CC BY
17
https://doi.org/10.17116/molgen201937041178
Хондроитинсульфат увеличивает эффективность трансфекции клеток комплексами ДНК-ПЭИ
© С.С. БУЛАНЕНКОВА, Е.В. СНЕЖКОВ, В.К. ПОТАПОВ, С.Б. АКОПОВ, Е.Д. СВЕРДЛОВ
ФГБУН «Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН, 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10, Россия
Резюме
Введение. Одной из самых популярных невирусных систем доставки генотерапевтических конструкций являются комплексы ДНК с носителями на основе полиэтиленимина (ПЭИ). Ряд недостатков, связанных с отсутствием адресной доставки и повышенной цитотоксичностью, преодолевается добавлением в состав комплексов вспомогательных молекул. Примером последних служит хондроитинсульфат (далее ХС).
Цель данной работы — оценка влияния ХС на трансфекционные свойства комплексов ДНК-ПЭИ при разных условиях их приготовления и протоколах трансфекции.
Материал и методы. Комплексы готовили в растворах с высокой и низкой ионной силой. Трансфекцию клеток С26 проводили согласно двум протоколам, различающимся по наличию в среде сыворотки. Основными параметрами оценки эффективности трансфекции выступали доля трансфицированных клеток, уровень экспрессии трансгена и выживаемость клеток. Результаты. У двухкомпонентных комплексов ДНК-ПЭИ, приготовленных в условиях низкой или высокой ионной силы, при использовании разных протоколов трансфекции разница в доле трансфицированных клеток достигала 10 раз. Добавление ХС улучшало данный показатель эффективности трансфекции до 6,5 раза, при этом разница по этому показателю у трехкомпонентных комплексов сокращалась до 2,5 раза. Изменение доли ХС в составе комплексов незначительно сказывалось на их трансфекционных свойствах. В случае комплексов, приготовленных в растворах с высокой ионной силой, был также важен порядок добавления ХС. Наилучшие показатели эффективности трансфекции были достигнуты у трехкомпонентных комплексов, приготовленных в растворах с низкой ионной силой, при использовании бессывороточного протокола, при этом данные показатели были сопоставимы с данными для Липофектамина 2000.
Заключение. Добавление хондроитинсульфата улучшает трансфекционные свойства комплексов ДНК-ПЭИ и делает их менее зависимыми от способов приготовления и трансфекции.
Ключевые слова: полиэтиленимин, хондроитинсульфат, трансфекция, сыворотка, ионная сила раствора, генная терапия, полиплекс, носитель.
ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРАХ:
Буланенкова С.С. — e-mail: sun-lioness@mail.ru; https://orcid.org/0000-0001-5304-4590 Снежков Е.В. — e-mail: cell6370@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0001-8421-9728 Потапов В.К. — e-mail: vk@ibch.ru
Акопов С.Б. — e-mail: sergeyakopov@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-3000-8025 Свердлов Е.Д. — e-mail: edsverd@gmail.com
АВТОР, ОТВЕТСТВЕННЫЙ ЗА ПЕРЕПИСКУ:
Буланенкова С.С. — e-mail: sun-lioness@mail.ru
КАК ЦИТИРОВАТЬ:
Буланенкова С.С., Снежков Е.В., Потапов В.К., Акопов С.Б., Свердлов Е.Д. Хондроитинсульфат увеличивает эффективность трансфекции клеток комплексами ДНК-ПЭИ. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2019;37(4):178-185. https://doi.org/ molgen201937041178
Chondroitin sulfate increases cell transfection efficiency by DNA-PEI complexes
© S.S. BULANENKOVA, E.V. SNEZHKOV, V.K. POTAPOV, S.B. AKOPOV, E.D. SVERDLOV
Shemyakin—Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry RAS, Moscow, Russia, 117997 Abstract
Introduction. One of the most popular non-viral delivery systems for the gene therapy constructs are the DNA complexes with polyethylenimine (PEI)-based carriers. A number of disadvantages associated with the lack of targeted delivery and increased cytotoxicity are overcome by the addition of auxiliary molecules to the complexes. An example is the chondroitin sulfate (hereinafter CS).
The purpose of this work was to assess the effect of CS on the transfection properties of the DNA-PEI complexes under different conditions of their preparation and transfection protocols.
Methods. All complexes were prepared in solutions with high and low ionic strength. Transfection of C26 cells was performed according to two protocols differing in the presence of serum in the medium. The portion of transfected cells, transgene expression level and cell viability were the main parameters of assessing the transfection efficiency.
