CC BY
21628.473.63: 616.992.282
ВВЕДЕНИЕ
ХРОНОБИОАОГИЧЕСКИИ МЕТОД ИЗУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ CANDIDA SPECIES
Николенко М.В. (доцент кафедры)*
Кафедра микробиологии ГБОУ ВПО Тюменской государственной медицинской академии Минздравсоцразвития России
© Николенко М.В., 2011
Изучали биологические свойства (пролиферативную, фос-фолипазную, протеазную и каталазную активности) музейных штаммов и клинических изолятов С. albicans, С. krusei в течение суток. Протестировали 18 культур С. albicans и 15 изолятов С. krusei, выделенных из кишечника пациентов при транзитор-ном носительстве. В проведенном исследовании выявили суточную динамику биологической активности всех изучаемых культур Candida spp. Установили время максимального проявления физиологической активности музейных штаммов: у С. albicans - в утреннее и дневное время, у С. krusei - в вечерне-ночное время. У всех культур грибов, выделенных из организма человека, показатели пролиферативной и ферментативной активности культур имеют сходные амплитудно-фазовые характеристики. В ходе исследования обнаружили, что временная самоорганизация грибной клетки обусловлена не только проявлением генетически детерминированных ритмов жизнедеятельности культуры, но и влиянием внешних "управляющих" параметров.
Ключевые слова; временная организация, Candida species, пролиферативная и ферментативная активности
CHRONOBIOLOGICAL METHOD OF BIOLOGICAL PROPERTIES STUDY OF CANDIDA SPECIES
Nikolenko M.B. (associate professor of the chair)
Chair of microbiology of Tyumen State Medical Academy, Russia
© Nikolenko M.B., 2011
Proliferation, phospholipase, protease properties and catalase activity of C. albicans museum's strains and clinically isolated C. krusei have been studied during 24 hours. 18 cultures of C. albicans and IS isolates of C. krusei which were taken from the patient's intestine (transitional carrier) were tested. There was a daily biological dynamic in all the studied cultures of Candida spp. which was revealed in this research. The time of maximal physiological activity of museum's strains was found: C. albicans - in the morning and during daytime hours, C. krusei - in the evening and during night-time. Indexes of proliferative and fermentative activity of all the isolates in both species which were isolated from human organism have similar phase descriptions. This research showed that temporary self - organization of a fungus cell is not caused only by genetically determined rhythms of vital activity but also by influence of external controlling parameters.
Key words: Candida species, proliferative and fermentative activity, time organization
Контактное лицо: Николенко Марина Викторовна, тел.: 89058233790
Candida spp. - открытая система, поддерживающая свое существование за счет постоянного обмена веществом и энергией с внешней средой [1]. Перспективное направление изучения биологической организации подобного типа - исследование динамики протекающих в них процессов. Среди многочисленных актов, происходящих в живых системах, центральное место принадлежит биологическим ритмам [2], которые первыми реагируют на влияние любого фактора внешней среды [3,4].
Биоритмы различных функций хорошо изучены у растений, животных и человека. Единичные работы по исследованию динамики активности роста плесневых грибов и водорослей (А.Е. Иванова, 1999) [5-7] не дают представления о временной организации биологической активности Candida spp.
Для изучения ритмических колебаний различных функций дрожжевых грибов в качестве модели были выбраны Candida albicans и Candida krusei, которые являются уникальными микроорганизмами, колонизирующими и поражающими многие органы и ткани, проявляя при этом широкий диапазон адаптационных возможностей [8]. Успехи в изучении биологии грибов помогли относительно полно охарактеризовать факторы адгезии и инвазии С. albicans [9-11], однако остаются дискутабельными вопросы о патогенном потенциале и реализации вирулентных свойств у нe-albicans видов Candida.
На наш взгляд, с помощью хронобиологического метода можно по-новому подойти к оценке биологических свойств Candida spp. и открыть новые возможности в понимании фундаментальных проблем адаптации.
