CC BY
189
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА
Контроль кросс-контаминации перевиваемых линий клеток коллекции ГНУ ВНИИВВиМ молекулярно-генетическими методами
К.Е. Цимбалова, ОЛ. Колбасова, ГНУ «Всероссийский НИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии» Россельхозакадемии (Покров)
Ключевые слова: культура клеток, ПЦР, кросс-контаминация
Сокращения: ПЛК — перевиваемые линии клеток, ПЦР — полимеразная цепная реакция
Введение
В последнее время в клеточной биотехнологии, особенно, при диагностике вирусных болезней, возрастает значение ПЛК, созданы крупные банки и национальные коллекции аттестованных клеточных культур. Однако установлено, что перевиваемые клетки из тканей сельскохозяйственных и домашних животных часто конта-минированы клетками другого вида (исторически основным перекрестным контаминантом являются клетки Н^а и L, которые быстро перерастают большинство других клеток в культуре) [3]. Контаминация клеточных линий может изменить результаты исследования, которые базируются на экспериментах с культурами клеток. Среди других последствий контаминации клеточных линий можно назвать невозможность сравнить результаты, полученные в разных лабораториях, снижение эффективности экспериментов, денежные убытки, проблемы с лицензированием лекарственного средства и получением на него патента [5]. Таким образом, несмотря на то, что в настоящее время вирусологи располагают достаточно широким выбором клеточных субстратов с охарактеризованными свойствами, очевидна необходимость использовать только чистые стабилизированные клеточные культуры.
В недалеком прошлом видовую принадлежность клеточной линии подтверждали прежде всего посредством кариотипирования или с помощью иммунологических методов. Позже начали использовать изоферментный анализ. Преимущества данного метода: быстрота получения результатов и простота выполнения. Его используют, чтобы подтвердить видовую принадлежность и обнаружить перекрестную контаминацию клеточной культуры, если клетки-контаминанты в ней составляют 10 % и более. Однако необходимость глубоких профессиональных навыков при исследовании спектра изоферментов клеточной линии делают этот метод анализа трудоемким, а результаты — сложными для интерпретации. Для идентификации клеточных линий используют также видоспецифические антисыворотки.
В настоящее время широкое распространение получили молекулярно-генетические методы идентификации биологических объектов. Из них ПЦР — наиболее известный и эффективный. Принцип ПЦР основан на мно-
гократном умножении изучаемой части генома с последующей детекцией продукта посредством различных методик. Время анализа уменьшается до одного дня, а по эффективности ПЦР превосходит традиционные методы идентификации клеток в культуре.
Цель исследования
Определить видовую принадлежность клеточных культур музея ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии [1] методами молекулярно-генетического анализа (ПЦР РВ).
Материалы и методы
ПЛК культивировали согласно рекомендациям, изложенным в паспортах на каждую культуру клеток.
Хранившиеся при -1960С в жидком азоте ПЛК размораживали и, после того как клетки восстанавливали свои морфологические и ростовые характеристики, приступали к анализу видовой принадлежности. Всего нами были проанализированы 29 клеточных культур от 11 видов млекопитающих.
ДНК из образцов суспензии культур клеток выделяли коммерческими наборами «ДНК-сорб-B» и «Рибо-преп» («Амплисенс», Россия).
Видоспецифичные олигонуклеотидные праймеры и зонды к нуклеотидным последовательностям генов cytb и COI для идентификации видовой принадлежности клеток синтезированы в лаборатории компании «Ли-тех» по данным К.В. Кулешова [2].
ПЦР РВ проводили в микропробирках объемом 0,2 мл на амплификаторе RotorGene 6000 (Corbett Research, Австралия), используя смесь дезоксирибонуклеотидт-рифосфатов (дНТФ), TaqF ДНК-полимеразу и 5-кратный ПЦР-буфер (15мМ MgCl2). Температурный профиль амплификации был следующим: начальная денатурация: 95оС — 5 мин; затем 5 раундов с повышенной температурой отжига без учета флуоресцентного сигнала: 95оС — 20 с, 61оС — 20 с, 72оС — 20 с. Последующие 35 раундов проводили с детекцией флуоресценции на стадии отжига праймеров: 95оС — 20 с, 60оС — 20 с, 72оС — 20 с [1].
Результаты и обсуждение
В результате идентификации культур клеток музея ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии подтверждена видовая принадлежность и отсутствие кросс-контаминации 23 клеточных культур.
