Идентификация бактерий рода Alicyclobacillus во фруктовых соках и пути предотвращения их порчи Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

Идентификация бактерий рода Alicyclobacillus во фруктовых соках и пути предотвращения их порчи

1Р.Л. Филиппова, А.А. Мухамеджанова, А.Ю. Колеснов

Московский государственный университет пищевых производств

Обнаружение и идентификация

AUcyclobacШus acidoterrestris

Идентификацию Alicyclobacillus проводят путем анализа культуральных свойств, морфологических характеристик клеток и спор (форма, окрашивание по Граму, подвижность), физиологических характеристик (анаэробный рост, образование кислоты из эритритола, использование цитрата), химических характеристик (образование ю-циклогексил жирных кислот С17 и С19), роста при различных температурных условиях и различных значениях рН, тестах по потреблению углеродного источника, хлористого натрия и т. д.

Для определения бактерий рода Alicyclobacillus в апельсиновом соке необходима предварительная тепловая обработка, позволяющая активировать споры, находящиеся в покое. Часто для этого используют следующий способ: образцы, разведенные в буферном соляном растворе или в воде, нагревают в течение 10 мин при температуре 80...85 °С, что приводит к уничтожению вегетативных клеток и активации спор. Для выявления и определения роста бактерий в образцах применяют микробиологические методы: прямой высев разведенных образцов на поверхность агаровой среды, внесение образцов в расплавленную среду (на чашках Петри) и внесение в жидкую среду [1].

В последнее время появилось множество методов для выявления, подтверждения и количественной оценки бактерий рода Alicyclobacillus в соках. Микробиологической группой 1Ри (Международная федерация производителей соков) совместно с Бразильской ассоциацией производителей цитрусовых (ЛБЕСНгиз) было отобрано четыре наиболее перспективных метода из представленного списка 1Ри [2]. Различия этих микробиологических методов, кроме окончательных подтверждающих тестов, связаны с составом питательной среды и ее доступностью, условиями тепловой обработки с целью активации спор, условиями инкубации, способствующими развитию бактерий и т. д. Кроме того, эти методы имеют различные уровни чувствительности и специфичности. В настоящее время в лабораториях перерабатывающих пред-

приятий Бразилии применяют метод, включающий выделение бактерий на диагностической среде BAT. Однако этот метод не предусматривает использования подтверждающего теста. В состав среды BAT входят экстракт дрожжей, глюкоза, CaCl2 • 2H2O, MgSO4 • 7H2O, (NH4) 2SO4, KH2PO4, микроэлементы и агар. Значение рН среды составляет 4,0. Метод имеет высокую чувствительность и позволяет выделять бактерии на уровне 102-104 КОЕ/мл,

но специфичность его самая низкая. Для эффективного применения этого метода необходимо проводить подтверждающие тесты.

В качестве подтверждающих тестов можно использовать различные методы:

органолептический анализ сока на присутствие гваякола. Однако сенсорная оценка возможна при высоком уровне об-семененности инфицированного продукта (не менее 106-107 КОЕ/мл). Недостатки метода: субъективность оценки, мешающий фактор — оставшийся запах виниловой кислоты, затруднена стандартизация [2, 3];

анализ ю-циклогексил жирных кислот С17 и С19, содержащихся в клеточной оболочке мембраны клетки и характерных для Alicyclobacillus acidoterrestris и Alicyclobacillus acidocaldarius, с применением газожидкостной хроматографии; метод специфичен, недостатки: длительная и сложная подготовка образцов для анализа, дорогостоящее оборудование [2];

Схема обнаружения и идентификации бактерий рода Alicyclobacillus:

ВАМ — агаровая модифицированная среда; PDA — агаровая среда: картофельная

декстроза — агар; PDB — картофельно-декстрозный бульон

.....""".......

'4•2004

традиционный анализ бактериального инфицирования на различных диагностических средах (BAM-агаровая модифицированная среда, PDA-картофельно-декст-розный агар), идентификацию проводят по изменению окраски среды с использованием бромфенолсинего (образование кислоты из эритритола), а также по морфологической характеристике клеток и спор (см. рисунок) [4];

экспресс-анализ гваякола с помощью метода ПЦР (полимеразная цепная реакция), заключающийся в выявлении гена декарбоксилазы-фермента, участвующего в образовании гваякола из феруловой кислоты сока; высокочувствительный, недостатки метода: дорогостоящий, требует специально обученного персонала [3];

пероксидазный экспресс-метод (образование тетрагваякола из пероксидазы в присутствии пероксида водорода с последующей спектрофотометрией при 470 нм); метод специфичен, воспроизводим, наиболее перспективен для использования в качестве стандартного метода, доступен, прост в исполнении [3];

