CC BY
184
К.Е. Цимбалова, О.Л. Колбасова
ная культура клеток тестикул ягнят) (сокультивирова-ние в течение 4 пассажей).
Выявлена кросс-контаминация рабочей расплодки клеток Vero-B (ПЛК почки африканской зеленой мартышки) клетками свиного происхождения. Аутотентич-ность клеток YPI-4 (ПЛК почки овцы) не подтверждена, популяция контаминирована клетками африканской зеленой мартышки. Видовая принадлежность клеток ПЭКр-85 (ПЛК почки эмбриона кролика) также не подтверждена, установлено наличие клеток рода Bos Taurus. Изучение клеточной культуры, поименованной как почка сибирского горного козерога (ПСГК) не выявило кле-
Библиография
1. Каталог коллекции клеточных культур ГНУ ВНИИВВиМ / Юрков С.Г., Колбасова О.Л. и др. — Покров, 2010.
2. Кулешов К.В. Определение видовой принадлежности клеточных культур методами молекулярно-генетического анализа // Автореф. дис... канд. биол. наук. — Щелково, 2009.
3. Филатов А.В. Получение, стабилизация и биологические свойства культур клеток тканей диких животных // Автореф. дис. канд. вет. наук. — Покров, 2008.
ток, относящихся в видовом отношении к Capra sibir-ica. Методом мелекулярно-генетического анализа было установлено присутствие клеток вида Sus scrofa, что еще раз подтверждает данные сотрудников ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии о контаминации клетками свиного происхождения [3, 4]. Что касается гибридной культуры клеток ror/G2 (получена методом слияния перевиваемых клеток тестикул поросенка, дефектных по ферменту гипоксантингуанинфосфорибозилтрансфе-разе и первичной культуры клеток гепатоцитов кролика), то в ней обнаружен геном свиньи и произошла полная элиминация генома кролика.
4. Юрков С.Г., Филатов А.В., Смыслова Н.Ю., Жданова H.A. К вопросу о видовой принадлежности линии клеток почки сибирского горного козерога / Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных // Мат-лы Междунар. науч.-практич. конф. ГНУ ВИЭВ. — М.: ИзографЪ, 2006.
5. Chiong Ed., Dadbin A., Harris L.D., Sabichi A.L, Grossman H.B. The Use of Short Tandem Repeat Profiling To Characterize Human Bladder Cancer Cell Lines // J. Urol., 2009; 181 (6): 2737—2748.
Summary
K.E. Tsimbalova, O.L. Kolbasova. Control of the cross-contamination of transplanted cell lines from the collection of National Research Institute of Veterinary Virology and Microbiology by molecular-genetic methods.
RT-PCR test has been used for the control of the origin of some cell line cultures obtained from the museum of National Research Institute of Veterinary Virology and Microbiology.
УДК 619: 616.98: 616-076
Идентификация генома вируса геморрагической болезни кроликов методом ПЦР
Г.С. Бурмакина1, А.С. Малоголовкин1, А.В. Николаев2, А.В. Луницин1, С.Ж. Цыбанов1
1 ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии» Россельхозакадемии (Покров).
2 ЗАО «ЛЕККО» (пос. Вольгинский).
Ключевые слова: вирусная геморрагическая болезнь кроликов, диагностика, ПЦР
Сокращения: ВГБК — вирусная геморрагическая болезнь кроликов, кДНК—комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота, ИФА — иммуноферментный анализ, МЭБ — Международное эпизоотическое бюро, ОТ-ПТТР— полимеразная цепная реакция со стадией обратной транскрипции, п.н. — пары нуклеотидов, РГА — реакция гемагглютинации, РНК—рибонуклеиновая кислота
Введение
Вирусная геморрагическая болезнь кроликов — остро протекающая, высоко контагиозная болезнь, харак-
теризующаяся развитием геморрагического диатеза во всех органах, в особенности в легких и печени. Возбудитель — вирус из рода Lagovirus, семейства Caliciviri-dae, геном которого представлен линейной одноцепочечной плюс-РНК. Поражаются кролики старше 1,5-месячного возраста. Заболеваемость может достигать 70...80 %, летальность — 90...100 %. О заболевании животных других видов и человека не сообщалось.
Болезнь впервые была идентифицирована в Китае в 1984 г. и в течение нескольких лет распространилась по территории Европы и бывшего СССР. Однако британские ученые на основании серологических и молекулярно-диагностических исследований показали, что
РВЖ • СХЖ • № 1/2012
Идентификация генома вируса геморрагической болезни кроликов методом ПЦР
возбудитель ВГБК циркулировал как авирулентный на территории Великобритании более 50 лет назад и задолго до того, как сама болезнь была идентифицирована [1].
В последние годы вспышки ВГБК регистрировались более чем в 40 странах мира, включая многие государства Европы, Северной и Латинской Америки, Африки, Китай, Австралию и другие [2]. В 2010 г. зарегистрированы новые очаги ВГБК на ранее благополучных территориях США, Венесуэлы и Кубы.