Results. In the binary DNA-PEI complexes prepared in different salt conditions, using different transfection protocols, the difference in the portion of transfected cells reached 10 times. Addition of the CS improved this transfection efficiency indicator up
to 6.5 times, while the maximum difference in this indicator for the corresponding ternary complexes was reduced to 2.5 times. Changes in the proportion of CS in the composition of the complexes had little effect on their transfection properties. In the case of the complexes prepared in high ionic strength solutions, the order of CS addition was also important. The best results of transfection efficiency were achieved with ternary complexes prepared in low ionic strength solutions, using a serum-free protocol, while these indicators were comparable with the data for Lipofectamine 2000.
Conclusion. The addition of chondroitin sulfate improves the transfection properties of DNA-PEI complexes and makes them less dependent on the methods of preparation and transfection.
Keywords: polyethyleneimine, chondroitin sulfate, transfection, serum, ionic strength of solution, gene therapy, polyplex, carrier. INFORMATION ABOUT AUTHORS:
Bulanenkova S.S. — e-mail: sun-lioness@mail.ru; https://orcid.org/0000-0001-5304-4590 Snezhkov E.V. — e-mail: cell6370@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0001-8421-9728 Potapov V.K. — e-mail: vk@ibch.ru
Akopov S.B. — e-mail: sergeyakopov@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-3000-8025 Sverdlov E.D. — e-mail: edsverd@gmail.com
CORRESPONDING AUTHOR:
Bulanenkova S.S. — e-mail: sun-lioness@mail.ru
TO CITE THIS ARTICLE:
Bulanenkova SS, Snezhkov EV, Potapov VK, Akopov SB, Sverdlov ED. Chondroitin sulfate increases cell transfection efficiency by DNA-PEI complexes. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya (Molecular Genetics, Microbiology and Virology). 2019;37(4):178-185. (In Russ.). https://doi.org/molgen201937041178
Введение
Противоопухолевая генная терапия предполагает доставку в клетки опухоли или ее окружения терапевтических генов. К генотерапевтическим препаратам предъявляются следующие требования: 1) направленная доставка в целевые клетки; 2) экспрессия трансгена в целевых клетках; 3) безопасность применения и нетоксичность в отношении нецелевых тканей. Различают вирусные [1] и невирусные способы доставки. Среди последних наибольшую популярность приобретают полиплексы — комплексы с носителями на основе катионных полимеров [2], к числу которых относится полиэтиленимин (ПЭИ), обеспечивающий высокую эффективность трансфекции за счет эффекта «протоновой губки» [3, 4]. Однако ПЭИ обладает рядом недостатков — повышенной ци-тотоксичностью частиц [5], их неспецифическим взаимодействием с отрицательно заряженными молекулами [6, 7] и отсутствием направленной доставки [8]. Минимизация побочных эффектов достигается за счет модификации ПЭИ и/или добавления в состав полиплекса молекул, придающих ему заданные свойства. Одной из наиболее популярных модификаций полиплексов является добавление полиэтиленглико-ля (ПЭГ) [9]. Ранее нашими коллегами был разработан блок-сополимер ПЭГ-ПЭИ-ТАТ (ППТ) [10], который был успешно апробирован в нашей лаборатории для доставки в опухоль терапевтической плазмиды [11]. Однако недостатком ППТ является отсутствие таргетного действия, поэтому он применим преимущественно для локального, т.е. внутри-опухолевого введения. Альтернативой ПЭГ могут служить гликозаминогликаны, гиалуроновая кислота (ГК) и хондроитинсульфат (ХС), составляющие ос-
нову внеклеточного матрикса. Трехкомпонентные комплексы ДНК-ПЭИ-ХС/ГК несут поверхностный отрицательный заряд, препятствующий неспецифическому взаимодействию с отрицательно заряженными белками, обладают пониженной цитотоксич-ностью и повышенной трансфекционной эффективностью [12, 14]. Помимо этого, ГК и ХС являются лигандами рецептора CD44 [15], представленного на поверхности ряда солидных опухолей, стволовых раковых клеток [16] и ассоциированных с раком фиб-робластов [17], что делает возможным направленную доставку комплексов к опухолевым клеткам и их ин-тернализацию эффективным рецептор-опосредованным эндоцитозом [18].
Цель данной работы — оценка трансфекционной активности ПЭИ-полиплексов с добавлением ХС и их сопоставление с ПЭИ- и ППТ-комплексами. В работе использовали клетки мышиной карциномы кишечника C26, обладающие повышенной представленностью поверхностного антигена CD44 [19].
Материал и методы
Материалы
В работе были использованы линейный ПЭИ 25 кД («Polysciences, Inc.», США), хондроитин сульфат А («Sigma-Aldrich», США), эмбриональная бычья сыворотка, ростовые среды RPMI-1640 и Opti-MEM I, раствор антибиотиков (пенициллин 100 ед/мл и стрептомицин 100 мкг/мл), 0,05% трипсин-ЭДТА, PBS, Липофектамин 2000 («Thermo Fisher Scientific», США), реагент CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) («Promega», США), блок-сополимер ПЭГ-ПЭИ-ТАТ (ППТ) [10].