В ПНИЛ биотехнологии пищевых продуктов Московского государственного университета пищевых производств (МГУПП) для обнаружения и идентификации бактерий рода Alicyclobacillus разработан модифицированный микробиологический метод. В качестве прототипа использован базисный метод, применяемый в Бразилии, включающий высев определенного количества продукта, прошедшего предварительную тепловую обработку, в жидкую накопительную среду специального состава; инкубирование посевов при установленных условиях; пересев культу-ральной жидкости на агаризованную среду (BAT); инкубирование посевов при оп-ределеных режимах с последующим подсчетом типичных колоний; для подтверждения по культуральным, морфологическим и биохимическим признакам принадлежности выделенных колоний к бактериям рода Alicyclobacillus; высев определенного количества продукта или его разведения на агаризованную среду с последующим подсчетом типичных колоний. Идентификация бактерий рода Alicyc-lobacillus с использованием бромфенол-синего (образование кислоты из эритри-тола) и других подтверждающих тестов.

В настоящее время микробиологический анализ бактерий рода Alicyclobacillus в концентрированных соках, а также в готовых упакованных соках проводят в ПНИЛ биотехнологии пищевых продуктов МГУПП в рамках программ оценки и мониторинга качества соковой продукции, предлагаемой на российском рынке.

Применение модифицированной методики позволило ПНИЛ биотехнологии пищевых продуктов выделить и идентифицировать ацидотермофильные споро-образующие бактерии рода Alicyclo-

bacillus из проблемных соков, к которым относятся яблочный, апельсиновый, сок маракуйи.

Возможности предотвращения инфицирования концентрированных соков бактериями рода Alicyclobacillus

Бактерии рода A. acidoterrestris являются ацидотермофильными возбудителями порчи фруктовых соков, образующие продукты обмена веществ, приводящие, в свою очередь, к нежелательным изменениям органолептических показателей соков. Эти микроорганизмы обнаружены в концентрированных соках различных производителей.

Источниками заражения бактериями рода Alicyclobacillus служат почва, поверхность фруктов и листьев, вода для орошения. Во всех проанализированных образцах почвы обнаружены значительные количества бактерий рода Alicyclobacillus, составлющие 104-106 КОЕ/г. Бактерии рода Alicyclobacillus были обнаружены также на поверхности плодов и листьев в количестве 10-102 КОЕ/кг продукта. Образцы плодов и листьев, собранные сразу после дождливого дня или во время сезона дождей, имели более низкую концентрацию бактерий рода Alicyclo-bacillus по сравнению с образцами, собранными в сухой сезон [1].

Таким образом, эти микроорганизмы всегда присутствуют в соках, так как они обнаруживаются в любой почве, на которой растут деревья, а мойка плодов не способна полностью избавить их от бактерий.

Учитывая важность микробиологической безопасности пищевых продуктов, должны использоваться два различных, дополняющих друг друга подхода предотвращения инфицирования соков бактериями рода Alicyclobacillus.

Первый подход — предупреждение загрязнения. Предупреждение микробиологического загрязнения в процессе производства должно заключаться в соблюдении санитарных правил, поддержании необходимой температуры хранения, способствующей подавлению роста нежелательных микроорганизмов.

Второй подход — частичное снижение микробиологического загрязнения за счет тщательной инспекции и мойки. Использование только кондиционных плодов, тщательная инспекция и мойка обеспечат получение качественного продукта на ранних стадиях его приготовления. В дополнение к этому для дезинфекции можно применять химические препараты и тепловую обработку [5].

Использование тепловой обработки плодов позволяет значительно снизить микробиологическое загрязнение. Нежелательные микроорганизмы могут быть

уничтожены с помощью быстрого погружения плодов в горячую воду (80 °C, 2 мин или 70 °С, 4 мин) или обработкой горячей проточной водой. Результаты органолеп-тической оценки фруктовых соков не выявили различий между соком, полученным из плодов, прошедших термическую обработку, и необработанным соком. Таким образом, тепловую обработку можно использовать для различных видов фруктов, с разным типом кожицы, но температурный режим в этом случае должен быть экспериментально подобран для каждого вида отдельно [5].

В пищевой промышленности широко распространено применение химических дезинфицирующих препаратов для борьбы с микробиологическим инфицированием. Однако действие химических препаратов ограничено и не всегда предсказуемо. Так, например, к химическим препаратам, протестированным на эффективность действия по снижению популяции E. coli 0157:Н7 на поверхности свежих фруктов, относят хлорированную воду, пероксид водорода, озон, диоксид хлора, комбинированные препараты с Н2О2 с другими агентами [5].

