CC BY
60
Вопросы общей патологии
БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ГРИБОВ CANDIDA ALBICANS,
ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ВАГИНАЛЬНОГО БИОТОПА, ПО ДАННЫМ ХРОНОБИОЛОГИЧЕСКОГО МЕТОДА
М. В. Николенко*, кандидат биологических наук,
Т. X. Тимохина, доктор биологических наук,
В. В. Варницына, кандидат биологических наук
ГБОУ ВПО «Тюменская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России,
625000, Россия, г. Тюмень, ул. Одесская, д. 54
РЕЗЮМЕ Биологическую активность (пролиферативную, фосфолипазную, каталазную, протеиназную) культур С. albicans, выделенных из вагинального биотопа здоровых женщин и больных «кандидозным вульвовагинитом», изучали в течение суток. Результаты оценивали по ритмометрическим параметрам: мезору, амплитуде, акрофазе и периоду ритма. Биоритмы количества КОЕ определяли по разработанной авторами методике (патент на изобретение № 2285258, 2006). Полученные данные свидетельствуют о различиях в суточной физиологической активности микробных культур и отражают степень их патогенности. Предложенный хронобиологический метод, характеризующийся высокой специфичностью и чувствительностью, позволяет дифференцировать носительство и кандидоз на основании сравнения вкладов циркадианного (24-часового) и ультрадианного (12-часового) ритмов и амплитуды.
Ключевые слова: кандидозный вульвовагинит, биоритм, грибы Candida albicans.
* Ответственный за переписку (corresponding author): nikolenko-marina@mail.ru
К числу важнейших медико-социальных проблем относится инфекционная патология репродуктивной системы женщины, в структуре которой грибковые поражения занимают весьма значительное место. Грибы рода Candida колонизируют слизистые оболочки у 15-40% практически здоровых людей, а в условиях длительной госпитализации на фоне какой-либо патологии высеваются у 80% женщин. Кандидозный вульвовагинит диагностируется в 10-30% всех случаев заболевания влагалища. Возбудителями вагинита в 42,8% случаев являются грибы Candida albicans (C. albicans) [2].
До последнего времени при определении этиологии инфекционных заболеваний наибольшее значение придавали численности обнаруженных условно-патогенных микроорганизмов в пораженном органе, а в случае микст-инфекции - установлению количественных соотношений между ассоцианта-ми [1]. На сегодняшний день при постановке диагноза более информативными признаны методы определения факторов вирулентности микроми-цетов [5, 7]. Изучение факторов агрессии дрожжевых грибов с позиций хронобиологии дает возможность охарактеризовать патогенность штамма, разграничить кандидоз и кандидоносительство.
CHRONOBIOLOGICAL METHOD OF INVESTIGATION OF BIOLOGICAL PROPERTIES OF CANDIDA ALBICANS FUNGI EXCRETED FROM VAGINAL BIOTOPE
Nikolenko M. V., Timokhina T. H., Varnitsyna V. V.
ABSTRACT Proliferative, phospholipase, catalase, proteinase biological activity of C.albicans cultures which were excreted from vaginal biotope of healthy women and patients with “candidiasis vulvovaginitis” was studied within 24 hours. The results were evaluated by rhythmometric parameters: mesor, amplitude, acrophase and rhythm period. The results obtained might testify to different daily periods of physiological activity of microbial cultures and reflect the degree of their pathogenicity. The suggested chronobiological method which was characterized by high specificity and sensibility allowed to differentiate the carriage and candidiasis by rhythm indices comparison (contributions: circadian - 24 hours and ultradian - 12 hours and amplitude).
Key words: candidiasis vulvovaginitis, biorhythm, Candida albicans fungi.
Цель исследования - оценить возможности хро-нобиологического метода изучения биологических свойств для лабораторной диагностики вагинальной кандидозной инфекции (C. albicans).