ПЭИ растворяли в воде при добавлении 1M HCl до pH 7.0, хондроитин сульфат А растворяли в воде до концентрации 25 мг/мл, полученные растворы фильтровали через 0,22 мкМ фильтры Millex-cr («Mil-lipore», Германия.
Клеточная линия
В работе использовали клетки мышиной карциномы кишечника C26. Клетки культивировали в среде RPMI-1640 c 12,5% эмбриональной бычьей сывороткой (далее ростовая среда) с антибиотиками при 37 °C в атмосфере 5% CO2.
Плазмидная ДНК
Использовали плазмидную ДНК pEGFP-N1 («Clontech», США) и pGL3-BV («Promega», США). Плазмиды нарабатывали в штамме E. coli DH5a и выделяли с использованием набора Maxi Prep Plasmid («Macherey Nagel», Германия).
Приготовление полиплексов ПЭИ-ХС
N/PZ-показатель комплекса представляет собой отношение молей аминов ПЭИ (N) к молям фосфатных групп ДНК (P) и отрицательно заряженных групп ХС. Для расчетов N/P/- за среднюю массу одного заряда ДНК (P) принимали 330 Да, за среднюю массу одного заряда амина (N) — 43 Да, за среднюю массу двух отрицательных зарядов ХС(-) — 486 Да (с учетом одного иона натрия). Реакцию комплексообра-зования проводили при концентрации ДНК 40 нг/ мкл. Заранее подготавливали растворы ДНК, ПЭИ и ХС в воде или PBS нужной концентрации, чтобы при смешивании одного объема раствора ДНК, одного объема раствора ХС (или двух объемов ДНК в случае двухкомпонентных полиплексов) и двух объемов раствора ПЭИ получать комплексы с заданным отношением N/P/-. Для приготовления двухкомпонентных полиплексов к раствору ДНК добавляли раствор ПЭИ, перемешивали на встряхивателе и далее инкубировали 30 мин при комнатной температуре. При приготовлении трехкомпонентных полиплексов замешивание проводили двумя способами: 1) к раствору ДНК добавляли раствор ПЭИ, перемешивали на встряхивателе, добавляли раствор ХС, перемешивали; 2) к раствору ДНК добавляли раствор ХС, перемешивали, добавляли раствор ПЭИ, еще раз перемешивали на встряхивателе. Полученные комплексы инкубировали 30 мин при комнатной температуре.
Приготовление полиплексов ПЭГ-ПЭИ-ТАТ проводили в соответствии с [11], приготовление ли-посом проводили в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя.
Анализ торможения в геле
Приготовленные комплексы анализировали элек-трофоретически в 0,8% агарозном геле с 1xTAE. После прокрашивания геля бромистым этидием (0,1 мкг/мл)
ДНК визуализировали на трансиллюминаторе при длине волны 365 нм. Данные фиксировали с использованием системы гель-документирования G:BoxF3 («Syn-gene», Великобритания) с использованием программного обеспечения, прилагаемого к прибору.
Трансфекция клеток
За день до эксперимента клетки C26 высевали на 24-/96-луночные планшеты с плотностью 1105 клеток в 1 мл/ 1,5104 клеток в 200 мкл ростовой среды на лунку, инкубировали при 37 °C в атмосфере 5% CO2.
Бессывороточный протокол. Сформированные комплексы, содержащие 670/160 нг ДНК, добавляли к 300/50 мкл Opti-MEM, перемешивали, полученную смесь добавляли к клеткам с предварительно удаленной средой, инкубировали 3 ч при 37 °C в атмосфере 5% CO2, после чего заменяли среду на 1 мл/200 мкл свежей ростовой среды, и инкубировали 48/24 ч при 37 °C в атмосфере 5% CO2.
Протокол с сывороткой. Комплексы, содержащие 670 /160 нг ДНК, добавляли к 1 мл/200 мкл свежей ростовой среды, перемешивали, после чего полученную смесь добавляли к клеткам с предварительно удаленной средой, инкубировали 48/24 ч при 37 °C в атмосфере 5% CO2.
Анализ эффективности трансфекции
По окончании инкубации клетки в 24-луночном планшете открепляли от поверхности 0,05% раствором трипсина, промывали PBS и суспендировали осадок в 700 мкл PBS. Суспензию анализировали на проточном цитофлюориметре FACScan («Becton Dickinson», США) с использованием программного обеспечения, прилагаемого к прибору, а также программного обеспечения Win MDI 2.8. Вычисляли долю GFP-позитивных клеток, а также параметр MFI, представляющий собой среднее геометрическое из интенсивностей флуоресценции GFP-позитивных клеток в произвольных единицах измерения.