Первые сообщения о болезни в нашей стране датируются 1986 г. ВГБК за несколько лет широко распространилась по территории бывшего СССР. Благодаря массовой вакцинации к середине 90-х гг. регистрация болезни в России почти прекратилась. Однако с 2000 г. на территории Российской Федерации число вспышек ВГБК существенно возросло. С 2005 по 2010 гг. заболевание зарегистрировано уже более чем в 15 областях.
Актуальная задача в России — разработать универсальные методы экспресс-диагностики ВГБК на основе анализа генома и внедрить их в ветеринарную практику Одним из таких методов является ОТ-ПЦР, которая, дополняя серологические и вирусологические методы, дает возможность быстро идентифицировать возбудителя ВГБК.
Цель исследования
Разработать ОТ-ПЦР, позволяющую обнаруживать РНК возбудителя ВГБК в пробах органов и тканей инфицированных кроликов.
Материалы и методы
Материалом для исследований служили пробы органов и кровь, отобранные в разные сроки после экспериментального заражения восприимчивых кроликов ВГБК (штаммы «В-87», «Белгородский-03», «Манихи-но-09»). В работе также были использованы полевые изоляты вируса ГБК, выделенные из патологического материала при вспышках болезни в Московской, Владимирской, Нижегородской и Рязанской областях (2004— 2011 г). Штаммы вируса ГБК были получены из коллекции музея вирусных штаммов ГНУ ВНИИВВиМ (Покров).
РНК выделяли с использованием гуанидинового лизи-рующего буфера при последующем применении нуклео-сорбента. Чтобы сократить время пробоподготовки при выделении РНК из образцов органов, гомогенизировали кусочек органа в лизирующем буфере.
Праймеры подбирали на основе анализа нуклеотидных последовательностей вируса ГБК, имеющихся в базе данных GeneBank. Множественное выравнивание и анализ последовательностей осуществляли с помощью компьютерной программы «BioEdit 6.0». Для расчета праймеров был выбран участок высококонсервативной области гена VP60.
ПЦР и кДНК синтезировали с использованием подобранных специфических праймеров. Амплификацию проводили в термоциклере «Терцик» ДНК-Технология (г. Москва) и «Palm cycler» (Corbett Research, Австралия).
Результаты ПЦР учитывали путем анализа продуктов амплификации методом электрофореза в 2%-м геле агарозы.
Определение аналитической чувствительности ОТ-ПЦР:
1 - маркер; 2 - исходная вирусная суспензия;
3...6 - разведения вирусной суспензии 1:10 (3), 1:102 (4), 1:103 (5), 1:104 (6);
7 - отрицательный контроль
Специфичность метода оценивали на пробах органов клинически здоровых кроликов, а также на органном и культуральном материале вирусов миксомы кроликов и везикулярной экзантемы свиней. Для определения аналитической чувствительности использовали 10-кратные разведения штамма «В-87» вируса ГБК с известным титром инфекционной активности.
Результаты и обсуждение
Рассчитанные специфические олигонуклеотиды фланкировали участок в 398 п.н. Их использовали для ОТ-ПЦР. В ходе работы были подобраны условия постановки ПЦР (температура отжига праймеров, время денатурации и синтеза, концентрация праймеров, количество матрицы). Для синтеза кДНК в реакционную смесь, содержащую 4 мкл буфера для обратной транскрипции 5-кратной концентрации, 2 мкл 10 мМ смеси dNTP, 10 пмоль специфического праймера, добавляли 5 мкл РНК вируса ГБК и инкубировали 30 мин при 37°С. Раствор кДНК (5 мкл) амплифицировали в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 10 пмоль каждого праймера, 0,2 мМ смеси dNTP, 5х буфер (50 мМ Трис HCl pH 8,0.. .9,2, 50 мМ KCl, 1,0.. .4,0 мМ MgCl2), 2 ед. Taq-полимеразы. Амплификацию проводили в термоциклере «Терцик» ДНК-Технология (г. Москва) и «Palm cycler» (Corbett Research, Австралия) при следующем температурном режиме: денатурация при 94°С — 30 с, отжиг при 60°С —30 с, элонгация при 72°С — 30 с. Всего 42 цикла.
При определении специфичности метода использовали штаммы и изоляты гетерологичных вирусов. В результате исследований не было обнаружено ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Специфичность была подтверждена межлабораторными комиссионными испытаниями, проведенными в ГНУ ВНИИВВиМ. Разработанная методика ОТ-ПЦР имеет диагностическую специфичность и чувствительность на уровне 100 %. Показатели специфичности и чувствительности рассчитывали согласно рекомендациям МЭБ [3].
Аналитическую чувствительность ОТ-ПЦР определяли тестированием 10-кратных последовательных разведений ВГБК штамм «В-87». Пределом аналитической чувствительности являлось разведение 10-3 от исходного образца с титром инфекционной активности 104,5 LD^/мл (рис.).