Цель работы - изучить временную организацию биологических свойств Candida species.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследовали 18 клинических изолятов С. albicans и 15 - С. krusei, выделенных из кишечника в 102 степени высеваемости. Контролем служили депонированные эталонные штаммы С. albicans 24433 АТСС и С. krusei 6258 АТСС. Видовую идентификацию грибов проводили по комплексу признаков: внешнему виду колоний, хламидоспорообразованию, тесту на образование ростовых трубок, определению чувствительности дрожжевых организмов к антифун-гальным препаратам методом дисков, ассимиляционной способности штамма [8]. Все микроорганизмы выращивали на бульоне Сабуро. Для данной работы использовали 24-часовую культуру, которая соответствовала начальному этапу фазы стационарного роста и покоя. Исследования проводили пять лет, в зимнее время года - в течение суток с 4-х часовым интервалом. Каждая временная точка включала 5 проб. Биоритмы пролиферативной активности грибов изучали по методике, разработанной сотрудниками кафедры микробиологии ГБОУ ВПО ТюмГМА
■
[12]. Для получения исходной концентрации грибов (1,0 единица по Мак Фарланду), микробную взвесь стандартизировали на приборе «Densi - La - Meter» фирмы «Lachema» и доводили до рабочей концентрации. Посев делали по методу Дригальского и инкубировали при 37 °С в течение суток, затем подсчитывали количество колониеобразующих единиц на 1 мл (КОЕ/мл). Суточную активность фосфолипа-зы А2 определяли титрометрическим способом [13] в модификации Суплотова С.Н, Журавлевой Т.Д., 2009 г., в млмоль/л. час [14]. Протеазную активность оценивали по убыли альбумина после инкубации с исследуемыми штаммами биуретовым методом, в мг/мин-мл [15]. Биоритмы активности каталазы определяли фотометрическим методом по убыли пе-роксида водорода, в мкмоль/мин [16].
Для изучения влияния бактерий - ассоциантов на биологические свойства Candida spp. в работе использовали стерильные экстракты Staphylococcus aureus (S. aureus) 25923 ATCC, Escherichia coli (E. coli) 35218 ATCC, Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) 27853 ATCC [17].
Статистическую обработку материалов и графическое изображение результатов осуществляли с использованием программ Primer of Biostatics Version 4.03 by Stanton A. Glantz 1998 и Microsoft Office Excel 2003. В случае соответствия сравниваемых выборок нормальному закону распределения (по у2) использовали t - критерий Стьюдента. При определении регулирующего влияния экзометаболитов микросимбионтов, а также сравнении музейных и клинических изолятов грибов достоверность различия сравниваемых выборок определяли непараметрическим методом статистической обработки: критерий Уилкоксона (W) применяли для связанных выборок, критерий Манна-Уитни (Т) - для несвязанных выборок. Анализируемые различия считали достовер-
Таблица
Ритмометрические показатели биологической активности клинических изолятов и музейных штаммов Candida species
№ штамма Кол-во Вклад ритма, (%) Вклад ритма, (%) Акрофаза (час) Амплитуда Мезор (М±т)
культур 24-х час 12-х час
пролиферативная активность К0Е/мл КОЕ/мл
С. albicans 24433 ATCC 1 38,2 60,7* 09.50 39,4 ±4,68 114,2±4,71
С. krusei 6258 ATCC 1 62,4* 37,6 16.20 107,5 ±5,67 105,7±5,62
С. albicans 18 61,3* 38,2 24.00* 141,2 ±13,53* 157,1±9,90*
С. krusei 15 52,8 46,4 20.00 238,3 ±24,50* 234,5±12,60*
фосфолипазная активность млмоль/л. час млмоль/л. час
С. albicans 24433 ATCC 1 74,2* 25,8 07.80 7,2±0,14 8,7±0,03
С. krusei 6258 ATCC 1 42,5 57,5 24.00* 11,7±2,1* 7,4 ±0,39
С. albicans 18 81,1* 19,1 07.60 8,2±0,59 8,6 ±0,23
