CC BY
347
Перенос рекомбинантных нуклеиновых кислот в клетки (трансфекция) с помощью гистонов и других ядерных белков
В.В. Соловьева1, Н.В. Кудряшова 1, А.А. Ризванов 1 23
1 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань
2 Казанский государственный медицинский университет, Казань
3 ГУЗ «Республиканская клиническая больница» МЗ РТ, Казань
Transfer of recombinant nucleic acids into cells (transfection) by means of histones and other nuclear proteins
V.V. Solovieva 1, N.V. Kudryashova 1, A.A. Rizvanov1-2-3
1 Kazan (Volga Region) Federal university, Kazan
2 Kazan State Medical university, Kazan
3 Republican Clinical Hospital of the Health Ministry of the Republic of Tatarstan, Kazan
В последнее время перспективным подходом в невирусном переносе генов стала доставка генов посредством белков (protein/peptide-mediated gene delivery). В предыдущих исследованиях было показано, что гистон-ные и другие ядерные белки могут служить эффективными векторами для переноса генов в клетки. Трансфекция эукариотических клеток комплексами нуклеиновых кислот с гистонами (гистонофекция) эффективно проходит с различными представителями семейства гистонных белков. Наличие ДНК-связывающих доменов и специфических сигнальных последовательностей ядерной локализации позволяет применять гистоны (Н1/Н5, Н2А, Н2В, Н3, Н4) и другие ядерные белки (такие, как белки семейства HMG и гистоноподобные прокариотические белки) для переноса рекомбинантных генов. Положительный заряд молекул гистонных белков способствует электростатическому взаимодействию с отрицательно заряженными молекулами нуклеиновых кислот и нейтрализации зарядов, что позволяет комплексам преодолевать отрицательно заряженную клеточную мембрану. Таким образом, гистонофекция является перспективным методом для невирусного переноса рекомбинантных нуклеиновых кислот при генной терапии.
Ключевые слова: ядерные белки, гистонные белки, гистоноинфекция, трансфекция.
Разработка эффективных систем доставки генов — одна из основных задач генной терапии. Технологии доставки генов значительно продвинулись в последние годы. Однако возникают проблемы доставки генов, связанные с низкой эффективностью, высокой стоимостью и трудоёмкостью подготовки векторов. Остаются нерешенными вопросы токсичности, иммуногенности, онкогенности векторов и кратковременности экспрессии трансгенов.
Системы доставки генов могут быть условно разделены на две группы: вирусные и невирусные. Вирусные системы основаны на применении рекомбинантных вирусов (ретровирусы, аденовирусы, адено-ассоциированные вирусы и др.), полученных с помощью генной инженерии и оптимизированных для переноса генов [1—2]. Основные преимущества вирусных систем — высокая эффективность генетической модификации и длительность экспрессии трансгенов. Однако клиническое применение вирусных векторов ограничено их иммуногенностью и онкогенностью. В последнее время большие усилия
e-mail: [email protected]
Currently a protein/peptide-mediated gene delivery has been considered a promising approach in non-viral gene transfer. The previous investigations have shown that histones and other nuclear proteins might be effective vectors for gene transfer into cells. Transfection of eukaryotic cells by nucleic acid and histone complexes (histonefection) effectively occurs with various histone proteins. The presence of DNA-binding domains and specific signal sequences of nuclear location allows to use histones (Н1/Н5, Н2А, Н2В, Н3, Н4) and other nuclear proteins (such as HMG family proteins and histone-like prokaryotic proteins) for recombinant genes transfer. The positive charge of histone protein molecules enables electrostatic interaction with negatively charged molecules of nucleic acids and charge neutralization that facilitates the complexes penetration through a negatively charged cell membrane. Thus, histonefection is a promising method for non-viral transfer of recombinant nucleic acids in gene therapy.
Key words: nuclear proteins, histone proteins,
histonoinfection, transfection.
были сосредоточены на разработке систем невирусной доставки генов: физические (электропорация, соникация, генные пушки и т.д.), химические (липо-плексы, полиплексы, катионные наночастицы и т.д.), «голые» генетические конструкции (плазмиды, олигонуклеотиды и т.д.) [3].