Pao и др. (1999) определили бактерицидную эффективность покрытия воском апельсинов. Кроме того, на поверхности апельсинов было проведено исследование комбинированного воздействия тепловой и щелочной обработки. С этой целью использовали воски (рН 8,4-11,6), приготовленные на различной восковой основе и различных растворителях. Проведенные тесты показали, что степень удаления загрязнения с поверхности цитрусовых плодов зависит от типа кожуры (гладкая, слабо или сильно ребристая). Умеренная тепловая обработка и высокое значение рН воска позволяют применять этот прием для снижения микробиологического загрязнения на поверхности фруктов [5].

Ультрафиолетовые лучи, используемые в течение многих лет для стерилизации воды, обладают эффективным действием на широкий спектр микроорганизмов. Показано, что ультрафиолетовая обработка существенно снижает содержание E.coli в яблочном сидре. Облучение ультрафиолетом проводили при 254 нм с максимальной интенсивностью 107,366 мкВт/см2. Дозировка могла изменяться в зависимости от скорости прохождения потока сидра через дезинфицирующий ультрафиолетовый элемент. Такая обработка в большей степени, чем пастеризация, позволяет добиться снижения степени микробиологического загрязнения без ущерба для вкусовых характеристик продукта [5].

В настоящее время процесс пастеризации является основным способом уничтожения микроорганизмов в соках. Однако установить режим пастеризации для соков с высокой кислотностью и длительным

4•2004 1

.....И,1И"".......

сроком хранения очень трудно, так как условия инактивации спор бактерий A. acidoterrеstris в зависимости от вида продукта не изучены. Разработана новая методика определения критерия пастеризации (включая степень дезактивации микробов), основанная на снижении количества спор бактерий A. acidoterrеstris на примере экзотического фрукта купачи. Для сока из купачи были определены следующие кинетические параметры пастеризации: время инактивации микроорганизмов при 91 °С (D91 °С) составило 4,47±1,12 мин; температурный множитель ^ — значение °С, необходимое для уменьшения D на 10) — 8,88±1,45 °С. Предложенная методика может быть успешно применена и к другим фруктовым сокам [6].

В процессе ультраконцентрирования бактерии A. acidoterrestris проникают через микро- и ультрафильтрационные мембраны и могут попасть на стерильную сторону фильтра установки. В связи с этим для отделения возбудителя порчи A. aci-doterrestris было предложено использовать дополнительную фильтрацию через слои глубокого фильтра, позволяющую даже при высокой степени загрязнения яблочного или концентрированного яблочного соков добиться качественного отделения A. acidoterrestris [7].

При фильтрации применяли два типа стерильных фильтров: Весо-Б1еп1 Б 80 и Весо-Б1еп1 Б 100, обладающих 100%-ной задерживающей способностью. Благодаря циклическому обновлению слоев/модулей фильтра в процессе фильтрации гарантировано отсутствие A. acidoterrestris в исходном продукте. По сравнению с ультравысоким нагреванием (1-2 мин, 120...130 °С) стерильная фильтрация слоями и модулями глубокого фильтра обеспечивает щадящий режим при получении готового продукта и, кроме того, в процессе фильтрации удается отделить не только бактерии, но и неустойчивые к нагреву ингредиенты (осадок, возникающий после применения амилаз) [7].

Миллер и сотруд. изучали условия роста A. acidoterrestris в яблочном, виноградном и апельсиновых соках в присутствии кислорода. Была установлена взаимосвязь между содержанием кислорода и ростом микроорганизмов. Добавление Ь-аскорбиновой кислоты в качестве анти-оксиданта также положительно повлияло на снижение порчи фруктового сока бактериями [8].

Представляет интерес работа, доказывающая связь между содержанием полифенолов и ростом A.acidoterrestris в яблочном, виноградном и апельсиновом соках, а также в соке красного мангольда [9]. Установлено, что степень влияния полифенолов, содержащихся в соке, на рост A. acidoterrestris в значительной степени зависит от способа производства сока. В со-

Меры контроля Условия

Температура хранения < 20 °С

Уксусная кислота 0,7 г/л

Аскорбиновая кислота > 15 мг/100 мл яблочного сока

Бензойная кислота 61 мг/л, 150 мг/л

Сорбиновая кислота 300 мг/л

Низин 100 ед/мл для большинства соков, > 600 ед/мл для осветленного яблочного сока

Кислород < 0,1 % для большинства соков,

анаэробные условия для апельсинового сока

Карбонизация — насыщение С02 Эффективна

Дезинфицирующие средства 40 °С более эффективно по сравнению с 20 °С, для мойки фруктов используют ПАВ

ках прямого отжима первоначально высокое содержание полифенолов в процессе производства заметно снижается в результате окисления под действием полифено-локсидаз, влияния кислорода и нагревания при пастеризации, что подтверждается анализом полифенолов с помощью ВЭЖХ [9].