Анализ выживаемости клеток
По окончании инкубации из 96-луночных планшетов удаляли среду и в каждую лунку добавляли по 100 мкл свежей ростовой среды и 20 мкл реагента MTS, инкубировали 40 мин при 37 °C в атмосфере 5% CO2, после чего измеряли оптическую плотность при длине волны 490 нм на планшетном ридере microplate spectrophotometer Benchmark Plus («Bio-Rad»). В качестве фона использовали 100 мкл ростовой среды. Выживаемость клеток оценивали как отношение оптической плотности для трансфицированных клеток к оптической плотности нетрансфицированных, предварительно вычитая значение для фона.
Статистическая обработка
Эксперименты были поставлены минимум в 3 независимых повторах (далее n). Для данных рассчитыва-
ли среднее и 95% доверительный интервал и проверяли их на нормальность распределения методом Шапиро— Уилка. Сравнение групп проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа и критерия Стьюдента (одновыборочного или двухвыборочного для связанных или независимых выборок) или их непараметрических аналогов. Для поправки на множественность сравнений применяли метод Холма. Значение p менее 0,05 считали статистически значимым. При расчетах использовали программное обеспечение Microsoft Office Excel 2010, R3.5.2.
Результаты и обсуждение
Основные параметры оценки
Для анализа трансфицируемости клеток мы использовали плазмиду pEFGP-N1, содержащую ген репортерного белка GFP.
Оценку эффективности трансфекции клеток C26 проводили по трем критериям. Во-первых, оценивали долю GFP-позитивных клеток, т.е. клеток, в которые попал репортерный ген, относительно общего количества трансфицируемых клеток (далее GFP+). Во-вторых, определяли среднюю интенсивность флуоресценции в трансфицированных клетках. Данный параметр может отражать силу экспрессии репортерного гена и количество копий плазми-ды, попавших в клетку. В-третьих, оценивали выживаемость клеток. Для возможности сравнения эффективности трансфекции разными способами во всех экспериментах к клеткам всегда добавляли равное количество плазмидной ДНК.
В литературе встречаются разные параметры и условия как формирования трансфекционных комплексов, так и трансфекции эукариотических клеток с помощью ПЭИ-полиплексов в зависимости от типа клеток и форм ПЭИ [20]. Для подбора оптималь-
ных условий трансфекции клеток линии С26 мы варьировали следующие параметры:
1) Ионная сила раствора. Известно, что частицы, собранные в разных солевых условиях, различаются по своим трансфицирующим свойствам. Ионная сила раствора влияет на размер образующихся двухком-понентных частиц, способствуя их повышенной агрегации в высокосолевых растворах [20—22]. Поли-плексы готовили в PBS как модели высокосолевого буфера, либо в воде в качестве примера раствора с низкой ионной силой.
2) Протокол трансфекции. Трансфекцию проводили с использованием двух альтернативных протоколов.
Первый состоит в том, что клетки инкубируются непродолжительное время (2—4 ч) с комплексами, добавленными в малом объеме минимальной среды без сыворотки, после чего среда заменяется на ростовую среду с сывороткой. Данный способ обеспечивает повышенную концентрацию ДНК-несущих частиц в среде, что способствует их более эффективному взаимодействию с прикрепленными клетками (далее бессывороточный (БС) протокол).
Согласно второму протоколу полиплекс добавляется в полный объем ростовой среды с сывороткой без последующей замены среды и удаления комплексов. В данном протоколе понижена концентрация трансфекционных частиц, однако, увеличено время инкубации с комплексами (далее протокол с сывороткой (СС)). Сыворотка может оказывать влияние на стабильность и размеры сформированных комплексов в трансфекционной среде [20, 23, 24].
Проверка образования комплексов
В каждой серии экспериментов методом электрофореза в агарозном геле контролировали образование комплексов по их ретардации в лунке. Пример элек-
Рис. 1. Электрофореграмма комплексов плазмидной ДНК pEGFP-N1 c ПЭИ и ХС, сформированных в воде и PBS.
ПЭИ — двухкомпонентный комплекс с отношением N/P 12:1; 4, 8, 12 — трехкомпонентные комплексы с соотношениями N/P/-, равными 12:1:4, 12:1:8 и 12:1:12 соответственно. ППТ — комплекс с ППТ. pEGFP — плазмида без носителя. Нанесено по 200 нг плазмидной ДНК; M — ДНК-маркер 1т.п.н. (СибЭнзим).