Одним из направлений развития полиплексных систем доставки нуклеиновых кислот (трансфекции) — применение катионных пептидов и белков в качестве генетических векторов [4—9]. К преимуществам использования пептидов и белков для доставки генов относят: простоту производства и использования рекомбинантных белков, высокую чистоту и однородность, способность направленного транспорта полиплексов (комплексы ДНК-белок) в определённые типы клеток за счёт специфичных лиганд-рецепторных взаимодействий, а также отсутствие ограничений на размер и тип доставляемой в клетки нуклеиновой кислоты.
Известно, что ядерные белки, такие как гистоны, конденсируют ДНК и могут быть использованы для
трансфекции клеток [5, 10—11]. Гистоны — положительно заряженные белки, которые взаимодействуют с ДНК путём электростатических взаимодействий, являются основным компонентом хроматина. Существует два различных типа гистонов: линкерные (Н1/Н5) и нуклеосомные (H2A, H2B, H3, H4) [1213]. Трансляция гистонов происходит в цитоплазме клеток, после чего гистонные белки транспортируются в ядро. У гистонов есть специфические сигнальные последовательности - сигналы ядерной локализации (NLS, от англ. nuclear localization signal), которые обеспечивают их проникновение в ядро [14]. Наличие NLS и значительный положительный заряд позволяет гистонам эффективно конденсировать и переносить рекомбинантные нуклеиновые кислоты.
Перенос рекомбинантных нуклеиновых кислот
с помощью гистонов и других ядерных
белков
Существуют различные методы невирусной доставки рекомбинантных генов для трансфекции культур клеток [2, 15]. Выбор системы доставки зависит от типа клетки и вида доставляемой биомолекулы (ДНК, РНК, белки). Некоторые типы клеток, в том числе широко используемые трансформированные «бессмертные» клеточные линии, могут быть трансфицированы многими коммерчески доступными трансфицирующими агентами, такими как Lipofectin® и Lipofectamine®. Другие типы клеток, например, первичные культуры клеток, трудно трансфицировать стандартными методами. Гистонные белки обладают естественной способностью связываться с ДНК, что делает их потенциальными векторами для био-безопасной и эффективной доставки биомолекул в клетки. Ещё в 1965 г. было показано, что гистоны и катионные полиамины, такие как поли^-лизин, про-тамин и поли^-орнитин, стимулируют поглощение альбумина опухолевыми клетками in vitro [16-18]. С развитием биомедицины способность гистонов переносить экзогенные белки и нуклеиновые кислоты в клетки стали рассматривать и в контексте использования в генной терапии.
Трансфекция с помощью линкерного гистона H1
Большинство невирусных методов доставки нуклеиновых кислот эффективны для трансформированных «бессмертных» культур клеток, однако недостаточно эффективны для трансфекции первичных культур. В связи с этим, остро встаёт вопрос поиска новых методов невирусной трансфекции различных культур клеток. Гистоны могут выступать доставщиками нуклеиновых кислот в первичные клеточные линии как самостоятельно, так и в комбинации с другими трансфекционными агентами.