Во фруктовых соках с высоким содержанием полифенолов, таких, как соки из ягод с красным окрашиванием кожицы и мякоти, неосветленных соках и соках прямого отжима было обнаружено торможение роста A.acidoterrestris. В восстановленных же соках почти во всех образцах был отмечен хороший рост A.acidoterrestris. Исключение составил апельсиновый сок: как в соке прямого отжима, так и в восстановленном соке не отмечено существенного торможения роста A.acidoterrestris.

Впервые было исследовано влияние определенных фракций фенольных соединений на рост A.acidoterrestris. Так, для хлорогеновой кислоты лишь после нескольких дней было установлено замедление роста бактерий, а для феруловой кислоты характерно было однозначное замедление роста A.acidoterrestris. Добавление эпикатехина во всех опытах не оказывало заметного влияния на рост микроорганизмов.

Отсюда следует, что при производстве фруктовых соков необходимо стремиться к сохранению ценных фенольных веществ благодаря использованию по возможности более щадящих условий производства. Даже при получении неосветленного яблочного сока теряется огромное количество фенолов, например до 90 % флорид-цина. Применяя оптимальные процессы, можно поставлять на рынок яблочный сок с более высоким содержанием полифенолов. Благодаря быстрой переработке и немедленному кратковременному нагреванию до 80...85 °С в течение 20 с можно быстро и полностью инактивировать полифе-нолоксидазы сырых плодов.

Добавление Ь-аскорбиновой кислоты способствует стабилизации полифенолов. Наряду с технологическими вспомогательными средствами для достижения более высокого содержания полифенолов открываются широкие возможности, заключающиеся в селекции новых сортов и раз-

работке методов их выращивания. Так, например, общее содержание фенолов в яблоках сорта ВоЬпар!е1 (1623 мг/л) приблизительно в 5 раз выше, чем в столовых яблоках сорта Joпago1d [9].

Австралийская группа ученых исследовала различные пути, предупреждающие развитие A. acidoterrestris в соках, включая использование органических кислот, химических консервантов, дезинфицирующих средств, уменьшение концентрации кислорода и т. д. (см. таблицу) [10].

Таким образом, предотвратить порчу фруктовых соков и напитков на их основе бактериями рода AlicyclobacШus возможно, однако для этого необходимо соблюдать целый ряд вышеперечисленных технологических приемов.

В настоящее время практической рекомендацией по предотвращению загрязнения соков бактериями AlicyclobacШus служит опыт австралийских промышленных компаний и научных организаций, представленных на Конгрессе Международной федерации производителей фруктовых соков (№и, г. Сидней, 13-17 ноября 2001 г.) [11]. Рекомендованы следующие производственные меры.

Для производителей концентрированных соков: проведение тщательной инспекции плодов перед отжимом сока, которая уменьшает первоначальное загрязнение спорами; дезинфекционная обработка поверхности плодов смесью, состоящей из 20 % пероксида водорода и 5 % уксусной кислоты (общая концентрация смеси — 0,25 %, обработка в течение 30-60 с); эффективная мойка плодов предварительно очищенной водой; предотвращение выдержки непастеризованной мезги и(или) сока при температурах, превышающих 22 °С; использование при ультраконцентрировании сока мембран, размер пор которых позволяет удалить бактерии и их споры; внедрение в производственную практику текущего микробиологического контроля данной группы микроорганизмов.

Для предприятий по розливу соков: внедрение в производственную практику периодического и(или) постоянного контроля сырья; увеличение температуры пастеризации до 98 °С с выдержкой 20 с; охлаждение сока после пастеризации до тем-

.....ипи"".......

'4•2004

пературы не выше 22 °С; проведение периодической дезинфекции оборудования, трубопроводов, арматуры вышеприведенной смесью кислот; хранение готовой продукции в герметичной упаковке при температуре не выше 28 °С; текущий контроль природного уровня L-аскорбиновой кислоты в соке, которая оказывает инги-бирующее действие на развитие бактерий в готовом продукте.

Сегодня проблема порчи фруктовых соков за счет развития бактерий рода Alicyclobacillus актуальна и для производителей соков в Российской Федерации, так как предприятия в достаточно большом количестве применяют импортное сырье, производимое в странах с теплым климатом.

