CC BY
93ИЗВЕСТИЯ ВЫСШИХ УЧЕБНЫХ ЗАВЕДЕНИЙ
Т 55 (2) ХИМИЯ И ХИМИЧЕСКАЯ ТЕХНОЛОГИЯ 2012
УДК 543.544:543.645.9
А.М. Григорьев*, А.А. Мельник*, Л.В. Рудакова**
ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДРОТАВЕРИНА И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ И МЕТАБОЛИТОВ В БИООБРАЗЦАХ
(*Областное государственное учреждение здравоохранения особого типа «Бюро судебно-медицинской экспертизы», судебно-химическое отделение, Белгород, **Воронежская медицинская академия им. Н.Н. Бурденко) e-mail chrzond4250@yandex.ru
Предложены ГХ-МС и ВЭЖХ - методы определения дротаверина в моче и тканевых экстрактах, включая подготовку проб жидкостной или твердофазной экстракцией. Идентифицирован ряд продуктов его окисления и метаболитов в биообразцах. Приведены УФ спектры, ВЭЖХ и ГХ-МС характеристики этих соединений. Рассмотрены способы пробоподготовки, основанные на жидкостно-жидкостном и твердофазном вариантах экстракции. Пороги обнаружения дротаверина методами ГХ-МС и ВЭЖХ составляют 9 и 2 нг/мл соответственно.
Ключевые слова: дротаверин, определение, окисление, метаболиты, ГХ-МС, ВЭЖХ, твердофазная экстракция
ВВЕДЕНИЕ
Дротаверин (но-шпа, 1-(3,4-диэтоксибен-зилиден)-6,7-диэтокси-1,2,3,4 -тетрагидроизохино -лин гидрохлорид) - синтетический аналог папаверина, широко распространенное в фармакологической практике соединение, обладающее миотроп-ным спазмолитическим действием [1].
География публикаций, посвященных определению дротаверина (и, следовательно, области его лицензирования) ограничена; он не популярен в США и ряде стран Западной Европы. Этим объясняется отсутствие характеристик дротавери-на и его производных в известном справочнике «Clarke's Analysis of Drugs and Poisons», а также в основных хромато-масс-спектральных библиотеках.
Можно сказать, что основными и наиболее надежными способами определения являются различные варианты спектрофотометрических и хроматографических методик [2-7]. Тонкослойная хроматография со спектроденситометрическим детектированием, методы расчета УФ-спектроско-пических производных и отношений [2, 3] более пригодны для определения дротаверина в достаточно свежих фармацевтических препаратах. Легкая окисляемость дротаверина, приводящая к образованию ряда соединений, подобных как по спектрофотометрическим характеристикам, так и
по хроматографическому поведению в условиях ТСХ ограничивает область применимости этих методов.
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) - естественный и достаточно надежный способ определения дротаверина. Предложен нормально-фазовый [4], обращено-фазовый [5, 6], ион-парный [7] варианты. Представленный подбор хроматографических условий может вызывать некоторые сомнения вследствие зависимости состояния хромофоров дротаверина и ряда его производных от кислотности среды.
Применение газожидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ГХ-МС) представляет ряд неоспоримых преимуществ, позволяя сводить частные методики определения к более общим, что приобретает особую ценность при обзорном анализе образцов с неизвестным содержанием лекарственных и наркотических соединений. Основная цель данной работы - разработка ГХ-МС метода определения дротаве-рина, и идентификации его производных (продуктов окисления и гидролиза) и метаболитов в биообразцах, включая подготовку проб методами жидкостной и твердофазной экстракции.
Также мы предлагаем откорректированную ВЭЖХ-методику определения указанных соединений.
МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА
РЕЗУЛЬТАТЫ И Ж ОБСУЖДЕНИЕ
ГХ-МС. Использовали газовый хроматограф 6890 с квадрупольным масс-спектрометром 5375VL (электронная ионизация, 70 эв), Agilent Technologies. В режиме сканирования (SCAN) диапазон регистрируемых ионов составлял 50-550 m/z, также применяли режим регистрации групп ионов (SIM). Температуры инжектора и устройства сопряжения хроматографа с детектором составляли 270 и 290°С соответственно, пробу (0.2 мкл) вводили без сброса. Разделение проводили с применением двух кварцевых капиллярных колонок разной полярности в следующих условиях:
- EVDX-5ms (25м х 0.20 мм х 0.33 мкм), 50°С (0.5 мин) 99°С/мин (100°С, 1 мин), 35°С/мин (300°С, 15 мин).