Изменение доли GFP+-клеток, средней интенсивности флуоресценции и выживаемости клеток при добавлении ХС при сравнении с двухкомпонентными ПЭИ-полиплексами, приготовленными в тех же условиях
N/P/- ДХП
раствор 12:1:4 12:1:8 12:1:12
Доля GFP+ клеток БС PBS 2,56±0,26 2,72±0,15 2,42±0,05
вода 1,14+0,14 1,09+0,27 1,07+0,16
СС PBS 2,24±0,17 2,64±0,19 2,45±0,14
вода 4,37±1,56 6,27±1,96 6,27±2,73
Средняя интенсив- БС PBS 1,45±0,45 1,33+0,78 1,45+0,66
ность флуоресцен- вода 0,72±0,22 0,79±0,2 0,92+0,38
ции СС PBS 1,59±0,17 1,65±0,62 1,81±0,38
вода 2,57+2,12 2,98+2,85 2,19+2,15
Выживаемость БС PBS 1,03+0,14 0,92+0,15 0,86±0,12
вода 1,33±0,29 1,16+0,2 0,89+0,12
СС PBS 1,02+0,08 0,94+0,12 0,79±0,07
вода 0,97+0,08 0,89+0,16 0,87+0,15
Примечание. БС — бессывороточный протокол; СС — протокол с сывороткой. Увеличение показателя отмечено серым, статистически значимые изменения относительно ПЭИ-полиплексов выделены жирным шрифтом. Приведены среднее ± 95% доверительный интервал (п=3).
трофореграммы приведен на рис. 1. Отсутствие полосы, соответствующей несвязанной ДНК в контрольных образцах, являлось свидетельством того, что вся ДНК связана с ПЭИ. При облучении УФ в лунках также практически отсутствовало свечение ДНК, что означало недоступность ДНК внутри комплекса для бромистого этидия. Во всех экспериментах картина результатов комплексообразования была аналогичной.
Трансфекционные свойства ПЭИ-полиплексов
Для приготовления полиплексов использовали отношение N/P 12:1, как наиболее оптимальное согласно нашим и литературным данным [25—27]. В каждом эксперименте значения, полученные для Ли-пофектамина 2000 при трансфекции по БС протоколу, принимали за 100% (далее ЛФ2000-БС).
ПЭИ-полиплексы проявляли разную трансфекци-онную активность в зависимости от ионной силы раствора и протокола трансфекции (рис. 2). Доля GFP+-клеток для ПЭИ-полиплексов, приготовленных в PBS, была сопоставима для обоих протоколов трансфекции и составляла приблизительно 30% относительно ЛФ2000-БС, при этом средняя интенсивность флуоресценции была в 1,3 раза выше для БС-протокола, а выживаемость — в 1,5 раза выше для СС-протокола.
Значительная разница для двух протоколов наблюдалась в случае комплексов, приготовленных в воде. При использовании СС-протокола доля GFP+-клеток составляла не более 10% относительно ЛФ2000-БС. Напротив, при трансфекции по БС-про-токолу доля GFP+ клеток достигала 95%.
Трансфекционные свойства трехкомпонентных
комплексов ДНК-ПЭИ-ХС
Добавление ХС сходно с гиалуроновой кислотой и может препятствовать агрегации частиц в высоко-
солевых условиях, уменьшать влияние сыворотки [14], а также обеспечивать проникновение комплекса внутрь клетки более эффективным рецептор-опосредованным эндоцитозом [18].
Мы готовили комплексы с соотношениями N/P/-, равными 12:1:4, 12:1:8 и 12:1:12. При приготовлении к ДНК сначала добавляли ХС, а затем ПЭИ (далее такой порядок будет обозначен как ДХП). Согласно литературным данным, такой порядок смешивания является наиболее эффективным для гиалуроновой кислоты [14]. Параллельно готовили комплексы в обратном порядке, т.е. к образованному полиплексу ДНК-ПЭИ добавляли ХС (далее ДПХ).
Эффективность трансфекции оценивали относительно данных для ПЭИ-полиплексов, приготовленных в тех же условиях. Результаты представлены в таблице.
Во всех случаях добавление ХС приводило к увеличению доли GFP+-клеток. Изменение доли ХС в трехкомпонентных комплексах не позволило выявить значимых закономерностей для доли GFP+-клеток и интенсивности флуоресценции. При увеличении количества ХС наблюдалась тенденция к снижению выживаемости клеток.
Формирование трехкомпонентньх комплексов в PBS
Добавление ХС до ПЭИ приводило к увеличению доли GFP+ клеток до 2,7 раза, а интенсивности флуоресценции до 1,8 раза при незначительной вариации выживаемости клеток. При этом добавление ХС обеспечивало сравнимые результаты для БС- и СС-про-токолов, т.е. для работы с двух- или трехкомпонент-ными комплексами, формируемыми в PBS, применимы оба протокола. Для трехкомпонентных комплексов, сформированных в высокосолевых условиях, характерна зависимость эффективности транс-
Рис. 2. Трансфекционные свойства двухкомпонентных комплексов ДНК-ПЭИ.
