CC BY
279
УДК 543.544:867
ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ ПОВЕДЕНИЕ ЖИРОРАСТИВОРИМЫХ ВИТАМИНОВ В ОБРАЩЕНО-ФАЗОВЫХ СИСТЕМАХ ВЭЖХ
Л.В. Денисова, В.Н.Филимонов
Рассматривается характер хроматографического удерживания жирорастворимых витаминов (А, Б, Е, К) в режимах обращено-фазовых систем, ВЭЖХ. Системы отличаются природой неподвижной фазы ($Иа8огЪ-'ИН2, $>11а$отЪ-С№, ЗНазотЪ-БШ, $1-1аяогЬ-С2^18) и составами водосодержащих бинарных элюентов с добавками изопропа-нола, н-пропанола, ацетонитрила и 1,4-диоксана.
Ключевые слова: хроматография, сорбент, сорбат, аналит, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ),жирорастворимые витамины, бинарные элюенты.
Введение
Среди физиологически активных природных органических соединений - алкалоидов, гормонов, антибиотиков и других - витамины занимают особое место. Они представляют собой постоянные составные части живого функционирующего организма, незаменимы для питания и являются лечебными средствами, усиливающими защитные функции организма. Витамины находят широкое применение как пищевые добавки антиокислительного действия, используемые в здравоохранении и животноводстве [1]. Поэтому контроль содержания витаминов и уровня их сохранности очень важен для оценки пригодности фармацевтических препаратов, особенно пищевых продуктов и препаратов для животноводства.
Эффективным методом, позволяющим обеспечить количественный контроль содержания витаминов в многокомпонентных объектах, является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Метод ВЭЖХ незаменим при анализе термически и химически лабильных жирорастворимых витаминов (ЖРВ) групп А, Э, Е и К. Обычно применяемый вариант нормально-фазового (НФ) разделения синтетических жирорастворимых витаминов [2] основан на элюировании их неполярными органическими растворителями после сорбции на полярных сорбентах (химически модифицированных кремнеземов (ХМК), модифицированных полярными функциональными группами). Однако такой вариант ВЭЖХ не обеспечивает эффективного разделения сложных смесей, с полным набором жирорастворимых витаминов (А, Э, Е и К3) в пробах с водосодержащей матрицей, так как даже небольшие количества воды могут негативно влиять на воспроизводимость результатов. Такие препараты для НФ ВЭЖХ должны быть предварительно переведены методами щелочного гидролиза в форму, удобную для последующего хроматографирования. При проведении по-
добных операций изменяется состав биологически активной формы - эфи-ров.
Основным методом анализа ЖРВ без изменения их состава может стать обращенно-фазовая ВЭЖХ.
Цель данного исследования являлось изучение закономерностей хроматографического удерживания жирорастворимых витаминов D, E, в режимах изократической обращенно-фазовой ВЭЖХ для оптимизации условий их дифференцированного разделения.
Эксперимент
Приборы. Все хроматографические исследования выполняли на жидкостном хроматографе «Цвет» со спектрофотометрическим детектором с фиксированной длиной волны (Х=254нм). Изократическое элюиро-
-5
вание подвижной фазы (ПФ), с объемным расходом (1,05±0,02см /мин), осуществляли через стальные колонки (100х5,4мм) заполненные сорбентами (7,5 мкм) Silasorb-CN, Silasorb-NH2, Silasorb-Diol, Silasorb-С2-18 суспензионным способом. Множитель шкалы логарифмического усилителя детектора - 20.
Реагенты и материалы. В качестве аналитов применяли жирорастворимые витамины фармакопейной чистоты : ретинилацетат (витамин А-ацетат), ретинилпальмитат (витамин А-пальмитат), эргокальциферол (витамин D2), холекальциферол (D3), а-токоферилацетат (витамин Е-ацетат), менадион (витамин К3). Модельные стандартные растворы витаминов готовили в н-пропиловом спирте с последующим их разбавлением. В качестве несорбируемого соединения использовали водный раствор с массовой долей KNO3 5 %.
При использовании водно-органических подвижных фаз в качестве более активного компонента применены водорастворимые растворители II (изопропиловый спирт, н.-пропиловый спирт) и VI (ацетонитрил, 1,4-диоксан) групп селективности Снайдера. Это обеспечивало формирование гомогенной и совместимой с УФ-детектором подвижной фазы. Перед приготовлением подвижных фаз исходные растворители фильтровали от механических примесей и дополнительно очищали. Готовую смесь непосредственно перед использованием дегазировали, пропуская гелий в течение 2 мин.
