CC BY
98
¥ЛПА ИНЖЕНЕРИЯСЫ УШ1И ЦОЙ ЭЦЕШШЩ ЖАСУШАСЫЗ ЦАНЦАСЫН АЛУ
ТYЙiн: Бул жумыста улпа инженериясында колданылуы мумган едеш улпасыныд гистологиясы мен биоуйлеймдШп эр турл1 протоколдармен жасалган децеллюляризациясы керсетшген. Табиги едештщ курылысына уксас биоуйлеймд биологиялык канканы жасау ушш усак малдыд едеш1 перфузиялык эдкпен едделген. вдештщ одтайлы децеллюляризациялау э,щй Triton X100 жэне ЭДТАмен еддеу болып табылды. Гистологиялык талдау едештш ¡шга курылысыныд сакталганы, жасуша элементтершщ жоктыгы жэне елеуйз ДНК мелшерш керсетть
ТYЙiндi сездер: децеллюляризация, едеш, жасушасыз матрикс, улпа инженериясы.
OBTAINING THE ACELLULAR MATRIX OF ESOPHAGUS OF SHEEP FOR TISSUE ENGINEERING
Resume: This paper describes the influence of different decellularization protocols for histology and biocompatibility of the esophagus with regard to future use in tissue engineering. Esophagus of small cattle has been processed by perfusion method for creating a biocompatible biological frame, which imitates the native architecture of the esophagus. Optimal decellularization of the esophagus was achieved after processing by Triton X100 with further processing by EDTA. Histological analysis showed the safety of the extracellular matrix structure of the tissue with absence of cellular elements and low DNA content. Keywords: decellularization, esophagus, acellular matrix, tissue engineering.
УДК:615.214.24:543.062.061
А.В. ЧУБЕНКО*, М.А. САВЧЕНКО
*Харьковская медицинская академия последипломного образования, г. Харьков, Украина. Коммунальное учреждение "Черкасское областное бюро судебно-медицинской экспертизы", г. Черкассы, Украина
РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГИДАЗЕПАМА В БИОЛГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ МЕТОДОМ
ХРОМАТОМАССПЕКТРОМЕТРИИ
Представлен метод определения гидазепама в крови и биологических тканях по его фармакологически активному метаболиту N1-дезалкилгидазепаму в варианте двумерной хроматомасспектрометрии. С целью изолирования Ы1-дезалкилгидазепа.ма предложено два варианта экстракции - жидкостная и твердофазная. Показано, что в случае жидкостной экстракции оптимальным экстрагентом является смесь 1-хлорбутана и этилацетата в соотношении 9:1. Эффективность изолирования жидкостной и твердофазной экстракцией составляет 98 и 94 % соответственно. Линейный диапазон определяемых концентраций составил 201000 нг/мл в крови, и 0,2-10 мкг/г в тканях органов. Предел обнаружения в крови и тканях составил соответственно 3 и 5 нг. Ключевые слова: гидазепам, 1.4-бензодиазепины, экстракция, хроматомасспектрометрия, валидация.
Гидазепам, известный также под названием Диамидазепам, является производным 1,4-бенздиазепина с выраженным анксиолитическим действием и применяется в качестве дневного транквилизатора [1]. В отличие от других препаратов с анксиолитической активностью, гидазепам в терапевтических дозах не проявляет седативный и миорелаксантный эффекты и обладает низкой токсичностью. Вместе с тем, он потенцирует действие алкоголя, наркотических и психотропных препаратов, что обуславливает его немедицинское использование с целью усиления наркотического эффекта или осуществления криминальных действий.
Целью настоящей работы явилась разработка методики определения гидазепама по его активному метаболиту №-дезалкилгидазепаму в крови живых лиц, а также крови и паренхиматозных органах трупов методом двумерной хроматомасспектрометрии.