Комплексы с ПЭИ готовили в PBS (ПЭИ-PBS) и воде (ПЭИ-во-да), «контроль» — ДНК без носителя. БС — бессывороточный протокол; СС — протокол с сывороткой. Данные в каждом эксперименте оценивали в процентах относительно данных по трансфек-ционным свойствам комплексов с Липофектамином 2000 при использовании бессывороточного протокола (ЛФ2000-БС). Приведено среднее ± 95% доверительный интервал (n=7). Сравнение БС- и СС-протоколов для ЛФ2000, а также попарные сравнения 4 опытных групп показаны сплошными (p<0,05, с поправкой на множественность сравнений) или пунктирными (p>0,05) отрезками внизу диаграммы.
фекции от порядка приготовления комплексов. Комплексы, замешанные в порядке ДХП, обеспечивают долю GFP+-клеток минимум в 1,6 раза выше по сравнению с ДПХ для обоих протоколов трансфекции (значение p для двухвыборочного теста для связанных выборок при сравнении ДХП-ДПХ во всех случаях не превышает 0,004, я=4).
Формирование трехкомпонентных комплексов
в воде
Добавление ХС по-разному влияло на свойства по-липлексов в зависимости от протокола трансфекции. Как было показано ранее, ПЭИ-полиплексы, сформированные в воде, при использовании СС-протокола обеспечивали самую низкую долю GFP+-клеток (до 10% от ЛФ2000-БС), добавление ХС приводило к резкому увеличению доли GFP+-клеток и средней интенсивности флуоресценции до 6 и 3 раз соответственно, без существенных изменений в выживаемости клеток. При использовании БС-протокола, напротив, ПЭИ-по-липлексы были сопоставимы с Липофектамином 2000 по доле GFP+-клеток (95% от ЛФ2000-БС), и добавление ХС не приводило к статистически значимому увеличению этого показателя (максимум в 1,2 раза), при этом происходило уменьшение интенсивности флуоресценции (максимум в 1,4 раза) и увеличение выживаемости (максимум в 1,3 раза), которая, однако, снижалась при увеличении доли ХС. Порядок приготовления комплексов в воде не влиял на эффективность трансфекции (разница в пределах 10%).
Для двухкомпонентных комплексов при приготовлении их в растворах с разной ионной силой и/ или использовании разных протоколов трансфекции наблюдался значительный разброс значений в показателях трансфицируемости клеток, например, для доли GFP+-клеток он достигал 10 раз (см. рис. 2). Добавление ХС приводило к уменьшению этих различий (до 2,5 раза для доли GFP+-клеток) (рис. 3). Таким образом, ХС снижает зависимость трансфекци-онной активности полиплексов от ионной силы раствора и способа трансфекции.
Сравнение трехкомпонентных комплексов с ППТ
В случае ППТ показатели эффективности трансфекции были значимо меньше минимум в 1,3 раза при использовании БС-протокола в сравнении с СС-протоколом, т.е. при работе с клетками линии С26 БС-протокол не применим для ППТ-комплек-сов. Напротив, для трехкомпонентных комплексов наилучшие показатели эффективности трансфекции были достигнуты для водных комплексов при использовании БС-протокола. Сравнение наиболее эффективных протоколов для ППТ- и трехкомпонентных комплексов выявило, что показатели выживаемости клеток и средней интенсивности флуоресценции для них сопоставимы, а доля GFP+-клеток выше у трех-компонентного комплекса (рис. 4).
Рис. 3. Трансфекционные свойства трехкомпонентных комплексов ДНК-ХС-ПЭИ (ДХП).
ДХП-PBS — трехкомпонентные комплексы, сформированные в PBS при отношении N/P/-, равном 12:1:8&. ДХП-вода — трехкомпонентные комплексы, сформированные в воде при отношении N/P/-, равном 12:1:4 для БС-протокола и 12:1:8 для СС-протоко-ла; «контроль» — смесь ДНК и ХС. БС-бессывороточный протокол, СС-протокол с сывороткой. Данные в каждом эксперименте оценивали в процентах относительно данных по трансфекцион-ным свойствам комплексов с Липофектамином 2000 при использовании бессывороточного протокола (ЛФ2000-БС). Приведено среднее ± 95% доверительный интервал (n=7). Попарные сравнения 4 опытных групп показаны сплошными (p<0,05, с поправкой на множественность сравнений) или пунктирными (p>0,05) отрезками внизу диаграммы.