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Материалом для исследования служили 12 культур C. albicans, полученных из влагалищного отделяемого у пациенток гинекологического отделения многопрофильной клиники ГБОУ ВПО «Тюменская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России. Половина культур выделена от практически здоровых людей при обследовании микробиоценоза изучаемого биотопа и характеризовалась степенью высеваемости в 102-103 КОЕ/мл. Шесть вариантов C. albicans получены от больных с диагнозом «кандидозный вульвовагинит» и характеризовались степенью высеваемости в 106 КОЕ/мл. Они обладали типичными для своего вида морфологическими, культуральными и биохимическими свойствами.
Все тест-штаммы выращивали на среде Сабуро. В экспериментах использовали 24-часовую культуру, которая соответствовала начальному этапу стационарной фазы роста. Изучали способность к активному и быстрому росту и размножению, ферментативную активность, которые имеют огромное значение для жизнедеятельности микроорганизмов и характеризуют патогенность штамма [4, 6]. Биоритмы количества КОЕ определяли по разработанной авторами методике (патент на изобретение № 2285258, 2006) [8]. Исходную концентрацию микробной взвеси (0,3 ед. Мак-Фар-ланда, что соответствует 90 млн в 1 мл) получали при помощи прибора для определения мутности микробной суспензии «Densi-La-Meter» фирмы «Lachema» (Чехия). Методом серийных разведений готовили рабочую концентрацию грибов, соответствующую 3,0 тыс. КОЕ/мл, делали высев 0,1 мл этой концентрации на поверхность 5 чашек Петри среды Сабуро по методу Дригальского. Через сутки инкубации посевов при температуре 37°С подсчитывали число КОЕ/мл. Активность фосфолипазы А2 определяли традиционным титрометрическим способом в модификации С. Н. Суплотова с соавт. [10], активность проте-азы - биуретовым методом [9]. Исследования проводились в зимнее время года с учетом фазы Луны (IV фаза) с 4-часовым интервалом в течение суток.
Статистическую обработку результатов (включая графическое представление) осуществляли с использованием программ «Primer of Biostatics Version 4.03 by Stanton A. Glantz 1998», «Microsoft Office Excel 2003». В случае соответ-
ствия сравниваемых выборок нормальному закону распределения (по х2) использовали t-критерий Стьюдента. Сравнительная характеристика биологических свойств изолятов грибов, выделенных от здоровых и больных женщин, проводилась с применением критерия Манна - Уитни (Т) для несвязанных выборок. Различия считали достоверными при р < 0,05. Для установления связи между параметрами использовали корреляционный анализ по Спирмену (метод ранговой корреляции), относящийся к категории непараметрических, что позволило отказаться от предварительной оценки нормальности распределения сравниваемых признаков [3]. Дизайн исследования подразумевал выполнение 6 измерений в сутки по каждой оцениваемой функции с пятикратным повторением условий эксперимента. Данные были обработаны по методу наименьших квадратов (косинор-анализ) при заданной значимости достоверности p < 0,05 [11]. Для каждого штамма впоследствии определены основные параметры ритмов с периодами Т = 12 ч иТ = 2А ч: мезор - среднее значение изучаемого параметра, амплитуда ритма - наибольшее отклонение показателя от мезора и акрофаза - момент времени, когда отмечалось максимальное значение исследуемого параметра.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
У всех культур С. albicans экспериментально выявлена суточная динамика изучаемых показателей. Грибы, выделенные от здоровых женщин, характеризовались циркадианными (околосуточными) ритмами изучаемых свойств с одним пиком активности. Вклад циркадианного ритма составил 59,3-64,5% (р < 0,05). В ранние утренние часы зарегистрирована максимальная активность ферментов: фосфолипазы в 4:00 и протеазы в 8:00. В этот промежуток времени (4:00-8:00) способность C. albicans к адгезии и инвазии в слизистую оболочку влагалища в 11 раз выше, чем в остальные периоды суток. В 20:00 часов зафиксированы максимальные значения КОЕ (рис. 1).