Известно, что гистон H1 может использоваться для доставки ДНК во многие клеточные линии [1932]. Показана эффективная трансфекция гистоном H1 кардиомиоцитов, эндотелиальных клеток человека и первичных клеток крысы [21, 25, 27]. Гистон H1, выделенный из ядерного экстракта клеток тимуса телёнка, эффективен для трансфекции культур клеток in vitro, особенно в присутствии кальция хлорида и хлорохина [29]. Необходимость присутствия ионов кальция для доставки генов с помощью гистона H1 также показана и в других работах [19, 30]. Значительно повышало эффективность трансфекции использование гистона H1 в комбинации с
DOSPER® (от англ. 1,3-Di-Oleoyloxy-2-(6-Carboxy-spermyl)-propylamid) — липосомным трансфекцион-ным агентом для трансфекции первичных культур клеток [25]. V. Budker с соавт. (1997) показали, что гистон Н1 повышает эффективность трансфекции систем на основе амфифильных полиаминов [20]. Другие авторы показали, что гистон H1 может переносить ДНК, мРНК и малые интерферирующие РНК (миРНК) в трансформированные и первичные культуры клеток. Эффективность трансфекции была сопоставима или даже превосходила системы на основе липосом [31]. Для определения функциональных доменов гистона H1 человека, отвечающих за его основные функции, I. Puebla с соавт. (2003) с помощью методов генной инженерии создали различные усечённые варианты белка и исследовали их на способность конденсировать ДНК и трансфицировать трансформированные и первичные культуры клеток [31]. Фрагмент H1.4F, содержащий полный С-конец и фрагмент средней части гистона Н1 (387 нуклеотидов 3'-концевой последовательности кДНК гистона Н1 человека), показал наибольшую эффективность трансфекции. Это подтверждают другие исследования, в которых показано, что С-концевая часть гистона Н1 играет важную роль в конденсации ДНК [32]. Полипептид H1.4F способен доставлять как ДНК, так и РНК, что важно для создания векторной системы подавления экспрессии генов посредством механизма РНК-интерференции. Показано, что полипептид H1.4F менее токсичен для клеточных культур по сравнению с липосомными трансфек-ционными агентами [31].
H.J. Jung с соавт. (2008) показали, что рекомбинантный С-концевой пептид (H1C, 61 аминокислота) гистона H1 из золотой рыбки Carassius auratus способен конденсировать ДНК и защищать её от деградации. Полипептид H1C способен эффективно доставлять ДНК в клетки млекопитающих в отсутствии ионов кальция. При трансфекции клеточных линий (293Т человека и NIH/3T3 мыши) полипептидом H1C экспрессия репортерных генов lacz и egfp была в несколько раз выше, чем при трансфекции агентом Lipofectamine® [33].
Трансфекция с помощью нуклеосомных
гистонов H2A, H2B, H3 и H4
D. Balicki с соавт. (1997) разработали метод генного переноса посредством гистона Н2А. Они показали, что в сравнении с другими гистонами H2A наиболее эффективен для трансфекции различных культур клеток [10]. N-концевой пептид гистона H2A, состоящий из 37 аминокислотных остатков, способен трансфицировать клетки in vitro. Авторы предположили, что Н2А конденсирует ДНК, образуя незаряженный комплекс, который проникает через плазматическую мембрану и доставляет ДНК в ядро [11]. Гистоны H1 и Н2А, видимо, трансфицируют клетки с помощью различных механизмов, так как удаление С-концевого фрагмента гистона Н2А незначительно сказывается на его трансфекцинной активности [11], а C-концевой фрагмент гистона H1 играет важную роль в Ж-опосредованной трансфекции. Мутации или удаление N-концевой части гистона Н2А приводят к потере его трансфекционной активности [11].
H. Liu и I. Soderhall (2007) использовали гистон Н2А для доставки двуцепочечной РНК (дцРНК) в
клетки кроветворной ткани американского сигнального рака, Pacifastacus leniusculus. Эффективность трансфекции гистона Н2А была выше, чем у транс-фекционного агента Effectene® и липосомных систем доставки нуклеиновых кислот. Важно отметить, что высокая эффективность гистона Н2А сочетается с низкой токсичностью и специфичностью для трансфицированных клеток, выделенных из кроветворной ткани Pacifastacus leniusculus [34].
Было показано, что реконструированный хроматин в комплексе с гистонными белками H2B, оптимизированными для ядерной доставки, может использоваться в качестве эффективного средства доставки рекомбинантных нуклеиновых кислот в ядро клеток млекопитающих (клеточная линия MCF7), в результате чего повышается уровень экспрессии трансгена (более чем в 6 раз больше по сравнению с транс-фекционным реагентом Lipofectamine®) [35].
K.M. Wagstaff с соавт. (2007) показали, что гистон H2B эффективно доставляет ДНК посредством гистон-опосредованной трансдукции (HMT, от англ. Histone-Mediated Transduction) в различные клеточные линии. Эффективность трансфекции гистона Н2В в 2,5 раза выше, чем у коммерческих липосомных агентов. Эффективность трансфекции увеличивалась при использовании димера гистонов Н2А и H2B, содержащего два домена белковой трансдукции (PTD, от англ. protein transduction domains) [36].