Показана быстрая и полная элиминация генома овцы в экспериментально смешанной культуре клеток CV-1+ТЯ (ПЛК почки африканской зеленой мартышки + первич-
К.Е. Цимбалова, О.Л. Колбасова
ная культура клеток тестикул ягнят) (сокультивирова-ние в течение 4 пассажей).
Выявлена кросс-контаминация рабочей расплодки клеток Vero-B (ПЛК почки африканской зеленой мартышки) клетками свиного происхождения. Аутотентич-ность клеток YPI-4 (ПЛК почки овцы) не подтверждена, популяция контаминирована клетками африканской зеленой мартышки. Видовая принадлежность клеток ПЭКр-85 (ПЛК почки эмбриона кролика) также не подтверждена, установлено наличие клеток рода Bos Taurus. Изучение клеточной культуры, поименованной как почка сибирского горного козерога (ПСГК) не выявило кле-
Библиография
1. Каталог коллекции клеточных культур ГНУ ВНИИВВиМ / Юрков С.Г., Колбасова О.Л. и др. — Покров, 2010.
2. Кулешов К.В. Определение видовой принадлежности клеточных культур методами молекулярно-генетического анализа // Автореф. дис... канд. биол. наук. — Щелково, 2009.
3. Филатов А.В. Получение, стабилизация и биологические свойства культур клеток тканей диких животных // Автореф. дис. канд. вет. наук. — Покров, 2008.
ток, относящихся в видовом отношении к Capra sibir-ica. Методом мелекулярно-генетического анализа было установлено присутствие клеток вида Sus scrofa, что еще раз подтверждает данные сотрудников ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии о контаминации клетками свиного происхождения [3, 4]. Что касается гибридной культуры клеток ror/G2 (получена методом слияния перевиваемых клеток тестикул поросенка, дефектных по ферменту гипоксантингуанинфосфорибозилтрансфе-разе и первичной культуры клеток гепатоцитов кролика), то в ней обнаружен геном свиньи и произошла полная элиминация генома кролика.
4. Юрков С.Г., Филатов А.В., Смыслова Н.Ю., Жданова H.A. К вопросу о видовой принадлежности линии клеток почки сибирского горного козерога / Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных // Мат-лы Междунар. науч.-практич. конф. ГНУ ВИЭВ. — М.: ИзографЪ, 2006.
5. Chiong Ed., Dadbin A., Harris L.D., Sabichi A.L, Grossman H.B. The Use of Short Tandem Repeat Profiling To Characterize Human Bladder Cancer Cell Lines // J. Urol., 2009; 181 (6): 2737—2748.
Summary
K.E. Tsimbalova, O.L. Kolbasova. Control of the cross-contamination of transplanted cell lines from the collection of National Research Institute of Veterinary Virology and Microbiology by molecular-genetic methods.
RT-PCR test has been used for the control of the origin of some cell line cultures obtained from the museum of National Research Institute of Veterinary Virology and Microbiology.
УДК 619: 616.98: 616-076
Идентификация генома вируса геморрагической болезни кроликов методом ПЦР
Г.С. Бурмакина1, А.С. Малоголовкин1, А.В. Николаев2, А.В. Луницин1, С.Ж. Цыбанов1
1 ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии» Россельхозакадемии (Покров).
2 ЗАО «ЛЕККО» (пос. Вольгинский).
Ключевые слова: вирусная геморрагическая болезнь кроликов, диагностика, ПЦР
Сокращения: ВГБК — вирусная геморрагическая болезнь кроликов, кДНК—комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота, ИФА — иммуноферментный анализ, МЭБ — Международное эпизоотическое бюро, ОТ-ПЦР— полимеразная цепная реакция со стадией обратной транскрипции, п.н. — пары нуклеотидов, РГА — реакция гемагглютинации, РНК—рибонуклеиновая кислота
Введение
Вирусная геморрагическая болезнь кроликов — остро протекающая, высоко контагиозная болезнь, харак-
теризующаяся развитием геморрагического диатеза во всех органах, в особенности в легких и печени. Возбудитель — вирус из рода Lagovirus, семейства Caliciviri-dae, геном которого представлен линейной одноцепочечной плюс-РНК. Поражаются кролики старше 1,5-месячного возраста. Заболеваемость может достигать 70...80 %, летальность — 90...100 %. О заболевании животных других видов и человека не сообщалось.
Болезнь впервые была идентифицирована в Китае в 1984 г. и в течение нескольких лет распространилась по территории Европы и бывшего СССР. Однако британские ученые на основании серологических и молекулярно-диагностических исследований показали, что
РВЖ • СХЖ • № 1/2012