С. krusei 15 80,0* 18,5 04.00 5,6 ±1,32* 6,3 ±0,90
протеазная активность мг/мин-мл мг/мин-мл
С. albicans 24433 ATCC 1 73,4* 20,0 04.00 0,05±0,01 0,15±0,02
С. krusei 6258 ATCC 1 44,8 49,0 24.00* 0,05±0,01 0,12±0,03
С. albicans 18 60,3* 38,4 07.46 0,09±0,01 0,12±0,01
С. krusei 15 64,1* 32,0 04.00 0,11 ±0,01* 0,11 ±0,02
каталазная активность мкмоль/мин мкмоль/мин
С. albicans 24433 ATCC 1 61,5* 30,8 04.15 0,33±0,03 0,47±0,08
С. krusei 6258 ATCC 1 41,8 47,0 20.00* 0,12±0,04 0,28±0,09
С. albicans 18 68,8* 25,0 06.45 0,12+0,01* 0,23 ±0,03*
С. krusei 15 60,0* 38,5 04.56 0,06±0,02* 0,22±0,01
Примечание: * р < 0,05 - достоверность вкладов ритмов
ными при р<0,05. Для установления связи между параметрами использовали корреляционный анализ по Спирмену (метод ранговой корреляции), относящийся к категории непараметрических, что позволило отказаться от предварительной оценки нормальности распределения сравниваемых признаков [18].
При хронодизайне исследований предусмотрено получение по каждой оцениваемой функции 6-ти измерений в сутки с 3-5-кратным повторением условий эксперимента. Данные были обработаны по методу наименьших квадратов (косинор-анализ) при заданной значимости достоверности р<0,05 [19]. Для каждого штамма впоследствии определяли основные параметры ритмов с периодами Т=12 часов и Т=24 часа: мезор - среднее значение изучаемого параметра, амплитуда ритма - наибольшее отклонение показателя от мезора и акрофаза - момент времени, когда отмечали максимальное значение исследуемого параметра.
Для анализа хронограмм применяли метод группового косинор-анализа, реализованного в виде прикладной программы «Cosinor Ellipse 2006».
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
При оценке временных параметров у музейных штаммов и клинических изолятов установили достоверные биологические ритмы всех изучаемых показателей (р < 0,05). У эталонного штамма С. albicans выявили ультрадианные (около 12-часовые) ритмы пролиферативной активности со стабильными положениями акрофаз в дневное время. Временные ряды каталазной, протеазной и фосфолипазной активностей характеризовались, напротив, статистически значимой циркадианной (окосуточной) ритмичностью. Данные представлены в таблице в виде средних значений с доверительным интервалом (р < 0,05) с учетом критерия Стьюдента.
При сопоставлении основных ритмометрических параметров различных уровней интеграции выявили «амплитудно-фазовую стабильность» биологических свойств микроорганизма. Штамм С. albicans проявлял максимальную ферментативную активность в ранние утренние часы - 04.00-08.00. В этот временной период грибы активно секретировали ферменты каталазу, протеазу и фосфолипазу. Активность изучаемых факторов патогенности сменялась фазой максимального логарифмического роста микроорганизма. Результаты представлены на рисунке 1.
Рис. 1. Амплитудно-фазовая характеристика биологических свойств С. albicans 24433 АТСС; Т= 24 часа. 1 - пролифе-ративная активность; 2 - фосфолипазная активность;
3 - каталазная активность; 4 - активность протеазы; по окружности - время суток
Местоположения доверительных эллипсов (контуры которых отграничивают область двухмерного пространства - амплитуд и фаз) отражают максимальную временную область проявления биоритмов по результатам популяционного косинор-анализа. Небольшая площадь эллипсов каталазной и фосфо-липазной активности отражает значительное постоянство основных параметров биоритмов. При корреляционном анализе обнаружили у музейного штамма прямую зависимость между пролифератив-ной активностью, с одной стороны, и ферментами патогенности, с другой (г= +0,67, р< 0,05).
