 2, основы (сплав ПЭГ-400 и ПЭГ-1500) и раствора РСО рутина в комплексе с ДЬСЬз.
Максимумы поглощения окрашенных продуктов реакции суммы флавоноидов с Д1С1з представленны в табл. 1.
Таблица 1
Максимумы поглощения окрашенных продуктов реакции суммы флавоноидов с ЛЮ!3
Исследуемый образец Максимум поглощения, нм
РСО рутина 411 ± 2 нм
Фитогель 1 411 ± 3 нм
Фитогель 2 411 ± 3 нм
Основа (сплав ПЭГ-400 и ПЭГ-1500) Нет максимума
Спектр поглощения основы не имеет максимума и соответственно не накладывается на спектр комплексного фитопрепарата, им можно пренебречь. Полученные спектры изображены на рис. 1.
Флавоноиды в комплексном извлечении 1 и 2 стандартизировали по рутину с использованием цветной реакции с АІСІз в этанольной среде. Для проведения анализа сначала диализировали фитогели 1 и 2 по следующей методике: 1 г фитогеля (точная навеска) растворили в 10 мл спирта этилового 70%, экстрагировали в течении 20 минут, фильтровали. Полученный фильтрат помещали в коническую мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляли 10 мл 70% спирта этилового и 3 мл 5% раствора алюминия хлорида спиртового, нагревали на кипящей водяной бане в течение 10 мин, Охлаждали до комнатной температуры, прибавляли 0,1 мл кислоты уксусной ледяной, пе-
ремешивали и фильтровали через фильтр «синяя лента» в мерную колбу вместимостью 25 мл, ополаскивали фильтр и колбу 70% спиртом этиловым, доводили объем раствора тем же спиртом до метки, перемешивали и проводили определение.
длина волны,нм
Рис. 1. Спектры поглощения РСО рутина, фитогеля 1 и 2, гелевой основы
Измеряли также оптическую плотность раствора РСО рутина, приготовленного по методике, предложенной ГФ XI издания: 0,0250 г рутина, предварительно высушенного при температуре 135 °С до постоянной массы, растворяли в 10 мл горячего абсолютного спирта, переносили а мерную колбу на 250 мл с помощью сухого ацетона, доводили объем раствора тем же ацетоном до метки и измеряли оптическую плотность — Рст (0,393).
Содержание суммы флавоноидов (Х) в 1 г препарата, в пересчете на рутин, в процентах, вычисляли по формуле:
„ О,•а • Ш
1___ст____1_
~Б • а, • Ш
• 100%'
где — оптическая плотность испытуемого раствора;
Эст - оптическая плотность раствора рабочего СО рутина; аст - масса навески СО рутина, г; а1 - масса навески мази, г;
W1, Wср — разведения навески мази и навески СО рутина соответственно.
Результаты определения содержания суммы флавоноидов в фитогелях 1 и 2 в пересчете на рутин приведены в табл. 1 и 2 соответственно:
Таблица 2
Результаты определения содержания суммы флавоноидов в фитогеле 1 в пересчете на рутин
№ п/п йі Х, % Метрологические характеристики
1 0,563 0,358 Хср = 0,361; ДХср = 0,0015; Х = 0,361±0,0015; Б = 0,00219; Бх = 0,000894; £ ср = 0,415%
2 0,573 0,364
3 0,568 0,361
4 0,569 0,362
5 0,565 0,359
6 0,570 0,362
Таблица 3
Результаты определения содержания суммы флавоноидов в фитогеле 2 в пересчете на рутин
№ п/п Di Х, % Метрологические характеристики
1 0,791 0,503 Хср = 0,507; ДХср = 0,00167; Х = 0,507±0,00167; S = 0,0338; Sx = 0,0142; 1 ср = 0,329%
2 0,793 0,504
3 0,798 0,508
4 0,798 0,508
5 0,795 0,506
6 0,796 0,507
Таким образом, нами были предложены составы фитопрепаратов — фитогелей 1 и 2 на основе комплексных извлечений из лекарственного растительного сырья и предложены методики стандартизации — методами ТСХ и СФ. На хроматограмме обнаружены зоны, для которых значения Rf совпадают с таковыми для рутина.
Для количественного определения суммы флавоноидов в фитогелях 1 и 2 была изучена возможность использования метода спектрофотометрии. Содержание флаво-ноидов, в пересчете на рутин в фитогеле 1 составило 0,361%, а в фитогеле 2 — 0,507%.
Литература
1. Растительные флаволигнаны. Биологическая активность и терапевтический потенциал / С.В. Луценко [и др.]. - Москва, 2006. - 236 с.
2. Огай, М.А. Фармакологические исследования и технология фитогелей для коррекции последствий сахарного диабета / М.А. Огай, Э.Ф. Степанова, Л.П. Ларионов, А.Ю. Петров // Журн. "Вестник Воронежского государственного университета". Серия: Химия. Биология. Фармация. - 2009. - № 2. - С. 171-173.
3. Клышев, Л.К. Флавоноиды растений (распространение, физико-химические свойства, методы исследования) / Л.К. Клышев, В.А. Бандюкова, Л.С. Алюкина. - Алма-Ата: Наука, 1978. - 220 с.
4. Беликов, В.В. Реакции комплексообразования в анализе флавоноидов / В.В. Беликов, Т.В. Точкова // Всесоюз. Симпоз. по фенольным соединениям (2; 1971; Алма-Ата). - Алма-Ата: тез. докл. ... 1973. - С. 168-172.
5. Беликов, В.В. Методы анализа флавоноидных соединений / В.В. Беликов, М.С. Шрайбер / / Фармация. - 1970. - Т. 19, № 1. - С. 66-72.
IDENTIFICATION AND QUANTIFICATION OF FLAVONOIDS IN PHITOPREPARATION COMPLEX
Search for vehicles or combinations of them with comprehensive preventive and therapeutic potential is the actual problem. Requested to formulate herbal remedies - fitogeley 1 and 2 on the basis of complex extracts from medicinal plants, having wound healing activity, and proposed methods of standardization - by TLC and SF. To quantify the amount of flavonoids in fitogelyah 1 and 2 was explored using the method of spectrophotometry.
Key words: herbal medicine, fitogeli, flavonoids, alloxan diabetes.
M.A. Ogai 1 E.F. Stepanova 2 L.P. Larionov 3 A.J. Petrov 3
1 Voronezh State University, Voronezh
2Pyatigorsk State Pharmaceutical Academy, Pyatigorsk
3 Ural State Medical Academy Yekaterinburg, Ekaterinburg
e-mail: [email protected]