В работах I. Demirhan и O. Hasselmayer с соавт. (1998, 2001) исследована эффективность комбинирования гистонофекции и липофекции для доставки генов в клетки, найдены оптимальные соотношения ДНК-липидов-гистонов [28, 37]. Авторы показали, что наибольшая эффективность генной трансфекции наблюдается с гистонами Н3 и Н4, однако в отличие от результатов, полученных D. Balicki с соавт., гистон Н2А не способен к трансфекции клеток. Ком-плексообразование имеет решающее значение для трансфекции, и различие между результатами этих двух групп возможно из-за различных типов линий клеток-мишеней, условий трансфекции, источника и чистоты препаратов гистонных белков [10]. Интересно, что перенос гена, опосредованный гистонами H3 и H4 [28], не зависит от дополнительных кофакторов, таких как кальция хлорид и хлорохин, которые играли важную роль в экспериментах с гистоном Н2А [10-11].
Для экспрессии трансгена важна внутриядерная локализация плазмидной ДНК. В работе H. Kamiya с соавт. (2010) гистонные белки использовались для доставки плазмидной ДНК (pYK-CMV-luc) в клетки линии HeLa. Однако авторы показали, что комплексы гистона H3 с плазмидной ДНК обладали более низкой транскрипционной активностью. Это, по-видимому, связано с высокой стабильностью нуклеопротеинового комплекса, что предотвращало взаимодействие плазмидной ДНК с транскрипционным аппаратом клетки [38].
Трансфекция с помощью гистоноподобных белков
и пептидов неэукариотического происхождения
Гистоноподобные белки и пептиды неэукариотического происхождения также могут служить векторами для трансфекции. Показано, что гистонопо-добный белок архебактерий HPhA (от англ. archaeal histone-like protein-based) из Pyrococcus horikoshii штамма OT3 может образовывать стабильные неко-
валентные комплексы с нуклеиновыми кислотами и улучшает их доставку в различные типы клеточных культур [39]. Эффективность трансфекции при этом зависит от соотношения HPhA к ДНК, времени инкубации и добавления кальция хлорида. Важно, что цитотоксичность HPhA ниже, чем у липосомных транс-фекционных агентов. В других исследованиях авторы использовали белок HPhA в качестве вектора для доставки гена p53 (опухолевый супрессор). Уровень экспрессии и активности гена p53 оценивали in vitro и in vivo. Было показано, что HPhA, по сравнению с трансфекционным агентом Lipofectamine®, повышает эффективность доставки гена р53 и его противоопухолевую активность [40]. Белок HPhA способен защищать нуклеиновые кислоты от действия нуклеаз, что важно для сохранения функциональной активности трансгенов [39].
Другие исследования показали, что гистонопо-добный белок TmHU (от англ. heat unstable) из термофильных бактерий Thermotoga maritima может также выступать вектором для трансфекции ДНК в различные эукариотические клетки. Белок HU чрезвычайно стабилен, и его можно выделять из рекомбинантного штамма Escherichia coli. Белок TmHU может повышать эффективность других методов трансфекции, например липофекции, а также защищать ДНК от деградации и термической денатурации [41]. Как и гистоны, TmHU содержит NLS, которые обеспечивают его проникновение в ядро эукариотических клеток [41]. Также показано, что предварительная конденсация ДНК гистоноподобным белком HU из микоплазмы Acholeplasma laidlawii в 2—4 раза увеличивает эффективность трансфекции эукариотических клеток (клеточная линия HEK293) [42]. Эффективность трансфекции оценивали с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии по интенсивности флуоресценции маркерного белка GFP в клетках.