Оптимальными условиями разделения сорбатов являлось достижение хроматографической системой значений: критерия разделения Rs>1,0, фактора емкости 0,5<к'<20 и коэффициента асимметрии 0,7<Аs<1,5.
Обсуждение результатов
ВЭЖХ - многофакторный метод анализа. На селективность разделения влияют характеристики хроматографической системы: геометрические параметры колонки, тип и свойства сорбента, состав элюента, условия проведения эксперимента (температура, скорость подачи подвижной фазы); а также свойства молекул сорбатов: площадь поверхности, гидрофоб-
ность, дипольный момент и наличие функциональных полярных групп способных к специфическим взаимодействиям [3, 4].
В [5] показано, что площадь поверхности сорбата может быть оценена с помощью индекса связываемости (х), характеризующего топологию молекулы. Применительно к ВЭЖХ [3,6,7], предложена условная оценка гидрофобности веществ по шкале упрощенного критерия гидрофобности н. ЖРВ относятся к группе высоко- (Н > 15) и среднегидрофобных (5 < Н < 10) органических соединений. Несмотря на достаточно высокую гидрофобность, наличие в структуре молекул ЖРВ функциональных полярных групп обусловливает проявления к специфической сорбции на полярных сорбентах.
В ОФ ВЭЖХ наибольшее распространение получили алкилприви-тые силикагели c длиной углеводородной цепи Cl-C22, но наряду с этими сорбентами применяют ХМК с привитыми аминными (-ЫН2), нитрильны-ми (-СКЫ) и диольными (^ю1) группами [8]. По полярности специфические неподвижные фазы подразделяют на слабополярные (-Ою1), среднеполяр-ные (-СК) и сильнополярные (-КН2).
При использовании в качестве сорбентов ХМК необходимо эффективное экранирование остаточных силанольных групп, которые, вступая в специфические взаимодействия с молекулами ЖРВ, изменяют характер удерживания сорбатов. Практически полное экранирование гидрофильных силанольных групп можно достичь, применяя водно-органические элюен-ты [9].
Количественное описание зависимостей удерживания ЖРВ от содержания органического компонента в подвижной фазе проведено по уравнению универсальной квазихимической модели удерживания в ВЭЖХ [10], учитывающей взаимодействия (образование ассоциатов и комплексов) компонентов хроматографической системы
1 + (кт-\)мт- - Км'М"26 - Ь)
Ь/ Ь/
где Бт, Ь, Мт - мольные доли сорбата (Б), наименее (Ь) и наиболее (М) сорбционно активного компонента подвижной фазы (т); К8, КМ, К8М, КММ - констаны равновесий квазихимических реакций сорбции и ассоциации сорбата и органического модификатора; Ф - фазовое соотношение хрома-тографической колонки.
Упрощение полиномного уравнения (1) позволило сократить время математической обработки экспериментальных данных, определить преобладающий тип взаимодействий в системе и описывающее их уравнение:
• в системе преобладают взаимодействия сорбат-сорбент, модификатор-сорбент:
[1 + С км - 1М ] = ^ + омт; (2)
1 1 Л к^м.
к' ФК
1 +
8Мм
5 V
Ь
(1)
к' фк 0
• к указанным в (2) прибавляются взаимодействия сорбат- модификатор:
1 =[1 + (КМ - ВМт ](1 + К8мМт ) = а0 + а^Мт + а'2 м1 ; (3)
к' ФК^
• указанные в (2) процессы дополнены взаимодействием модификатор-модификатор:
1 _ 1 + (км - \)Мт - 2КммМ1 ]
ФК3
г2
1т* = а0 + аМт + а'М1 . (4)
Удерживание аналитов при элюировании водно-изопропанольной смесью сильнополярным сорбентом Silasorb-NH2 описывается полдиномом второй степени (4). При этом факторы факторы емкости независимо от содержания органического компонента в подвижной фазе (рис.1, а), близки между собой( соответственно Rs для всех пар сорбатов стремиться к нулю). Удерживание сольватированных органическим растворителем молекул ЖРВ осуществляется на сорбционно-модифицированной молекулами изопропанола поверхности сорбента, вероятно, за счет дисперсионного и диполь-дипольного межмолекулярных взаимодействий.