Динамика биологических свойств музейного штамма С. krusei характеризовалась иным типом ритмичности. У данной культуры наблюдали цир-кадианный ритм КОЕ/мл, а в спектральном составе ритмов активности ферментов - усиление 12-ти часовых гармоник (табл.). При хронобиологическом методе выявили у С. krusei наличие ферментов патогенности, максимальные значения которых фиксировали в вечерний и ночной период. Значения про-лиферативной и протеазной активностей (г = +0,82; р>0,05), а также каталазной и фосфолипазной активностей (г = +0,68; р>0,05), были синхронизированы между собой во времени (Рис.2).
Рис. 2. Амплитудно-фазовая характеристика биологических свойств С. krusei 6258 АТСС; Т= 24 часа; 1 - пролифера-тивная активность; 2 - фосфолипазная активность; 3 - каталазная активность; 4 - активность протеазы; по окружности - время суток
При оценке временной организации С. krusei 6258 АТСС обнаружили, что реализация биологического потенциала начиналась с активной пролиферации, затем грибы секретировали ферменты агрессии -протеазу, каталазу и фосфолипазу. Для эталонного штамма С. krusei также отмечали значительные временные интервалы (с 01.00 до 16.00) отсутствия биологической активности.
В результате нескольких серий исследований при одинаковых условиях проведения экспериментов были получены идентичные результаты. Этот факт послужил основой для предположения о том, что хроноинфраструктура изученных временных рядов биологической активности является видовым, генетически детерминированным, признаком музейных штаммов Candida species.
Амплитудно-фазовая характеристика биологической активности культур С. albicans, выделенных из кишечника человека, отличалась от такового у музейного варианта. Ферменты агрессии сохранили дневной тип суточной активности, акрофазы регистрировали в 04.00-08.00 часов (р<0,05). Одновременно наблюдали изменение ритмометрических параметров КОЕ/мл (табл.). У всех изучаемых изоля-тов при степени высеваемости 102 КОЕ/мл выявили циркадианные ритмы с характерным профилем, смещением акрофазы на ночное время 23.00-24.00 часов, достоверным повышением мезора и амплитуды колебаний (табл.). Высокие значения мезора и амплитуды колебаний служат показателем стабильности проявления данного фактора, а смещение акрофазы - об адаптации к условиям существования [3]. Хронограмма представлена на рисунке 3.
1 - пролиферативная активность; 2 - фосфолипазная активность; 3 - каталазная активность; 4 - активность протеазы; по окружности - время суток
Периоды физиологической активности начинались с размножения гриба, возрастания популяции, затем микроорганизмы выделяли ферменты защиты и агрессии. Стадия активности сменялась фазой покоя.
На следующем этапе исследований была сделана попытка объяснить изменение временного диапазона биологической активности культур, выделенных из кишечника человека. На микроорганизмы постоянно воздействуют внешние факторы: абиотические - ритм солнечной освещенности (чередование дня и ночи), колебания температуры и т. д. и биологические - ритмы организма человека и/или экзогенные продукты метаболизма микробов-ассоциантов. На музейный штамм С. albicans с генетически запрограммированными «биологическими часами» длительно воздействовали температурой 37 °С. Посевы инкубировали в термостате в течение шести суток. Результат оценивали каждые 24 часа. Через 48 часов инкубации при заданной температуре наблюдали смещение акрофазы КОЕ/мл с 12.00 на 16.00 часов. На 5-6 сутки непрерывного воздействия температурой ритмометрические параметры (профиль ритма, мезор, акрофаза) пролиферативной активности музейного штамма соответствовали таковым клинических изолятов (Т 37, р<0,05).
Candida spp. как условно-патогенные микроорганизмы самостоятельно не способны вызывать болезнь, их агрессивные свойства усиливаются в ассоциациях с бактериями [10, 21]. Их чаще высевают с грамположительными кокками и грамотрицатель-ными палочками. В следующей серии экспериментов были смоделированы условия патобиоценозов. На музейный штамм С. albicans воздействовали метаболитами музейных штаммов S. aureus, Е. coli, Р. aeruginosa и оценивали характер изменений ритмов по предложенным методикам. Вьмвили, что метаболиты бактерий достоверных изменений суточной динамики изучаемых показателей у С. albicans не вызывали (W=10, р>0,05). Следовательно, биоритмы изуча-
емых свойств достаточно стабильны во времени, по возможности независимы от многочисленных воздействий за счет своей внутренней синхронизации.