Трансфекция с помощью негистонных
ядерных белков
Описано применение белков группы высокой подвижности HMGs (от англ. high-mobility group) в качестве невирусных генных векторов in vitro и in vivo [43—49]. HMGs — группа ядерных хромосомных белков, участвующих в «упаковке» хроматина и процессах транскрипции, репликации, рекомбинации и репарации [50]. Эти белки описаны в начале 1970-х годов [51] как группа негистоновых белков. HMGs подразделяются на 3 группы: HMGB (HMG-1/2), HMGN (HMG-14/-17) и HMGA (HMG-I/Y/ C). В 1988 г. M. Bottger с соавт. обнаружили способность белка HMG1 к конденсации ДНК и её доставке в L-клетки мыши [47]. Эффективность трансфекции была выше, чем при использовании кальций фосфатного метода. Y. Kaneda с соавт. (1989, 1991) разработали векторную систему на основе везикулярных комплексов, полученных инкубацией ДНК-содержащих липосом с вирусом HVJ (вирус Сендая) и мембраной эритроцитов, содержащей белок HMG1 [43, 44]. Авторы показали, что эффективность трансфекции комплексами, содержащими HMG1, в 10 раз выше, чем комплексами с бычьим сывороточным альбумином (БСА). S.V. Zaitsev с соавт. (1997) показали трансфекционную активность белка HMG17 в различных клеточных линиях [27]. Для эффективной трансфекции необходимо присут-
ствие в среде ионов кальция в низкой концентрации. Эффективность трансфекции с помощью белка HMG17 была ниже, чем с использованием гистона Н1 и трансфекционного агента Lipofectamine®.
A.R. Mistry с соавт. (1997) показали способность белка HMG1 к доставке ДНК в клетки линии Caco-2 [49]. Эффективность трансфекции HMG1 была выше, чем у кальций фосфатного метода, однако ниже, чем у трансфекционного агента Lipofectin®. Важно, что комплексы белка HMG1^HK не токсичны для культивируемых клеток даже при высоких концентрациях.
Безопасность доставки рекомбинантных
нуклеиновых кислот с помощью гистонных
и других ядерных белков
Одно из основных препятствий использования невирусных систем доставки генов — их токсичность для клеток. Проводятся исследования токсичности невирусных трансфекционных агентов in vitro и in vivo [15, 52—53], однако точный механизм, лежащий в основе их токсичности, по-прежнему не найден. Было показано, что системы доставки ДНК, основанные на использовании катионных липидов, влияют на морфологию и жизнеспособность клеток. Микроскопическое исследование клеток, обработанных трансфекционными агентами на основе липосом, такими как Lipofectin® или Lipofectamine®, показало морфологические изменения, разрушения клеток и снижение их жизнеспособности [54—56].
Важная особенность гистонных белков — их низкая цитотоксичность. I. Puebla с соавт. показали, что гистон H1 менее токсичен, чем трансфекционные агенты на основе липосом [31]. Другие авторы также показали отсутствие токсичности гистона H1 и гистоноподобных белков [20, 27, 39].
Одним из недостатков использования гистонов в качестве векторов для генной терапии — способность вызывать иммунный ответ. Антитела к гистонам найдены при заболевании Либмана — Сакса (системная красная волчанка, СКВ) [57]. Показано, что гистоны H1 и H2B могут служить сильными иммуногенами при СКВ [58]. Также показано, что гистоны индуцируют иммунный ответ при введении их животным. Например, введение гистонов Н2А, H2B, H3 и H4 представителей рода Leishmania (паразитические протозоа, возбудители лейшманиоза) мышам вызывает специфический Th1 (клеточный) иммунный ответ и подавление Th2 (гуморального) иммунного ответа [59]. Таким образом, доставка генов с помощью гистонов должна применяться в четко определенных
ситуациях, при которых возможно использование полезных свойств гистонов и ограничиваются их побочные эффекты.