На нитрильной фазе взаимодействие витаминов с поверхностью сорбента осуществляется за счет диполь-дипольных и дисперсионных, а с элюентом - за счет образования направленных водородных связей, ди-поль-дипольных и дисперсионных взаимодействий, т.е. взаимодействие сорбат-изопропанол в объеме подвижной фазы значительно. Это подтверждается вогнутой формой зависимостей 1/к'=/(Мт) относительно оси абсцисс (рис.1, б). Удерживание витаминов адекватно описывается полиномом второй степени (3), учитывающий взаимодействия сорбат- сорбент, модификатор -сорбент, модификатор-сорбат.
На диольной неподвижной фазе удерживание витаминов описывается полиномом второй степени, аналогичным применяемому в случае аминной фазы (рис. 1, в). Поскольку элюент содержит органический растворитель, способный к образованию водородных связей с поверхностью Silasorb-Diol, можно предполагать, что после его сорбции соверхность становиться достаточно гидрофобной и удерживание молекул ЖРВ осуществляется в основном за счет дисперсионных взаимодействий.
Применение полярных сорбентов совместно с водно-изопропанольной подвижной фазой не позволило достигнуть эффективного разделения смеси витаминов A-ацетат, Е-ацетат и D2. Селективного разделения смеси ЖРВ в обращено-фазовом режиме ВЭЖХ следует ожидать при использовании сорбентов, обусловливающих сорбцию витаминов за счет гидрофобной составляющей их молекул из водно-органических элюентов. Такими сорбентами являются алкилпривитые силикагели. Максимальная селективность неподвижной фазы отмечена (рис.2) для ал-килпривитых кремнеземах с ^ не менее 18: Silasorb-С18.
а
б
в
1/к
1/к
1/к
0,35 л 0,30 -0,25 -0,20 -0,15
2
0,0
0,2
3 1.6 -
4 1.2 -
0.8
—I
0,4
1 2.0 -2
3 1.5 Н
4
1.0 -
0.5 -
0.0
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 М
Рис. 1. Зависимость коэффициентов емкости от мольной (М„)
доли изопропанола в элюенте Обозначения: а - 811а80гЪ-МИ2; б - ЗНазвгЬ-СМ; в - ЗНазвгЬ-ВШ.; 1 - К3; 2 - А-ацетат; 3 - 02; 4 - Е-ацетат
12 10 -
8 6
4 -
2 0
Е-ацетат
02
А-ацетат Кз
Рис. 2. Зависимость удерживания витаминов от длины углеводородной цепи модифицированных кремнеземов
При увеличении элюирующей силы органического модификатора в ряду ацетонитрил<1,4-диоксан<изопропанол относительное удерживание молекул витаминов уменьшается, вероятно, за счет увеличения взаимодействия полярного фрагмента молекулы с элюентом. При элюировании ЖРВ смесями воды с ацетонитрилом, обладающим наименьшей элюирующей силой и значительной склонностью к дипль-дипольным взаимодействиям, наблюдается увеличение удерживания сорбатов и размывание профилей хроматографических пиков.
В хроматографической системе с элюентами, содержащими диок-сан, преобладают диполь-дипольные и протоноакцепторные межмолекулярные взаимодействия. Вклад гидрофобных (неспецифических) сил, обусловливающих селективное разделение сорбатов на алкилсиликагеле, в интегральное удерживание уменьшается. Поэтому происходит уменьшение разрешающей способности хроматографической системы при резком снижении к' до оптимальных. Однако пик витамина Е-ацетат остается несимметричным.
Форма пика улучшается при увеличении доли взаимодействий сор-
2
п
с
бат-модификатор в объеме подвижной фазы. Это обеспечивается введением в состав элюента органического компонента с большей элюирующей силой и способного к новым видам межмолекулярных взаимодействий [11].
К таким модификаторам относятся алифатические спирты , добавляющие к ранее отмеченным протоно-донорные взаимодействия. Разделение ЖРВ на колонке с Silasorb-C18 водно-изопропанольными элюентами характеризуется снижением к' и As для всех витаминов до оптимальных значений при одновременном ухудшении разрешения. Замена изоспирта на спирт нормальной структуры сопровождается незначительным изменением к' и As (в оптимальном диапазоне) при более высоких Rs для пар K3/A, A/D.
Таким образом, рассмотренные хроматографические системы с бинарными водно-органическими фазами эффективны для анализа 2-3 компонентных смесей ЖРВ, но не обеспечивают эффективного разделения более сложных смесей. Однако применение Silasorb-C18 совместно с вод-но-ацетонитрильным элюентом приводит к увеличению Rs, а с водно-спиртовым - позволяет оптимизировать факторы емкости и критерии асимметрии пиков. Поэтому эффективного разделения смеси витаминов (A-ацетат, E-ацетат, K3, D2) на Silasorb-C18 следует ожидать при использовании элюента, обеспечивающего значительную роль диполь-дипольных сил, с сохранением протоно-донорных и акцепторных взаимодействий. В состав такого элюента должны входить вода, н. -пропанол и ацетонитрил.