В хроноинфраструктуре клинических изолятов С. кгшег выявили существенные отличия по сравнению с музейным штаммом (табл.). В спектральном составе биоритмов всех показателей преобладал циркадианный вклад ритма (р<0,05). Среднесуточные значения и амплитуда колебаний пролиферативной и протеазной активности достоверно возрастали в 2 раза, а амплитуда активности фосфолипазы и каталазы снижалась в 2 раза. Из этого следует, что в одной и той же клетке адаптивная интенсивность синтеза одних ферментов обязательно сопровождается ингибированием продукции других [2]. Изменился тип ритмичности всех изучаемых параметров у культур С. кпкел. Акрофазы околосуточных ритмов ферментативной активности регистрировали в ранние утренние часы, время максимального проявления пролиферативной активности сместилось с 16.00 на 22.00 часа (Рис. 4).
Рис. 4. Амплитудно-фазовая характеристика биологических свойств клинических изолятов С. krusei; Т= 24 часа. 1 - пролиферативная активность; 2 - фосфолипазная активность; 3 - каталазная активность; 4 - активность протеазы; по окружности - время суток
При воздействии на С. krusei 6258 АТСС температуры 37 °С через 72 часа выявили изменения рит-мометрических характеристик пролиферативной активности: профиля ритма, акрофазы, мезора и амплитуды (Т=38, р<0,05). Эти параметры соответствовали данным, полученным с клиническими изо-лятами. На временные ряды активности ферментов температура не оказывала влияния. Изменение типа ритмичности патогенных свойств С. krusei вызывали метаболиты грамнегативной микробиоты. Метаболиты Р. aeruginosa изменяли время проявления максимальных значений протеазы (W= 46, р<0,05), а метаболиты Е. coli смещали акрофазу каталазной и фосфолипазной активностей с ночного времени на ранние утренние часы (W=52, р<0,05; W 19, р>0,05 соответственно). Таким образом, культуры С. krusei более подвержены влиянию различных биотических и абиотических факторов. Высокая лабильность
б
биоритмов изучаемых свойств дает возможность постоянно подстраиваться к новой среде обитания, сохраняя численность популяции и патогенный потенциал.
В результате проведенной работы выявили три основных момента. Во-первых, сходство фазовых характеристик всех изучаемых клинических изоля-тов Candida spp., во-вторых, обратную корреляцию между пролиферативной активностью и патогенными свойствами культур, выделенных из организма человека (у С. albicans г = -0,58; р<0,05; у С. krusei -г = -0,72; р<0,05). Установили, что в период минимальной пролиферативной активности грибов обоих видов продукция ферментов (фосфолипазы, про-
теазы, каталазы) была максимально выражена, что может способствовать выживанию патогенов в организме хозяина. В-третьих, температура является регулятором ритмичности пролиферативной активности изученных культур.
Таким образом, тест-микромицеты имеют возможность изменять частоту своих физиологических ритмов, обеспечивать быструю адаптацию к различным условиям жизнедеятельности и сохранять го-меостаз [21]. Выявленное существование динамики биологических свойств представителей Candida species открывает перспективы для фундаментальных и прикладных исследований в данном направлении.
ЛИТЕРАТУРА
1. Шевяков М.А. Авалуева Е.Б., Барышникова Н.В. Грибы рода Candida в кишечнике: клинические аспекты (обзор) // Проблемы медицинской микологии. - 2007. - Т.9, №4. - С. 4-11.
2. Комаров Ф.И., Рапопорт С.И. Хронобиология и хрономедицина. - М.: «Триада-X», 2000. - 400 с.
3. Хетагурова Л.Г. Патофизиология десинхронозов //Владикавказский медико-биологический вестник. - 2005. - Т. 5, Вып. 9. - С. 32-40.