Другой подход к минимизации иммуногенности гистонов - ограничение размера гистонных полипептидов, не затрагивающее их трансфекционного потенциала. D. Balicki с соавт. (2002) показали, что 37-мер N-концевой пептид гистона Н2А может эффективно трансфицировать клетки нейробласто-мы мыши NXS2, не вызывая токсического эффекта [11]. I. Puebla с соавт. для трансфекции использовали усечённые фрагменты гистона H1 различных размеров [31]. С-концевой фрагмент, составляющий одну треть от молекулы гистона H1, трансфицировал различные клетки млекопитающих с минимальной токсичностью. Предположительно, короткие пептиды имеют низкую токсичность и низкую иммуноген-ность. L. Collins с соавт. (2001, 2003) показали, что синтетический пептид полилизин-молоссин (от англ. polylysine-molossin), состоящий из 31 аминокислоты, является эффективным вектором для доставки генов [60, 61]. Исследования in vivo показали его низкую токсичность и иммуногенность.
Еще одно ограничение использования гистонов для доставки генов - быстрое выведение их из крови, что приводит к снижению их эффективности. Для повышения стабильности пептидов и белков их используют в сочетании с химическими полимерами и наночастицами. V.P. Torchilin и A.N. Lukyanov (2003) описали ряд таких полимеров и наночастиц, их характеристики и использование в доклинических и клинических исследованиях [62].
Гистоноподобные и негистонные ядерные белки практически не токсичны для различных клеточных линий [27, 39, 41, 43-44]. Было показано, что ги-стоноподобный белок HPhA из Pyrococcus horikoshii в 10 раз менее токсичен для клеток линий NIH 3T3 и HL-7702 по сравнению с трансфекционным агентом Lipofectamine®, который даже в низких концентрациях приводил к гибели клеток [39]. Белок TmHU также показал в 10 раз меньшую токсичность на клетках линии 293T по сравнению с трансфекционным агентом Lipofectamine® [41]. Везикулярные комплексы, содержащие белок HMG1, эффективно трансфицируют клетки линии LLC-MKz (клетки почки обезьяны) без токсического эффекта для них [43, 44]. Показано, что белок HMG17 менее токсичен для различных клеточных линий в отличие от липосомных агентов [27].
Обобщенные данные по применению гистонных, гистоноподобных и негистонных белков в качестве трансфекционных векторов представлены в таблице.
Применение гистонных, гистоноподобных и негистонных белков для доставки рекомбинантных нуклеиновых кислот в клетки
Гистонные и негистонные семейства Белок Клеточная модель Кофактор Эффективность трансфекции Статья
Белки группы высокой подвижности HMGs HMG1 HMG1 LLC-MKz (клетки почки обезьяны) in vivo (почка) Без кофактора Без кофактора Эффективность трансфекции в 10 раз выше, чем у БСА Трансфекция не эффективна [43-44] [45]
Продолжение таблицы
Гистонные и негистонные семейства Белок Клеточная модель Кофактор Эффективность трансфекции Статья
HMG1 in vivo (сердце) Без кофактора Трансфекция неэффективна [46]
HMG1 L-клетки мыши (фибробласты) Без кофактора Эффективность трансфекции аналогична или выше, чем у кальций фосфатного метода [47]
HMG17 NIH 3T3 (мышиные фибробласты), HepG2 (карцинома печени человека), Huh7 (гепатокарцинома человека), CT26 (опухоль толстого кишечника мышей), HUVEC (клетки эпителия пуповинной вены человека), ECV304(эндотелиальные клетки человека) Са2+ Эффективность трансфекции ниже, чем у Н1 или Lipofectamine® [27]
HMG1-2 MCF-7 (карцинома молочной железы человека), опухолевые клетки «голых» мышей Без кофактора Трансфекция неэффективна [48]
HMG1 Caco-2 (карцинома кишечника человека) Без кофактора Эффективность трансфекции выше, чем у кальций фосфатного метода, однако ниже, чем у Lipofectin® [49]