Чтобы определить возможность применения метода ОТ-ПЦР для обнаружения генома вируса ГБК в различных органах и тканях инфицированных домашних кроликов на разных стадиях болезни, экспериментально воспроизводили инфекцию на клинически здоровых и серонегативных к вирусу ВГБК кроликах в возрасте 3.3,5 мес. Животных заражали внутримышечно
Г.С. Бурмакина, А.С. Малоголовкин, А.В. Николаев, А.В. Луницин, С.Ж. Цыбанов
из расчета 100 LD50. У инфицированных кроликов через 15.25 ч отмечали клинические проявления болезни: угнетение, отказ от корма, носовое кровотечение и гибель в течение 24.96 ч.
Животных, которые не погибли после инфицирования вирусом ГБК, подвергли эвтаназии на 7-е сутки. Пробы органов и тканей от инфицированных кроликов исследовали методом ОТ-ПЦР.
С использованием ОТ-ПЦР РНК ВГБК была выявлена в печени, селезенке, сердце, легких, мышцах, почках, коже и шерсти зараженных животных. Кроме того, посредством разработанной методики можно выявлять РНК вируса в пробах печени инфицированных кроликов в ранние (1-е сутки) и поздние (4-5-е сутки) сроки после заражения. В ходе экспериментов методом ОТ-ПЦР было установлено наличие РНК возбу-
Библиография
1. Moss S.R., Turner S.L., Trout R.C., White P.J., Hudson P.J., Desai A., Armesto M., Forrester N.L., Gould E.A. Molecular epidemiology of Rabbit haemorrhagic disease virus // J. Gen. Virol., 2002; 83: 2461—2467.
2. Tian L., Liao J., Li J., Zhou W., Zhang X., Wang H. Isolation and identification of a non-haemagglutinating strain of rabbit hemorrhagic
дителя ВГБК в печени инфицированных кроликов, не павших после заражения, даже в тех случаях, когда результат РГА и ИФА был отрицательным.
Выводы
Разработана методика ОТ-ПЦР, посредством которой можно обнаруживать геном вируса ГБК в пробах различных органов и тканей. Специфичность метода подтверждена его отрицательными показаниями при исследовании проб органов интактных животных, а также вирусов миксомы кроликов и везикулярной экзантемы. Аналитическая чувствительность ОТ-ПЦР составляет 101,5 LD5o/мл. Посредством разработанной методики удается выявлять РНК вируса в пробах печени инфицированных кроликов в разные сроки после заражения.
disease virus from China and sequence analysis for the VP60 Gene // Virus Genes, 2007; 35: 745—752.
3. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. Sixth Edition. Office intrrnational des epizooties, 2008. — http://www.oie.int/international-standard-setting/terrestrial-manual/.
Summary
G.S. Burmakina, A.S. Malogolovkin, A.V. Nikolaev, A.V. Lunitsin, S.G. Cibanov. Identification of the rabbit hemorrhagic disease virus genome by PCR. In the article the results of RT-PCR elaboration for RHDV detection are presented. High specificity and sensitivity of this method were shown experimentally. Samples of different organs (liver, spleen, lungs, heart, kidneys, muscles, skin and hair) of infected animals were tested for RHDV genome identification RT-PCR. The elaborated technique allows to detect RHDV genome in all these organs on different days after infection.
УДК 619: 616.98: 616-076
Тест-система на основе ПЦР в реальном времени для обнаружения парвовируса свиней
О.В. Елисеева1, О.Е. Латышев1, Т.В. Гребенникова12, Т.И. Алипер1,2
1 ФГБУ «НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития РФ (Москва).
2 АНО «Научно-исследовательский институт диагностики и профилактики болезней человека и животных» (Москва).
Ключевые слова: парвовирус свиней, полимеразная цепная реакция в реальном времени Сокращения: КЧС—классическая чума свиней, ПВИС— парвовирусная инфекция свиней, ПВС—парвовирус свиней, п.н. — пары нуклеотидов, ППЭС—перевиваемая линия клеток почек эмбрионов свиней, ПЦР—полимеразная цепная реакция, РГА — реакция гемагглютинации, РРСС—репродуктивно-респираторньй синдром свиней, СПМИ — синдром послеотъемного мультисистемно-го истощения, ЦВС-2 — цирковирус свиней 2-го типа
Введение
Парвовирус свиней относится к категории важных патогенов, которые вызывают нарушения репродуктивной функции свиноматок и наносят значительный экономический ущерб свиноводческим хозяйствам [12]. Болезнь, вызванная данным вирусом, клинически проявляется только у супоросных свиноматок и характеризуется малочисленными пометами, гибелью эмбрионов и плодов с рассасыванием и мумификацией, рождением мертвых плодов, бесплодием, повторным
РВЖ • СХЖ • № 1/2012