Будучи пролекарством, гидазепам подвергается интенсивному метаболизму, в результате которого в организме человека обнаруживаются главным образом его метаболиты [2,3], основным из которых является фармакологически активный №-дезалкилгидазепам. Именно последний и обуславливает весь спектр фармакологических свойств гидазепама [3]:
Показано, что в крови человека присутствует только дезалкилгидазепам[1,3]. Литературные данные
относительно его распределения в других органах и жидкостях человека отсутствуют, равно как и данные относительно распределения других его метаболитов. Однако, наши исследования крови и органов трупов, в
анамнезе которых было употребление гидазепама, а также крови и мочи принимавших его добровольцев, показали, что в тканях печени и почки, как и в крови, присутствует только №-дезалкилгидазепам. В желудке и верхнем отделе тонкого кишечника обнаружены, в основном, гидазепам и в небольшом количестве карбоксиметилгидазепам (5-20 %), а
в моче - карбоксиметилгидазепам (50-70%), гидазепам (615%), №-дезалкилгидазепам (10-15%) и глюкуронид 3-гидpокси-N1-дезалкилгидазепама (5-15%). Ранее, на основании полученных данных, нами был предложен метод обнаружения гидазепама по продуктам его гидролиза в моче [4], принцип и методология которого с успехом была применена для анализа содержимого желудка. В настоящей работе нами представлено определение гидазепама по его активному метаболиту N1-дезалкилгидазепаму в крови живых лиц, а также крови и паренхиматозных органах трупа методом двумерной хроматомасспектрометрии.
Материалы и методы. Стандарты №-дезалкилгидазепама и феназепам (внутренний стандарт) были приобретены у ОДО "Интерхим" (г. Одесса, Украина). Все органические растворители использовались квалификации " для ВЭЖХ " (Merck, Darmstatd, Germany). В качестве реагента для силилирования применялся N,O-
бис(триметилсилил)трифторацетамид (BSTFA) содержащий 1 % триметилхлорсилана (Fluka Analytical, Buchs SG, Switzerland). Уксусная кислота, 25 % раствор аммиака, дигидрофофат калия (KH2PO4) - квалификации "х.ч.". 1М раствор уксусной кислоты готовили путем растворения 5,7 мл уксусной кислоты в 60 мл дистиллированной воды и доведением до общего объема 100 мл. Фосфатный буферный раствор (0,1М, рН=6,0) готовили путем растворения 6,8 г KH2PO4 в 400 мл дистиллированной воды, доведением рН до значения 6,0 под контролем рН-метра 1М раствором КОН и доведением до общего объема 500 мл. Боратный буферный раствор (0,01М, рН=9,2) готовился из фиксанала. Колонки для твердофазной экстракции Bond Elute Certify, 130 мг, 3 мл производства Agilent Technologies (Palo Alto, CA, USA).
Исходные и рабочие растворы. Исходный раствор N1-дезалкилгидазепама с концентрацией 100,0 мкг/мл был приготовлен растворением 10,3 мг №-дезалкилгидазепама в 100 мл метанола. Рабочие растворы с концентрацией 1,0 и 10,0 мкг/мл готовили путем разведения соответственно 0,1 и 1,0 мл исходного раствора №-дезалкилгидазепама метанолом до 10,0мл. Рабочий раствор внутреннего стандарта с концентрацией 50,0 мкг/мл был приготовлен растворением 10,2 мг феназепама в 200 мл метаноле. Оборудование. В работе использовали одноквадрупольный хроматомасспектрометр Agilent 6890N/5973N/FID (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA), с пневматическим микропотоковым переключателем потока газа-носителя между колонками, позволяющий переключать поток газа носителя с первой колонки на детектор ионизации в пламени (ДИП), или через вторую колонку в массдетектор. Колонка № 1 - OT-5MS 0,25 мм х 30 м, конец колонки соединен с ДИПом, №2 - DB-17MS 0,25 мм х 30 м, конец колонки непосредственно входит в масспектрометр. Аналитические весы для взятия навесок с точностью взвешивания 0,1 мг Mettler-Toledo ML 2"4/"1 (Greifense, Switzerland).
Условия работы хроматографа и массдетектора.
Температура испарителя - 25" "С. Программа изменения давления на входе в первую колонку (испарителе): 26,00 psi - 1 мин, увеличение до 40,00 psi со скоростью 4 psi/мин, затем увеличение до 50,22 psi со скоростью 2,00 psi/мин, удерживание 2,91 мин, затем понижение давления до 0,50 psi со скоростью 30 psi/мин и удерживание до конца хроматографического цикла. Программа изменения давления на входе во вторую колонку (пневматический переключатель): 19,35 psi - 1 мин, увеличение до 30,40 psi со скоростью 4 psi/мин, затем увеличение до 38,72 psi со скоростью 2,00 psi/мин и выдержка при данном давлении до конца хроматографического цикла. Режим ввода пробы - 1 мкл с помощью автоинжектора серии 7683 без деления потока. Температурная программа термостата: 70 "С - 1 мин, нагрев до 210 "С со скоростью - 45 "С/мин, затем нагрев до 32" "С со скоростью - 25 "С/мин, и выдержка при этой температуре 8,49 мин. Температурная программа линии
сопряжения хроматографа с масспектрометром - 280 0С, в течении 6,91 мин, затем нагрев до 320 0С со скоростью - 25 0С/мин, и выдержка при этой температуре 8,49 мин. Температура ДИПа - 250 0С. Температура источника ионов -230 0С, квадруполя - 150 0С, энергия электронов - 70 еВ, напряжение на электроумножителе на 200 В больше чем при автонастройке. Массдетектор настроен для работи в режиме селективного ионного мониторинга (СИМ). С 8,50 до
13.59 минуты скнируются ионы №-дезалкилгидазепама, а с
13.60 минуты и до конца хроматографического цикла ионы феназепама (внутренний стандарт).