Линкерные гистоны H1 Кардиомиоциты Без кофактора Эффективность трансфекции выше, чем уООБРЕЯ® [25]
H1 U20S (клетки остеосаркомы человека), SKOV3 (аденокарцинома яичников человека), BEL-7402 (карцинома печени) Без кофактора Трансфекция неэффективна [45]
H1 NIH 3T3 (мышиные фибробласты) Са2+ Трансфекция неэффективна [26]
H1 NIH 3T3 (мышиные фибробласты), HepG2 (карцинома печени человека), Huh7 (гепатокарцинома человека), CT26 (опухоль толстого кишечника мышей), HUVEC (клетки эпителия пуповинной вены человека), ECV304 (эндотелиальные клетки человека) Са2+ Эффективность трансфекции в 2 раза выше, чем у кальций фосфатного метода [19]
H1 HepG2(карцинома печени человека) Са2+ и хлорохин Эффективность трансфекции выше, чем у Lipofectin®, Lipofectamine®, поли^-лизина, Transfectam® и Рі^єпє® [23]
H1 HeLa (раковые клетки шейки матки человека), NIH 3T3 (мышиные фибробласты), COS7 (почечные клетки африканской зеленой мартышки) Без кофактора Н1 повышает эффективность трансфекции амфифильных полиаминов [20]
Продолжение таблицы
Гистонные и негистонные семейства Белок Клеточная модель Кофактор Эффективность трансфекции Статья
H1 HeLa (раковые клетки шейки матки человека), VERO (эпителиальные клетки почек зеленой африканской мартышки), K562 (клетки хронической миелоидной лейкемии), Caco-2(карцинома кишечника человека), HFF (фибробласты), ND7 (клеточная линия нейронов), 293T (фибробласты), COS7 (почечные клетки африканской зеленой мартышки), BHK21 (клетки почки новорожденного сирийского хомячка), Sua 4.0 (клетки личинок Anopheles gambiae), A594 (альвеолярные эпителиальные клетки), HT1080 (фибросаркома человека) Ca2+ Эффективность трансфекции в 2 раза выше, чем у Ырс^е^атте® [31]
H1 Клетки Джуркат Без кофактора Трансфекция неэффективна [28]
H1 Нейробластома, COS7 (почечные клетки африканской зеленой мартышки), CHO (клетки яичников китайских хомячков) Без кофактора Трансфекция неэффективна [10]
H1 пептид Клетки карциномы легкого Льюис Без кофактора Эффективность трансфекции выше, чем улипидов [6]
Галактози- лированный H1 HepG2 (карцинома печени человека) Ca2+ и хлорохин Трансфекция неэффективна [22, 47]
H1 С-концевой пептид NIH 3T3 (мышиные фибробласты), COS7 (почечные клетки африканской зеленой мартышки), 293T (фибробласты) Ca2+ и хлорохин Эффективность трансфекции в 20 раз выше, чем у L¡pсfect¡n® [21]
H1 С-концевой пептид из Carassius auratus 293Т (фибробласты), NIH 3T3 (мышиные фибробласты) Без кофактора Эффективность трансфекции выше, чем у L¡pofectam¡ne® [33]
Нуклеосомные H2A NXS2 (клетки мышиной Без Эффективная [11]
гистоны пептиды нейробластомы) кофактора трансфекция только с Н2А Ы-концевым пептидом
H2A Клетки Джуркат Кроветворные клетки ракообразных Без кофактора Без кофактора Трансфекция не эффективна Эффективность трансфекции выше, чем у Effectene® и липосомных систем для трансфекции [28] [34]
Окончание таблицы
Гистонные и негистонные семейства Белок Клеточная модель Кофактор Эффективность трансфекции Статья
Н2В в комплексе с реконструированным хроматином MCF-7 (карцинома молочной железы человека) Без кофактора Эффективность трансфекции в 6 раз выше, чем у L¡pofectam¡ne® [35]
Н2В Димер Н2В и Н2А COS7 (почечные клетки африканской зеленой мартышки), HeLa (раковые клетки шейки матки человека), HTC (клетки гепатомы крыс), MCF-7 (карцинома молочной железы человека) Без кофактора Эффективность трансфекции в 2 раза выше, чем у L¡pofectam¡ne® [36]
H3 и H4 Клетки Джуркат Без кофактора Эффективность трансфекции от 2 до 5 раз выше, чем у L¡pofectam¡ne®, L¡pofect¡n®, ООТАР®, DEAE-Dextran и ООБРЕР® [28]