- DB-17ms (15м х 0.25 мм х 0.25 мкм) 50°С (0.5 мин), 99°С/мин (100°С, 1 мин), 20°С/мин (300°С, 20 мин).
Скорость газа-носителя (гелия) постоянная, 0.8 и 1 мл/мин соответственно для первой и второй колонок.
Для обработки масс-хроматограмм использовали программу AMDIS (NIST).
ВЭЖХ. Жидкостнохроматографические измерения выполняли на модульной системе 1200 (Agilent Technologies) с бинарным насосом G1312A и диодно-матричным детектором G1315B. Колонку Eclipse SB-C18 (4.6x150 мм) с форколон-кой (4.6x12.5 мм), заполненную этим же сорбентом термостатировали (25°С), скорость потока элюента 1 мл/мин. Детектирование при 202 и 304 нм, запись спектра 200-500 нм. Условный мертвый объем системы определяли нитратом натрия.
Для приготовления элюента использовали фосфатный буфер, содержащий 20 мМ дигидро-ортофосфата калия и подстроенный до требуемой рН ортофосфорной кислотой или гидроксидом натрия. Добавки органического модификатора (ацетонитрила) выполняли с помощью бинарного насоса хроматографа.
Ацетилирование (AC) проводили в 100 мкл смеси уксусного ангидрида и пиридина (1:1), после упаривания смеси сухой остаток растворяли в этаноле.
Силилирование (TMS) проводили в 100 мкл смеси BSTFA + 1% TMCS и этилацетата (1:1), смесь после силилирования вводили в хроматограф.
Все использованные реактивы марки «х.ч.» или «ч.д.а.». Субстанцию дротаверина гидрохлорида (ЗАО «Розфарм) проверяли согласно [8] и использовали в качестве стандартного соединения. Ацетонитрил «Panreac», «gradient grade».
Важнейшей структурной особенностью дротаверина (7) является наличие в изохинолино-вом цикле азометиновой группы, связанной с ди-этоксибензильным фрагментом. Эта особенность определяет низкую стабильность, что особенно характерно для дротаверина в форме основания. Окисление (и последующая окислительная деградация) дротаверина приводит к образованию многочисленных продуктов, хорошо заметных при проведении ВЭЖХ растворов, содержащих дрота-верин и подвергавшихся длительному воздействию кислорода воздуха или неверной обработке. На рис. 1 приведены структуры тех соединений, которые могут наблюдаться в условиях ГХ-МС. Соединения 1 и 10 идентифицировали с помощью масс-спектральной библиотеки ^КТ08. Структуры остальных соединений (кроме дротаверина 7) являются предполагаемыми, их идентификацию проводили методами ГХ-МС, ВЭЖХ и УФ спектроскопии.
Рис. 1. Предполагаемые структуры идентифицированных соединений
Fig. 1.Supposed structures of identified compounds
Окисление дротаверина может протекать (последовательно или параллельно) как с участием мостиковой метиленовой группы, соединяющей циклические фрагменты, так и с участием метиленовых групп, принадлежащих к изохино-линовому циклу [9, 10]. В первом случае образуется этаверин (10) - спазмолитик, входящий в ряд фармацевтических композиций и постоянный спутник дротаверина в образцах. Соединение 12 весьма стабильно и (подобно этаверину) также почти всегда присутствует в дротаверин-содержащих смесях; соединение 11 напротив, весьма неустойчиво. Дальнейшая деградация приводит к разделению бензильного и изохинолино-вого остатков и образованию (в частности) ди-этоксильных производных бензойной кислоты (1 ), изохинолина (2) и дигидроизохинолинона (3).
ГХ-МС. Учитывая специфику судебно-химического анализа (необходимость выполнения подтверждающих определений), мы разработали два варианта определения обсуждаемых соедине-
ний, отличающихся применяемыми колонками. В табл. 1 приведены характеристики удерживания (линейные индексы в алкановой шкале) обсуждаемых соединений для обеих колонок, а также ионы, пригодные для детектирования и количественного определения в режиме SIM. Все соединения характеризуются хорошо заметными молекулярными ионами.