Пробоподготовка. Кровь. Перед экстракцией к 1мл образца крови (сыворотки или плазмы) добавлялось 20 мкл раствора внутреннего стандарта и смесь перемешивалась.
1. Жидкость-жидкостная экстракция (ЖЖЭ). К 1 мл объекта добавляли 1мл боратного буферного раствора (рН=9,2), перемешивали, затем смесь экстрагировали 5мл смеси н-хлорбутан - этилацетат (9:1) в течении 5 мин. Для полного разделения слоев пробу центрифугировали 5мин при 3000 об/мин. Органическую фазу отделяли и упаривали при разряжении водоструйного насоса при 40 0С и остаток дериватизировали.
2. Твердофазная экстракция (ТФЭ) [5]. 1мл объекта разбавляли 1 мл 0,1М фосфатного буферного раствора (рН=6,0) и, в случае трупной крови, при необходимости, центрифугировали при 2000 об/мин в течении 10 минут. Подготовленный объект переносили в промытую последовательно 2 мл метанола, 2 мл дистиллированной воды и 2 мл 0,1М фосфатного буферного раствора (рН=6,0) колонку. После загрузки объекта колонка последовательно промывалась 3 мл дистиллированной воды, 1мл 1,0М раствором уксусной кислоты и в конце 3 мл метанола. Далее колонку сушили 5 мин и проводили элюирование аналита 2 мл смеси дихлорметан - ьпропанол - 25 % роаствор аммиака (78:20:2). Элюат упаривали при разряжении водоструйного насоса при 40 0С и остаток дериватизировали.
3. Дериватизация. К упаренным экстрактам или элюатам добавляли 50 мкл BSTFA и нагревали в герметично закрытой виале 20 мин при температуре 80 0С. 1мкл полученного раствора вводили в хроматограф.
Ткани трупа. 1 г ткани гомогенизировали с 4 мл дистиллированной воды, к 0,5 мл гомогената добавлялось 20 мкл раствора внутреннего стандарта и смесь перемешивали. Затем, перед ЖЖЭ добавляли 1,5 мл боратного буферного раствора (рН=9.2), а перед ТФЭ - 1,5 мл фосфатного буферного раствора (рН=6.0), и гомогенат центрифугировали при 3000 об/мин 10 мин. Далее подготовленные объекты подвергали ЖЖЭ или ТФЭ с последующей дериватизацией как описано для крови. Калибровка и валидация. Калибровочный график для определения №-дезалкилгидазепама строили, используя рабочие растворы последнего добавленные в не содержащую данный аналит кровь или гомогенаты тканей. Концентрация внутреннего стандарта в объектах, во всех случаях, составляла 1,0 мкг/мл. Полученные графики использовались для проверки линейности, вычисления предела детектирования и предела количественного определения. Аналогично приготовленные пробы крови и гомогената использовали для нахождения показателей точности, воспроизводимости и возврата, а также для нахождения и коррекции "временных окон" на хроматограммах с целью идентификации. Идентификацию аналита проводилась на основании времени удерживания и анализа масспектральных данных. "Временное окно" на первой колонке составляло 0.10 мин, на второй колонке 0.2 мин, от значения полученного при хроматографировании контрольной пробы содержащей аналит и внутренний стандарт. Хроматографические параметры гидазепама, его метаболитов и их различных дериватов представлены в работе [6]. В режиме СИМ идентичность оценивалась по наличию выбранных масс и отношения их интенсивностей
согласно указаний [7]. Процедуру валидации проводили согласно документа [8]. Результаты и их обсуждение
Экстракция и хроматографическое разделение.
Учитывая отсутствие в литературе информации о влияние
Таблица 1.
природы экстрагента на изолирование №-дезалкилгидазепама, на первом этапе мы изучили степень изолирования его наиболее популярными в аналитической токсикологии экстрагентами. Полученные результаты представлены в Таблице 1.