В заключение важно отметить, что присутствие ацидотермофильных бактерий рода Alicyclobacillus в готовом продукте крайне нежелательно, поскольку появление неприятного запаха, мути и белого осадка на дне упаковки грозит не только потерей доверия покупателей к выпускаемой продукции, но и значительными убытками для производителей.

ЛИТЕРАТУРА

1. Dr. Silvia Y. Eguchi et al. Acidothermophilic Sporeforming Bacteria (ATSB) in Orange Juices: Detection Methods, Ecology, and Involvement in Deterioration of Fruit juices//Report of the Research Project, ABECitrus, Campinas (SP). — Brazil, March, 1999.

2. Pacheco C.P. Sensibility and Specificity of Methods for Alicyclobacillus Detection and Quantification //Fruit processing. 2002. 11. Р. 478-482.

3. Motohiro Niwa, Atsuko Rawamoto. Development of rapid Detection method of A. acidoterrestris, hazardous bacteria to acidic bevrage//Fruit processing. 2003. March/april. Р. 102-106.

4. Dr. J. Baumgart, S. Menje. The Impact of Alicyclobacillus acidoterresris on the Quality of Juices and Soft Drinks//Fruit processing. 2000. 7. Р. 251-254.

5. J. Acar. Microbiological Safety of Fresh-Squeezed Juices//Fruit processing. 2001. 10. Р. 410-413.

6. F.V.M. Silva, P. Gibbs, C.L.M. Silva. Establishing a New Pasteurisation Criterion Based on Alicyclobacillus acidoterrestris Spores for Shelf-stable High-acidic Fruit Products//Fruit processing. 2000. 4. Р. 138-142.

7. Carsten Nissen, Rainer Junker. Alicyclobacillus acidoterrestris: Safe Removal Through the Application of Depth Filter Modules//Fruit processing. 2001. 8. Р. 299-302.

8. Sabine Miller, W. Hennlich u.a. Alicyclobacillus acidoterrestris: Ein thermophiler Fruchtsaft-verderber-Untersuchungen zum Wachstumsverhalten in Fruchtsaften in Abhangigkeit vom Sauerstoff//Flussiges Obst. 2001.1. Р. 14-19.

9. Heike Wieland, Werner Hennlich u.a. Einflusse von phenolischen Inhaltsstoffen von Fruchtsaften auf das Wachstum von Alicyclobacillus acidoterrstris //Flussiges Obst. 2002. 11. Р. 698-702.

10. Catherine J. et al. Spoilage of Processed Foods: Causes and Diagnosis//AIFST Inc. (NSW Branch) Food Microbiology Group. 2001. Р. 287-292.

11. David Goldberg. Experiences with Alicyc-lobacillus (ACB)//Report of the Research Project. National Technical Services Manager, Berri Limited, Australia/New Zealand. November. 2001.

Международная ярмарка пищевой промышленности

ро1а§га-йюс12004

Познань, 21-24 сентября 2004 г.

Самое большое предложение пищевой промышленности в средне-восточной Европе

- Продукты и технологии пищевой промышленности

- Машины и оборудование для гастрономии, пищевой перерабатывающей промышленности и холодильной техники

Показ новостей

Рекордное количество экспонентов!

Кроме того приглашаем на:

- конференции и семинары посвященные маркетингу и техником продажи, а также самым актуальным проблемам пищевой отрасли и торговли.

- „идеальный магазин" новости из области оснащения и аранжировки магазинов

- встречи представителей торговли с производителями

www.polagra-food.pl

В то же самое время состоится Международный

салон техники упаковки и логистики ТАПОРАК До свидания в Познани!

%

Приезжай! Билет получишь 6<

латно!

Информация на руском языке:

Агентство розвития и маркетинга та розвитку АМД,

Львов, Украина

тел./факс + 380 322/44 11 91

e-mail: [email protected], www.amd-ukr.com.ua

Львовская торгово-промышленная палата, Львов, Украина

тел. +380 322/950 195 тел./факс +380 322/950 159

e-mail: [email protected], [email protected], www.tpp.lviv.net Агентство по продвижению Александр Барановський, Киев, Украина

тел./факс +380 44/495 10 17

e-mail: [email protected]; www.baranovski.kiev.ua

^iiiv Организатор:

Международная Познанская Ярмарка о.о.о.

ПОЛЬША, 60-734 Познань, ул. Глоговска 14 тел.: +48 61/869 26 38, 869 25 93, 869 25 89 факс:+48 61/869 29 55

e-mail: [email protected], www.polagra-food.pl

4•2004 1

............