1MI
" GFP+ Флуоресценция Выживаемость
Рис. 4. Сравнение трехкомпонентного комплекса, сформированного в воде с показателем N/P/-, равным 12:1:4, при трансфекции по бессывороточному протоколу (ДХП), с ППТ при трансфекции по протоколу с сывороткой.
Данные в каждом эксперименте оценивали в процентах относительно данных по трансфекционным свойствам комплексов с Липофектамином 2000 при использовании бессывороточного протокола (ЛФ2000-БС). Приведено среднее ± 95% доверительный интервал (n=6). * — _р<0,05.
Заключение
Подобранные в данной работе сочетания ДНК, ПЭИ и ХС обеспечивают сравнимые результаты с Липофектамином 2000 и ППТ. При переходе к системам in vivo трехкомпонентные комплексы могут оказаться более перспективными. В частности, они обладают рядом преимуществ по сравнению с ППТ. Во-первых, их приготовление не сопряжено со сложным процессом синтеза блок-сополимера, а может осуществляться уже из готовых охарактеризованных компонентов, количественный состав которых при необходимости оптимизации условий легче варьировать. Во-вторых, ХС является разрешенным к употреблению в медицинских целях препаратом. В-третьих, наличие лиганд-рецепторного взаимодействия между раковыми клетками и носителем делает возможным системное применение трехкомпонентного комплекса. Рассмотренные выше возможности требуют дальнейшей проверки на модельных организмах.
Финансирование работы. Работа выполнена при поддержке гранта КОМФИ №17-00-00190 «Исследование регуляторных элементов специфической экспрессии генов в опухоль-ассоциированных фиброб-ластах и возможности их использования для инженерии искусственных иммунных коактиваторных взаимодействий».
Соблюдение этических стандартов.
Конфликт интересов: Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов исследований.
AMTEPATYPA/REFERENCES
1. Asad AS, Ayala MAM, Gottardo MF, Zuccato C, Javier A, Candia N, et al. Viral gene therapy for breast cancer: progress and challenges. Expert Opin Biol Ther. 2017;17(8):945-959. https://doi.org/10.1080/14712598.2017.1338684
2. Samal SK, Dash M, Vlierberghe S Van, Kaplan DL, Chiellini E, Blitterswi-jk C Van, et al. Cationic polymers and their therapeutic potential. Chem Soc Rev. 2012;41(21):7147-7194. https://doi.org/10.1039/c2cs35094g
3. Boussif O, Lezoualc'h F, Zanta M, Mergny M, Schermant D, Demeneixt B, et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: Polyethylenimine. Proc Natl Acad Sci USA. 1995;92(16): 7297-7301.
https://doi.org/10.1073/pnas.92.16.7297
4. Kircheis R, Wightman L, Wagner E. Design and gene delivery activity of modified polyethylenimines. Adv Drug Deliv Rev. 2001;53(3):341-358. https://doi.org/10.1016/S0169-409X(01)00202-2
5. Hall A, Lächelt U, Bartek J, Wagner E, Moghimi SM. Polyplex Evolution : Understanding Biology, Optimizing Performance. Mol Ther. 2017;25(7): 1-15.
https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2017.01.024
6. Ruponen M, Ylä-Herttuala S, Urtti A. Interactions of polymeric and liposomal gene delivery systems with extracellular glycosaminoglycans: Physi-cochemical and transfection studies. Biochim Biophys Acta — Biomembr. 1999;1415(2):331-341.
https://doi.org/10.1016/S0005-2736(98)00199-0
7. Plank C, Mechtler K, Szoka FJ, Wagner E. Activation of the complement system by synthetic DNA complexes: a potential barrier for intravenous gene delivery. Hum Gene Ther. 1996;7(12):1437-1446. https://doi.org/10.1089/hum. 1996.7.12-1437
8. Coll J, Chollet P, Brambilla E, Desplanques D, Behr J, Favrot M. In vivo Delivery to Tumors of DNA Complexed with Linear Polyethylenimine. Hum Gene Ther. 1999;10(10):1659-1666. https://doi.org/10.1089/10430349950017662
9. Ogris M, Brunner S, Schu S, Kircheis R, Wagner E. PEGylated DNA/trans-ferrin — PEI complexes : reduced interaction with blood components, extended circulation in blood and potential for systemic gene delivery. Gene Ther. 1999;6(4):595-605. https://doi.org/10.1038/sj.gt.3300900
10. Ulasov AV, Khramtsov YV, Trusov GA, Rosenkranz AA, Sverdlov ED, Sobolev AS. Properties of PEI-based polyplex nanoparticles that correlate with their transfection efficacy. Mol Ther. 2011;19(1):103-112. https://doi.org/10.1038/mt.2010.233
11. Alekseenko IV, Snezhkov EV, Chernov IP, Pleshkan VV, Potapov VK, Sass AV, et al. Therapeutic properties of a vector carrying the HSV thymidine kinase and GM-CSF genes and delivered as a complex with a cationic copolymer. J TranslMed. 2015;13(1):1-16. https://doi.org/10.1186/s12967-015-0433-0
12. Pathak A, Kumar P, Chuttani K, Jain S, Mishra AK, Vyas SP, et al. Gene expression, biodistribution, and pharmacoscintigraphic evaluation of chon-droitin sulfate-PEI nanoconstructs mediated tumor gene therapy. ACS Nano. 2009;3(6):1493-1505. https://doi.org/10.1021/nn900044f
13. Kurosaki T, Kitahara T, Kawakami S, Nishida K, Nakamura J, Teshima M, et al. The development of a gene vector electrostatically assembled with a polysaccharide capsule. Biomaterials. 2009;30(26):4427-4434. https://doi.org/10.1016Xj.biomaterials.2009.04.041
14. Ito T, Iida-Tanaka N, Koyama Y. Efficient in vivo gene transfection by stable DNA/PEI complexes coated by hyaluronic acid. J Drug Target. 2008;16(4):276-281.