Таблица 1
Хромато-масс-спектрометрические характеристики
дротаверина, его производных и метаболитов Table 1. GC-MS parameters of drotaverine, its derivatives and metabolites
№ Брутто-формула Индексы (MT Селективные ионы
EVDX-5ms DB-17ms
1а c13h18°4 1754 2056 238 137, 154, 238
1б CnH22O4Si 1792 - 282 239, 267, 282
2 C13H15NO2 1971 2327 217 161, 189, 217
3 c13h17no3 2271 2819 235 150, 178, 235
4 c15h19no4 2306 2767 277 206, 234, 277
5 c22h27no4 2878 3482 369 340, 354, 368
6 c22h27no4 2892 3503 369 324, 340, 368
7 C24H31NO4 2917 3518 397 368, 382, 396
8 C22H25NO4 2951 3582 367 338, 352, 367
9 C22H25NO4 2978 3622 367 338, 352, 367
10 C24H29NO4 3010 3644 395 366, 380, 395
11 C24H29NO5 3203 3903 411 354, 366, 411
12 C24H27NO5 3299 4034 409 366, 380, 409
Соединение 1а (этилат 1) образуется при пробоподготовке образцов, содержащих деградировавший дротаверин в присутствии этанола. Соединение 1б (1 TMS) можно наблюдать при сили-лировании подобных образцов, ацетат 4 - при их ацетилировании.
Соединения 5, 6 являются дезэтилирован-ными метаболитами дротаверина; соединения 8, 9 могут являться как продуктами метаболизации (дезэтилирование), так и окисления. На основании выполненных измерений невозможно определить положения дезэтилированных групп; можно лишь сказать, что этих положений, как минимум, два.
Для количественного определения дротаверина можно воспользоваться как методом абсолютной калибровки, так и применять внутренний стандарт (цетиллаурат), добавляемый к приготовленным образцам непосредственно перед вводом их в хроматограф.
В режиме SCAN для широкого диапазона концентраций (2-950 мкг/мл) калибровочный график хорошо описывается квадратичной зависимостью (квадрат коэффициента корреляции R2 = 0.9999), порог обнаружения 470 нг/мл.
В режиме SIM по трем ионам (область малых концентраций, 0.1 - 2 нг/мл) калибровочный график практически линеен, R2 = 0.9999, порог обнаружения 9 нг/мл.
Относительное среднеквадратичное отклонение определения (СКО) относительной площади пика дротаверина составляет 2.2%.
Хроматограмма образца мочи человека, принимавшего дротаверин, и его масс-спектр приведены на рис. 2.
И00" (А)
368
396
I
m s
0
jü 50
1 S
I i-
о „
352
123
266
340
382
....... .
40
100 160 220 280
13.00
340 400 m/z, Da
et
(d с;
0 >>
1
ш S
о
X
ф
(Б)
8.58 1
16.87
7 15f2|
Li I I
2.00
6.00
10.00
14.00
18.00 мин.
Рис. 2. Масс-спектр дротаверина (А). Хроматограмма производных дротаверина (Б), извлеченных из мочи. Метод ГХ-МС, детектирование по общему ионному току, колонка DB-17ms. Времена удерживания (мин) компонентов: 8.58 (2), 13.00 (7), 15.53 (11), 16.88 (12) Fig. 2. Mass spectrum of drotaverine (А). Chromatogram of drotaverine derivatives (Б), extracted from urine. Detection by total ion current (GC-MS), column DB-17ms. Retention times of components (mm): 8.58 (2), 13.00 (7), 15.53 (11), 16.88 (12)
ВЭЖХ. Учитывая различие УФ-спектраль-ных характеристик и удерживания протонирован-ной и молекулярной форм дротаверина (рис. 3), а также практические преимущества применения кислого элюента, величина его pH должна быть значительно ниже величины pKA дротаверина в элюенте. Поскольку pKA дротаверина (измеренная методом ВЭЖХ в элюентах состава 40 об. % аце-тонитрила в фосфатном буфере при 25°С) примерно равна 4.6, то величина pH должна быть не выше 3. С другой стороны, при снижении pH элюента ниже 2, ухудшается разделение компонентов 7, 10, 12.
Мы предлагаем два варианта хроматогра-фирования - градиентный и изократический, ориентированные на разные потребности и техническую оснащенность. Составы элюентов:
- градиентный режим (1): линейное изменение от 30 до 70 об.% ацетонитрила в фосфатном буфере pH 2.2 за 15 мин;
- изократический режим (2): 45 об.% ацетонитрила в фосфатном буфере pH 2.5 с добавкой
30 мМ перхлората лития (эффективность по дро-таверину 8500 т.т.).