4. Валиева М.В., Хетагурова Л.Г., Хуберцова Н.О., Тагаева И.Р. Биологические ритмы физиологических функций у пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом //Владикавказский медико-биологический вестник. -2006-2007. - Т. 6. Вып. 11-12. - С. 16-20.
5. Быстрова Е.Ю. Исследование пространственно-временной самоорганизации в колониях грибов из класса Ну-phomicetes: Автореф. дисс... канд. биол. наук. - СПб., 2007. - 17 с.
6. Калита Т.Л. Инфрадианные ритмы роста, деления клеток и репродукции у морских водорослей: Автореф. дисс... канд. биол. наук, Владивосток, 2007. - 37 с.
7. Блажеевская, Ю.В., Вембер В.В., Жданова H.H. Сравнительный анализ скорости радиального роста микромицетов, выделенных из различных экотопов //Микробиол. журнал. - 2002. - Т. 64, № 3. - С. 3-11.
8. Блинов Н.П., Васильева Н.В., Степанова A.A., Чилина Г.А. Candida. Кандидозы. Лабораторная диагностика /Под редакцией проф. Н.П. Блинова - СПб.: Коста, 2010. - 224 с.
9. Зеленова Е.Г. Заславская М.И., Махрова Т.В. Кандиды: экология, морфофункциональные особенности и факторы патогенности //Нижегородский медицинский журнал. - 2002. - № 1. - С. 73-83.
10. Аисовская С.А. Новый подход к оценке патогенного потенциала клинических штаммов Candida albicans: Автореф. дисс...канд. мед. наук. - Казань, 2008. - 25 с.
11. Алешукина A.B. Колонизирующая способность Candida spp. при дисбиозах кишечника //Проблемы медицинской микологии. - 2009. - Т.11, №1.- С. 25-29.
12. Патент на изобретение № 2285258 «Способ диагностики госпитальных штаммов» // Кашуба Э.А., Тимохина Т.Х., Курлович H.A., Паромова Я.И., Варницына В.В., Хохлявина P.M., Губин Д.Г., Козлов Л.Б. - 2006 г. - 11 с.
13. Тужилин СЛ., Салуэнья А.И. Метод определения активности фосфолипазы А2 в сыворотке крови //Лабораторное дело. - 1975. - № 6. - С. 334-336.
14. Суплотов С.Н., Журавлева Т.Д. Адаптация человека к авиаполетам. Липопероксидация в эритроцитах и ее регуляция. Методы лабораторной диагностики. - Тюмень: ООО «Печатник», 2009. - 104 с.
15. Практикум по микробиологии /Под ред. А.И. Нетрусова. - М.: Издательский центр «Академия», 2005. - 608 с.
16. Патент РФ № 2180353 «Способ выявления у бактерий ингибиторов каталазы микроорганизмов» //Бухарин О.В., Сгибнев A.B., Черкасов С.В., Иванов Ю.Б. - 2002 г.
17. Перунова Н.Б. Характеристика биологических свойств микроорганизмов в бактериально-грибковых ассоциациях кишечника: Автореф дисс... канд. мед. наук, Оренбург, 2003. - 25 с.
18. Гланц С. Медико-биологическая статистика. Пер. с англ. - М.: Практика, 1999. - 459 с.
19. Nelson W„ Tong Y.L., Lee.K., etal. Methods for cosinorrhymometry // Chronobiologia. - 1979. - Vol.6, № 4. - P. 305-323.
20. Хмельницкий O.K. О кандидозе слизистых оболочек //Архив патологии. - 2000. - Т.62. - С. 3-10.
21. Смирнов С.Н., Захаров В.Б., Мамонтов С.Г. Становление суточного ритма пролиферации клеток в раннем постна-тальном онтогенезе крыс //М-лы Первого Российского съезда по хронобиологии и хрономедицине. - Владикавказ: ИПО СОИГСИ, 2008. - С. 86-87.
Поступила в редакцию журнала 25.10.2011
Рецензент: М.А. Шевяков