Список литературы
1. Березовский В.М. Химия витаминов. М.: Пищевая промышленность, 1973. 600 с.
2. Филимонов В.Н., Балятинская Л.Н., Колосова И.Ф. Разделение синтетических жирорастворимых витаминов с помощью многоколоночной нормально-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии // Журн. физ. химии. 1994. Т. 68. № 10. С. 1835-1838.
3. Киселев А.В. Межмолекулярные взаимодействия в адсорбции и хроматографии. М.: Высшая школа, 1986. 360 с.
4. Jandera P., Colin H., Gulochon G. Optimization of separation conditions in reversed phase liguid chromatography using complex solvent mixtures // Chromatogr. Sci. 1982. V. 16. P. 132-137.
5. Выбор условий элюирования в обращенно-фазовой хроматографии. Индекс связываемости и удерживание углеводородов и простейших кислородсодержащих соединений / В.Д. Шатц [и др.] // Журн. аналит. хи-мии.1984. Т. 39. № 5. С. 894-902.
6. Закономерности изменения индексов удерживания полициклических ароматических углеводородов в зависимости от их структуры и по-
лярности неподвижных фаз / Б.А. Руденко [и др.] // Журн. аналит. химии. 1984. Т. 39. С. 700-707.
7. Выбор условий элюирования в обращенно-фазовой хроматографии. Зависимость коэффициентов емкости от концентрации органического компонента подвижной фазы / В.Д. Шатц [и др.] // Журн. аналит. хи-мии.1984. Т. 39, № 2. С. 331-340.
8. Сычев К.С. Практическое руководство по жидкостной хроматографии. М.: Техносфера, 2010. 272с.
9. Модифицированные кремнеземы в сорбции, катализе и хроматографии / под ред. Г.В. Лисичкина. М.: Химия, 1988, с. 12-15.
10. Ланин С.Н., Никитин Ю.С. Прогнозирование удерживания в высокоэффективной жидкостной хроматографии. Межмолекулярные взаимодействия в подвижной фазе // Журн. аналит. химии. 1991. Т. 46. № 10. С. 1971-1980.
11. Sachok B., Kong R.C., Deming S.N. Multifactor Optimization of Reversed-Phase Liquid Chromatographic Separations // J. Chromatogr. 1980. V. 199. P. 317-325.
Денисова Любовь Васильевна, loveden13@mail.ru, канд. хим. наук, доцент, кафедра «Аналитическая химия, стандартизация и сертификация», Россия, Новомосковск, НИ (ф) РХТУ им. Д.И. Менделеева,
Филимонов Владимир Николаевич, vladfilimonov@rambler.ru, канд. хим. наук, доцент, кафедра «Аналитическая химия, стандартизация и сертификация», Россия, Новомосковск, НИ (ф) РХТУ им. Д. И. Менделеева
CHROMATOGRAPHIC BEHAVIOR OF THE FAT-SOLUBLE VITAMINS IN REVERSED-PHASE HPLC SYSTEMS
L.V. Denisova, V.N. Filimonov
In this paper considers the nature of the chromatographic retention of fat-soluble vitamins (A, D, e, K) in the modes of reversed-phase systems, HPLC. Systems differ in the nature of the stationary phase (Silasorb-NH2, Silasorb-CN, Silasorb-Diol, Silasorb-C2 up to 18) and compositions of aqueous binary eluents with additives isopropanol, n-propanol, ace-tonitrile and 1,4-dioxane.
Key words: chromatography, sorbent, sorbate, analyte, high performance liquid chromatography (HPLC), fat-soluble vitamins ,the binary eluents
Denisova Lyubov, loveden13@mail.ru, associate professor, Department of Analytic chemistry, standardization and certification, Russia, Novomoskovsk, The Novomoskovsk's Institute (subdivision) of the Mendeleyev Russian Chemical-Technological University,
Filimonov Vladimir, vladfilimonov@rambler.ru, associate professor, department of Analytical chemistry, standardization and certification, Russia, Novomoskovsk, The Novomoskovsk's Institute (subdivision) of the Mendeleyev Russian Chemical-Technological University