Степень экстракции N1-дезалкилгидазепама (%) Хср±а, n=5
гексан гептан хлороформ дихлорметан эфир этилацетат 1- хлорбутан 1- хлорбутан этилацетат (9:1)
15±3 13±4 82±5 79±4 97±5 98±6 91±4 98±3
Как видно из таблицы, наименее эффективными оказались гексан и гептан, все остальные растворители показали примерно равную эффективность экстракции. Однако, этилацетат и эфир наряду с аналитом в значительной степени извлекают коэкстрактивные вещества, сильно загрязняющие конечные экстракты, а хлороформ и дихлорметан, с практической точки зрения, менее удобны при экстракции небольших объемом в пробирках. Наиболее оптимальным, по нашему мнению, является 1-хлорбутан. Данный экстрагент, по сравнению с этилацетатом и эфиром, в значительно меньшем количестве извлекает коэкстрактивные вещества, находясь по этому критерию наравне с хлороформом и дихлорметаном. Добавление к 1-хлорбутану 1 % этилацетата позволило увеличить степень экстракции №-дезалкилгидазепама до 98 %, при этом количество экстрагируемых примесей осталось на прежнем уровне. Как альтернативный, изучен вариант изолирования методом ТФЭ. Степень экстракции данным методом составляет 94±5 % (n=5), а полученные экстракты, в отличие от ЖЖЭ, оказались значительно чище. Хроматографическое разделение выполнено в варианте двумерной хроматомасспектрометрии. Принцип и преимущества данного варианта хроматографического разделения описаны в работе [4].
Валидация метода. В качестве внутреннего стандарта выбран феназепам, как ближайший 7-бромзамещенный химический аналог. С целью увеличения чувствительности и улучшения хроматографических характеристик N1-дезалкилгидазепам подвергался дериватизации с получением триметилсилильного производного. Несмотря на преимущество получения трет-бутилдиметилсилильных производных [6], в масспектре такового производного N1-дезалкилгидазепама, интенсивность кластера
молекулярных ионов не превышает 10 %. Последнее обстоятельство послужило основанием в пользу выбора триметилсилильного производного, у которого молекулярный и изотопный ему ионы являются базовыми в масспектре. Для режима СИМ из масспектра N1-дезалкилгидазепама выбраны ионы со значением m/z 371, 373, 385 (М+), 387 и 389. Внутренний стандарт
Таблица 2._
прослеживался по ионам со значением m/z 385, 387, 405, 407, 420 (М+) и 422. Критерии выбора ионов изложены в руководстве [7].
Рабочий диапазон концентраций устанавливался, учитывая данные о концентрации №-дезалкилгидазепама в крови, после однократного и длительного (до 14 дней) приема гидазепама [3], а также анализа построенной прямой на соблюдение линейности. На основании полученных данных рабочий диапазон определения ^-дезалкилгидазепама в крови составил 20-1000 нг/мл, с калибровкой по пяти точкам - 20, 50, 100, 500 и 1000 нг/мл. При определении в биологических тканях, точки калибровочной прямой будут соответствовать концентрациям ^-дезалкилгидазепама в 0,1 г ткани (0,5 мл гомогената соответствует 0,1 г). При необходимости определения концентраций свыше 1000 нг/мл в крови (сыворотке, плазме) или свыше 10 мкг/г в тканях, объект до внесения внутреннего стандарт, может быть разбавлен или взят в соответствующе меньшем количестве. Определение в тканях концентраций менее 200 нг/г возможно при использовании всего (5мл) гомогената. При этом, в зависимости от используемого метода экстракции ткань гомогенизируют в боратном (рН=9,2), или в фосфатном (рН=6,0) буферных растворах. Значения параметров валидации определения №-дезалкилгидазепама в крови и тканях трупа представлены в таблицах 2 и 3. Параметры "точность" и "возврат" оценивались для трех уровней, соответственно наименьшего, среднего и наивысшего уровней диапазона концентраций. Параметр "воспроизводимость" оценен как среднеквадратичное отклонение (СКО) определения каждого уровня концентраций. Исследование образцов крови и биологических тканей из различных источников (n=10 для обоих объектов) не содержащих №-дезалкилгидазепама, показало отсутствие влияния матрицы на обнаружение и определение последнего. Определению не мешают диазепам, оксазепам, хлордиазепоксид, медазепам, клоназепам, 7-аминоклоназепам, нитразепам, 7-аминонитразепам, 7-аминофлунитразепам, нордазепам, альпразолам, празепам при совместном присутствии.
Объект Линейность (Г2) Предел обнаружения (нг) Предел количественного определения (нг) Воспроизводимость (СКО (%))
20 нг 50-1000 нг
кровь 0,99957 3 10 7,2 0,9-2,6
ткани 0,99961 5 15 9,8 1,3-3,4
Таблица 3.