500 -К
z> i
I 300 - \ <
100 -
о -_
200 250 300 350 400 450
Л, nm
Рис. 3. УФ-спектры дротаверина в кислой (1) и слабоосновной среде (2)
Fig. 3. UV-spectra of drotaverine in acidic (1) and weakly-basic medium (2)
Добавка перхлората лития в элюенте для изократического режима необходима для повышения нагрузочной емкости колонки по ионоген-ным соединениям, что позволяет поддерживать высокую эффективность по ним; для градиентного режима в ней нет необходимости. В табл. 2 приведены относительные характеристики удерживания дротаверина и продуктов его окисления для обоих режимов, а также величины lmax в соответствующих элюентах. В качестве относительных характеристик использованы отношения кажущихся величин к' компонентов к кажущейся к' папаверина для градиентного и соответствующих истинных величин для изократического режимов. На рис. 4 приведены УФ спектры компонентов 1, 3, 12 в элюенте для изократического режима (спектр этаверина почти подобен спектру папаверина).
Таблица 2
Относительные величины k' и lmax ряда соединений (ВЭЖХ)
Table 2. Relative values of к'and lmax for a number of compounds (HPLC)
При объеме ввода 10 мкл и длине волны детектирования 202 нм калибровочный график практически линеен (Л2=0.9998) по крайней мере, в диапазоне концентраций 0.02 - 100 мкг/мл. Порог обнаружения 2 нг/мл.
Относительное СКО определения площади пика дротаверина (абсолютная калибровка) составляет 0.8%.
200 250 300 350 400 450
Л, nm
Рис. 4. УФ-спектры продуктов окислительной деградации
дротаверина
Fig. 4. UV-spectra of products of drotaverine oxidative degradation
Жидкостная экстракция. Экстрагируе-мость дротаверина из водных растворов в хлороформ измеряли методом ВЭЖХ. Величину pH водной фазы в диапазоне 1 - 9 регулировали фосфатным буфером, а также водными растворами соляной кислоты и аммиака. Объемы водной и органической фаз всегда были одинаковы, время экстракции 2 мин. В сильнокислой области (pH 12) концентрационный коэффициент распределения дротаверина между органической и водной фазами примерно равен 9; в более основной области экстракция протекает практически нацело. Таким образом, способы очистки образцов методом реэкстракции или варьирования pH водной фазы представляется весьма сомнительными. Вследствие легкой окисляемости дротаверина при средних и высоких pH рекомендуется следующая схема. Водную фазу подкислить до pH 1-2, двукратно экстрагировать равным объемом хлороформа или смесью хлороформ-бутанол (время экстракции не менее 2 мин). Объединенные экстракты высушить пропусканием через слой сульфата натрия, добавить 1 об.% уксусной кислоты и упарить при температуре не выше 45°С. Остаток растворить в подходящем растворителе (элюент для ВЭЖХ и метанол или этанол для ГХ-МС).
Метод жидкостно-жидкостной экстракции пригоден для определения дротаверина в моче.
Твердофазная экстракция. Дротаверин экстрагировали по ионообменному механизму с помощью патронов AccuBond II EVIDEX (Agilent Technologies) вместимостью 3 мл, содержащие 200 мг смешанного катионообменного и обраще-но-фазового сорбента). Эффективность экстракции проверяли методом ВЭЖХ на модельных растворах дротаверина в моче и в воде.
Условия экстракции. Патрон промывали и кондиционировали порциями по 6 мл ацетонитри-
№ Соединение Режим 1 Режим 2 lmax, нм
1 С11Н14О4 1.71 1.38 206, 220, 262, 292
3 C13H17NO3 1.42 0.94 222, 262, 300
7 C24H31NO4 (дротаверин) 1.90 4.60 202, 244, 304, 356
10 C24H29NO4 (этаверин) 2.01 5.34 252, 314, 330 (плечо)
12 C24H27NO5 2.19 5.85 238, 314, 365 (плечо)
ла и водного раствора ортофосфорной кислоты (4 об.%) и загружали 8 мл подготовленного образца (5 мл мочи, подкисленной до pH 2 с добавкой 3 мл раствора кислоты). Затем промывали последовательно 3 мл раствора ортофосфорной кислоты, 5 мл ацетонитрила и продували патрон в течение нескольких секунд для удаления основного количества ацетонитрила, остающегося в набивке. Элюировали 4 мл смеси дихлорметан - изопропа-нол - водный раствор аммиака (конц.) в соотношениях 78:20:2 по объему. К элюату добавляли 0.1 мл ледяной уксусной кислоты, упаривали в токе воздуха при температуре не выше 45°С, сразу растворяли в подходящем растворителе и вводили в хроматограф.