https://doi.org/10.1080/10611860801900728
15. Underhill C. CD44 : The hyaluronan receptor. J Cell Sci. 1992;103:293-238.
16. Chen C, Zhao S, Karnad A, Freeman JW. The biology and role of CD44 in cancer progression : therapeutic implications. JHematol Oncol. 2018;11(1):1-23.
https://doi.org/10.1186/s13045-018-0605-5
17. Kinugasa Y, Matsui T, Takakura N. CD44 expressed on cancer-associated fibroblasts is a functional molecule supporting the stemness and drug resistance of malignant cancer cells in the tumor microenvironment. Stem Cells. 2014;32(1):145-156.
https://doi.org/10.1002/stem.1556
18. Lo YL, Sung KH, Chiu CC, Wang LF. Chemically conjugating polyethylenimine with chondroitin sulfate to promote CD44-mediated endocytosis for gene delivery. Mol Pharm. 2013;10(2):664-676. https://doi.org/10.1021/mp300432s
19. Dubey RD, Klippstein R, Wang JT-W, Hodgins N, Mei K-C, Sosabowski J, et al. Novel Hyaluronic Acid Conjugates for Dual Nuclear Imaging and Therapy in CD44-Expressing Tumors in Mice In vivo. Nanotheranostics. 2017;1(1):59-79. https://doi.org/10.7150/ntno.17896
20. Guillem VM, Aliño SF. Transfection pathways of nonspecific and targeted PEI-polyplexes. Gene Ther Mol Biol. 2004;8:369-384.
21. Ogris M, Steinlein P, Kursa M, Mechtler K, Kircheis R, Wagner E. The size of DNA/transferrin-PEI complexes is an important factor for gene expression in cultured cells. Gene Ther. 1998;5(10):1425-1433. https://doi.org/10.1038/sj.gt.3300745
22. Wightman L, Kircheis R, Carotta S, Ruzicka R, Kursa M, Wagner E. Different behavior of branched and linear polyethylenimine for gene delivery in vitro and in vivo. J Gene Med. 2001;3(4):362-372. https://doi.org/10.1002/jgm. 187
23. Song H, Wang G, He B, Li L, Li C, Lai Y, et al. Cationic lipid-coated PEI/ DNA polyplexes with improved efficiency and reduced cytotoxicity for gene delivery into mesenchymal stem cells. Int JNanomedicine. 2012;7:4637-4648. https://doi.org/10.2147/IJN.S33923
24. Guo W, Lee RJ. Efficient gene delivery via non-covalent complexes of folic acid and polyethylenimine. J Control Release. 2001;77:131-138. https://doi. org/10.1016/S0168-3659(01)00456-4
25. Cheraghi R, Alipour M, Nazari M, Hosseinkhani S. Optimization of conditions for gene delivery system based on PEI. Nanomedicine J. 2017;4(1):8-16. https://doi.org/10.22038/nmj.2017.8047
26. Koyama Y, Sugiura K, Yoshihara C, Inaba T, Ito T. Highly effective non-viral antitumor gene therapy system comprised of biocompatible small plas-mid complex particles consisting of pDNA, anionic polysaccharide, and fully deprotected linear polyethylenimine. Pharmaceutics. 2015;7(3):152-164. https://doi.org/10.3390/pharmaceutics7030152
27. Breunig M, Lungwitz U, Liebl R, Goepferich A. Breaking up the correlation between efficacy and toxicity for nonviral gene delivery. Proc Natl Acad Sci USA. 2007;104(36):14454-14459. https://doi.org/10.1073/pnas.0703882104
Поступила 15.05.19 Received 15.05.19 Принята в печать 02.06.19 Accepted 02.06.19