Показатели суточной активности ферментов
C. albicans, выделенных от здоровых и больных женщин, имели достоверные различия. При нор-моценозе для грибов характерна стабильно более высокая активность фосфолипазы, чем при кандидозе (критерий Манна - Уитни Т = 34,0; р < 0,05). Среднесуточные показатели фосфолипазы регистрировались у разных культур в пределах от 9,4 і 0,5 до 11,5 і 0,7 ммоль/л/ч. Амплитуда колебаний уровня данного фермента составила в среднем 18,7 і 4,32 ммоль/л/ч. Активность протеазы C. albicans, наоборот, была снижена. Мезор был зафиксирован на уровне от 0,08 і 0,02 до
0,11 ± 0,03 мг/минмл, а амплитуда колебаний - в среднем 0,29 ± 0,03 мг/мин мл (табл. 1).
Сравнительный корреляционный анализ выявил при нормоценозе достоверную прямую зависимость между фосфолипазной и протеазной активностью (r = 0,62; р < 0,05) и четкую обратную корреляцию между пролиферацией и активностью ферментов патогенности. Критерий Спирмена составил корреляцию между числом КОЕ и активностью фосфолипазы (r = -0,53; р < 0,05); числом КОЕ и протеазной активностью (r = -0,44; р < 0,05).
При кандидозном вульвовагините выявлены достоверные ультрадианные (примерно 12-часовые) ритмы с двумя пиками биологической активности всех изучаемых свойств. Вклад ультрадианных гармоник составил 59,7-62,2% (р < 0,05). Максимальные значения фосфолипазы и протеазы регистрировали в дневное (11:00-12:00) и ночное (24:00) время. Акрофаза пролиферативной активности зафиксирована в 16:00 и 24:00 (рис. 2).
У C. albicans, выделенныхв количестве 106 КОЕ/мл, выявлена низкая фосфолипазная активность. Мезор составил у разных культур от 4,8 ± 0,4 до 6,0 ± 0,3 ммоль/л/ч, амплитуда колебаний - в среднем 3,3 ± 0,8 ммоль/л/ч. Активность протеазы микромицетов, наоборот, была достоверно выше, чем у грибов, выделенных от здоровых лиц (критерий Манна - Уитни Т = 23,0; р < 0,05). Мезор регистрировался в пределах от 0,19 ± 0,02 до 0,29 ± 0,09 мг/мин мл, а амплитуда колеба-
ний составила в среднем 0,61 ± 0,01 мг/мин мл (табл. 2).
Корреляционный анализ выявил согласованность всех изучаемых показателей во времени. У грибов, полученных от больных пациентов, выявлена прямая зависимость между числом КОЕ и активностью фосфолипазы (r = 0,15; р > 0,05); числом КОЕ и активностью протеазы (r = 0,27; р > 0,05); фосфолипазной и протеазной активностью (r = 0,40; р < 0,05). Данное явление, по всей видимости, можно рассматривать как перестройку физиологической активности, которая сопровождается выработкой адекватной реакции на изменение условий существования при инфекционных процессах [12].
ВЫВОДЫ
1. Полученные данные могут свидетельствовать о различных суточных периодах физиологической активности микробных культур и отражать степень их патогенности.
2. Определены особенности ритмов биологических свойств у культур C. albicans при нормоценозе (циркадианная динамика пролиферативной, протеазной, фосфолипазной активности) и ультрадианные ритмы этих характеристик у грибов при кандидозном вульвовагините.
3. Установлена согласованность биологических свойств грибов: обратная корреляция между пролиферативной и ферментативной активностью при носительстве и прямая корреляция при болезни.
Таблица 1. Ритмометрические показатели биологической активности культур С. albicans, выделенных от здоровых женщин
Показатель Вклад 24-часового ритма, % Вклад 12-часового ритма, % Мезор Амплитуда Акрофаза
Пролиферативная активность 59,3* 41,3 112,4 ± 9,4 КОЕ/мл 87,9 ± 3,4 КОЕ/мл 20:00
Протеиназная активность 64,2* 35,7 0,10 ± 0,02 мг/минмл 0,29 ± 0,03 мг/минмл 8:00
Фосфолипазная активность 64,50* 35,4 10,9 ± 0,7 ммоль/л/ч 18,7 ± 4,3 ммоль/л/ч 4:00
Примечание. Статистическая значимость различий: * - p < 0,05.