Эффективность экстракции рассчитывали усреднением двух измерений, полученных при использовании двух патронов. Она составила 93.0 % (расхождение 4 %) при экстракции из водных модельных растворов и 94.8 % (при расхождении 3 %) при экстракции из мочи. При использовании водных модельных растворов дротаверин не нашли ни в одной порции промывных растворов, прошедших через патрон. Метод ТФА пригоден для определения дротаверина как в моче, так и в экстрактах из тканей.
Дериватизация. При проведении ацети-лирования дротаверин образует ряд продуктов, из которых основным, по-видимому, является ацетат енаминовой формы. Как и многие производные дротаверина, это соединение термолабильно, но тем не менее, хорошо заметно на газожидкостных хроматограммах как пик с затянутым фронтом (индексы удерживания примерно равны 3381 для колонки EVDX-5ms и 4050 для DB-17ms). В его масс-спектре наиболее интенсивны ионы с m/z 368, 396 и 439.
С другой стороны, при проведении сили-лирования, дротаверин почти полностью сохраняется в исходной форме.
ВЫВОДЫ
1. Определение дротаверина методом ГХ-МС характеризуется высокой воспроизводимостью и низкими порогами обнаружения. Идентификация продуктов окислительной деградации и
метаболитов дротаверина позволяет делать заключение о факте приема дротаверина при анализе образцов, подвергшихся гнилостному разложению или неверно обработанных.
2. Основными источниками погрешности определения дротаверина следует считать процессы окислительной деградации, протекающие как в биообъектах, так и при неправильной пробопод-готовке.
3. Для определения дротаверина и продуктов его окисления методом ВЭЖХ пригодны элю-енты с pH 2.2 - 2.5. Эта величина должна уточняться при использовании определенной колонки.
4. Оптимальным методом выделения дро-таверина из жидких биообразцов следует признать твердофазную экстракцию при учете необходимости подкисления элюата.
ЛИТЕРАТУРА
1. Машковский М.Д. Лекарственные средства, 15 изд. М.: Новая волна. 2006. 1206 с.;
Mashkovskiy M.D. Pharmaceuticals. 15 ed. M.: Novaya volna. 2006. 1206 р. (in Russian).
2. Abdellatef H.E., Ayad M.M. // Spectrochim. Acta A. Mol. Biomol. Spectrosc. 2007. V. 66. N 4-5. P. 1147-1151.
3. Ayad M. M., Youssef N. F., Abdellatif H. E., Soliman S. M. // Chem. Pharm. Bull. 2006. V. 54. N 6. P. 807 - 813.
4. Mezei J., Kuttel S., Szentmiklosi P., Marton S, Racz I. // J. Pharm. Sci. 1984. V. 73. N 10. P. 1489 - 1491.
5. Bolaji O.O., Onyeji C.O., Ogungbamila F.O., Ogunbona F.A., Ogunlana E.O. // J. Chromatogr. 1993. V. 622. N 1. P. 93 - 97.
6. Lalla J.K., Shah M.U., Jain M.B., Sharma AH. // J.
Pharm. Biomed. Anal. 1993. V. 11. N 4-5. P. 385 - 388.
7. Girgis EH. // J. Pharm. Sci. 1993. V. 82. N 5. P. 503 - 505.
8. Дротаверина гидрохлорид, субстанция. НД42-12678-02. Фармакопейный государственный комитет МЗ РФ. 2005; Drotaverine hydrochloride, substance. ND42-12678-02. Pharmaceutical government committee. MH RF. 2005 (in Russian).
9. Чеховская О.В., Пыщев А.И. // Тез. докл. Международной конференции по новым технологиям и приложениям современных физико-химических методов. Ростов н/Дону. РГУ: Биос. 2001. С. 117-119;
Chehovska O.V., Pishev A.I. // Theses of presentations of International Symposium on new technologies and application of new physical-chemical methods. Rostov n/Don: RGU: Bios. 2001. P. 117-119 (in Russian).
10. Карташов В.А. // Изв. вузов. Химия и хим. технология. 1989. Т. 30. Вып. 8. С. 245-248;
Kartashov V.A. // Izv. Vyssh. Uchebn. Zaved. Khim. Khim. Tekhnol. 1989. V. 30. N 8. P. 245-248 (in Russian).
Кафедра фармацевтической химии и клинической фармации