Точность (%) Концентрация аналита (нг) Возврат (%), Хср±а n=5
в течении дня день ото дня ЖЖЭ ТФЭ
кровь ткани кровь ткани кровь ткани кровь ткани
3,8 6,1 0,3 0,3 20 97±4 45±6 94±5 53±7
1,4 1,2 0,2 0,2 500 98±4 55±4 94±5 57±6
0,8 0,7 0,2 0,3 1000 98±3 55±5 95±6 56±6
Выводы. Разработан чувствительный и специфичный метод установления факта употребления гидазепама по обнаружению его фармакологически активного метаболита - Ы1-дезалкилгидазепама. Возможность исследовать как кровь, так и ткани трупа позволяет использовать его в клинической, наркологической и судебно-медицинской практике. Предел обнаружения в крови и органах составляет 3 нг/мл и 5 нг/г, соответственно. Рабочий
диапазон концентраций находится в пределах 20-1000 нг/мл для крови и 0,2-10 мкг/г для органов. Диапазон определяемых концентраций может быть значительно расширен изменением количества взятого на анализ объекта. Последнее обстоятельство особенно актуально ввиду отсутствия данных относительно токсических и смертельных концентраций №-дезалкилгидазепама в крови и биологических тканях.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1 Жук О.В., Карпинчик В. А. Гидазепам - новый отечественный дневной транквилизатор // Провизор, 2000. - N 17. - С. 33-35
2 Савченко М. А., Петюшн Г. П. Досшдження поведшки гщазепаму та його метаболтв в умовах кислотного гщрол1зу // Буковинський медичний вкник. - 2013. - т. XVII. - №3(67). - ч.1. - С. 143-148.
3 Андронати С.А., Воронина Т.А., Головенко Н.Я. и др. Гидазепам. — К.: Наук. думка, 1992. - С. 55-62.
4 Savchenko M.A., Petunyn G.P. Determination gidazepam aminobenzophenones by two-dimensional gas chromatography-mass spectrometry (GC-GC-MS) in urine // Journal of Chemical and Pharmaceutical Research. - 2015. - Vol. 7. - № 2. - P. 555-560.
5 Agilent bond elut certify and certify II methods manual // Agilent Technologies Publication 5991-4939EN. - 2014. - P. 35.
6 Савченко М.А., Петюшн Г.П. Газохроматограф!чне до^дження, гщазепаму, продук^в його гщрол!зу та метаболтв / / Теор!я та практика судово! експертизи i кримшашстики. - 2013. - № 1. - С. 312-318.
7 Guidance document on analytical quality control and validation procedures for pesticide residues analysis in food and feed. // European commission health & consumer protection directorate-general. - SANC0/12571/2013. - Р. 12.
8 Guidance for the validation of analytical methodology and calibration of equipment used for testing of illlicit drugs in seized materials and biological specimens ST/NAR/41. - N.Y.: United Nations, 2009. - P. 35-38.
9 Mohammad Nasir Uddin, Victoria F. Samanidou, Ioannis N. Papadoyannis Biosample preparation and gas chromatographic determination of benzodiazepines —a review / / Journal of Chromatographic Science. - 2013. - № 5. - Р. 587-598.
A.V. CHUBENKO*, M.A. SAVCHENKO
*Kharkiv medical academy of postgraduate education, Kharkiv, Ukraine Forensic Toxicological Department of the Regional Office of Forensic Medical Examination, Cherkassy, Ukraine
ELABORETING AND VALIDATION METHODS OF DETERMINATION GIDAZEPAM IN BIOLOGICAL MATAREAL BY GAS
CHROMATOGRAPHIC-MASSPECTROMETRY
Resume: review methods of determination gidazepam in blood and biological tissues on its awake metabolite №-desalkylgidazepam by two-dimensional gas chromatography-mass spectrometry. For isolate №-desalkylgidazepam were applied two techniques -solvent and solidphase extraction. We found, what extraction mixture 1-chlorbutane-ethylacetic ether (9:1), is a optimal for isolate №-desalkylgidazepam. Extraction yield by solvent and solid-phase extraction were 98 and 94 % respectively. The working range for blood was 20-1000 ng/mL and for tissues was 0,2-10 ^g/g/ The limit of detection and limit of quantitative for blood and tissues were 3 and 5 ng respectively. Keywords: gidazepam, 1.4-benzdiazepines, extraction, gas chromatography-mass spectrometry, validation.