Таблица 2. Ритмометрические показатели биологической активности культур С. albicans, выделенных от больных женщин
Показатель Вклад 24-часового ритма, % Вклад 12-часового ритма, % Мезор Амплитуда Акрофаза
Пролиферативная активность 30,1 62,2* 101,8 ± 12,4 КОЕ/мл 60,4 ± 5,1 КОЕ/мл 16:00 24:00
Протеиназная активность 39,2 59,7* 0,24 ± 0,02 мг/минмл 0,61 ± 0,01 мг/минмл 12:00 24:00
Фосфолипазная активность 47,1 61,4* 5,8 ± 0,4 ммоль/л/ч 3,3 ± 0,8 ммоль/л/ч 11:07 24:00
Примечание. Статистическая значимость различий: * - p < 0,05.
Уровень, %
t, Ч
Рис. 1. Суточная динамика биологических свойств С. albicans, выделенных от здоровых женщин из вагинального биотопа:
-------пролиферативная активность;-----------фосфолипазная активность;-----------протеиназная активность
Уровень, %
t, Ч
Рис. 2. Суточная динамика биологических свойств С. albicans, выделенных от женщин с кандидозным вульвоваги-нитом:
-------пролиферативная активность;-----------фосфолипазная активность;--------------протеиназная активность
ЛИТЕРАТУРА
1. Бухарин О. В., Усвяцов Б. Я., Карташова О. Л. Биология патогенных кокков. - М. : Медицина ; Екатеринбург : УрО РАН, 2002.
2. Видовой состав возбудителей вагинального канди-доза у пациенток отделения оперативной гинекологии / А. Ф. Куперт [и др.] // Гинекология. - 2004. - Т. 6, № 4. - С. 184-187.
3. Гланц С. Медико-биологическая статистика / пер. с англ. - М. : Практика, 1999.
4. Зеленова Е. Г., Заславская М. И., Махрова Т. В. Кандиды: экология, морфофункциональные особенности и факторы патогенности // Нижегородский медицинский журн. - 2002. - № 1. - С. 73-83.
5. КарпунинаТ. И., Олина А. А., Машуров М. Г. Фосфоли-паза оппортунистических грибов: их возможная роль в патогенезе и диагностике микозов // Пробл. медицинской микологии. - 2006. - Т. 8, № 4. - С. 41-46.
6. Коротяев А. И., Бабичев С. А. Роль генетической и умственной систем информации в возникновении и развитии жизни на Земле. - Нальчик: Эльбрус, 2009. - С. 33-41.
7. Левончук Е. А. Современные представления об этиологии, патогенезе и терапии кандидозного вульво-вагинита // Медицинская панорама. - 2010. - № 1.
- С. 5-7.
8. Способ диагностики госпитальных штаммов : пат. 2285258 Рос. Федерация. № 2004132996/15, заявл. 15.11.2004 ; опубл. 10.10.2006. Бюл. № 28. - 11 с.
9. Практикум по микробиологии / под ред. А. И. Нетру-сова. - М. : Академия, 2005.
10. Суплотов С. Н., Журавлева Т. Д. Адаптация человека к авиаполетам. Липопероксидация в эритроцитах и ее регуляция. Методы лабораторной диагностики.
- Тюмень : Печатник, 2009.
11. Хетагурова Л. Г. Хронопатофизиология - новое направление классической патофизиологии // Материалы Первого Российского съезда по хронобиологии и хрономедицине с международным участием.
- Владикавказ, 2008. - С. 47-55.
12. Methods for cosinorrhymometry / W. Nelson [et al.] // Chronobiologia. - 1979. - Vol. 6, № 4. - P. 305-323.