H2A, H2B, H3 и H4 NXS2 (клетки мышиной нейробластомы), COS7 (почечные клетки африканской зеленой мартышки), CHO (клетки яичников китайских хомячков) Без кофактора Эффективность трансфекции Н2А выше, чем у поли^-лизина, Н2В и Н3. Трансфекция с Н4 неэффективна [5, 10]
Гистоноподоб-ные белки неэукариотического происхождения Гистон из Pyrococcus horikoshii NIH 3T3 (мышиные фибробласты), HEK293 (эпителиальные клетки почки эмбриона человека), HL-7702 (гепатоциты человека), HepG2 (гепатомные клетки человека), COS7 (почечные клетки африканской зеленой мартышки), HeLa (раковые клетки шейки матки человека) Ca2+ Трансфекция неэффективна [39]
Гистон из Pyrococcus horikoshii CNE (клетки карциномы носоглотки человека) Без кофактора Эффективность трансфекции выше, чем у L¡pсfectam¡ne® [40]
Гистон из Thermotoga maritima NIH 3T3 (мышиные фибробласты), 293T (фибробласты), U251 (клетки глиомы человека), A431 (клетки эпидермальной карциномы) Ca2+ Эффективность трансфекции от 2 до 30 раз выше, чем у DEAE-Dextran и L¡pofect¡n® [41]
Гистон из Acholep-lasma laidlawii HEK293 (эпителиальные клетки почки эмбриона человека) Без кофактора Эффективность трансфекции при конденсировании плазмидной ДНК гистоном повышается от 2 до 4 раз [42]
Механизм доставки рекомбинантных
нуклеиновых кислот с помощью гистонов
Поры в ядерной мембране имеют размер 24 нм, что считается главным препятствием для внутриядерного проникновения комплексов плазмидной ДНК с катионными носителями [4]. Большие белки или комплексы пептида-ДНК транспортируются к ядру активным транспортом посредством «узнавания» последовательностей NLS. Один из подходов для генного переноса заключается в электростатическом связывании рекомбинантных нуклеиновых кислот с белками и полипептидами, содержащими последовательности NLS [63—65]. Кроме того, NLS-пептиды можно ковалентно конъюгировать с ДНК [66]. Инъекции плазмидной ДНК, ковалентно связанной с NLS-пептидом, в цитоплазму эмбриона Danio rerio (англ. zebrafish) приводит к ядерному транспорту в 50—100 раз выше по сравнению с немодифицированной «голой» плазмидной ДНК [67]. M.A. Zanta с соавт. (1999) показали, что NLS-пептиды , ковалентно связанные с плазмидной ДНК, могут повышать эффективность трансфекции in vitro в 100 раз [66]. Четыре нуклеосомных гистона Н2А, H2B, H3 и H4 транспортируются из цитоплазмы в ядро по NLS-зависимому пути [68, 69]. У гистона Н1 нет канонических последовательностей NLS. Его ядерный транспорт, по-видимому, связан с положительно заряженным С-концевым доменом. Тем не менее, NLS последовательности остальных гистонов показывают некоторое сходство с NLS полиома-вируса SV40 (от англ. Simian vacuolating virus 40) большого Т-антигена и расположены в N-концевой области [70]. Включение NLS последовательности SV40 большого Т-антигена в химерный гистон H1 повышало эффективность ядерного транспорта [21]. D. Balicki с соавт. создали несколько усечённых полипептидов, охватывающих все участки гистона Н2А, и оценили их способность к переносу чужеродной ДНК в клетки COS7 [11]. Высокую эффективность трансфекции показали N-концевые пептиды (первые 37 аминокислот гистона Н2А), содержащие NLS последовательности. Ядерная мембрана — барьер для прохождения ДНК к ядру, поэтому митотические стимулы повышают эффективность стандартных методов трансфекции [71]. При разработке трансфекционных реагентов для использования in vivo проблема ядерного транспорта встаёт особенно остро, так как большинство клеток-мишеней являются непролиферирующими. Существующие системы доставки генов полагаются на ковалентное или не ковалентное связывание NLS пептидов чужеродных белков, таких как SV40 большой Т-антиген. Гистоны могут стать естественным альтернативным подходом для преодоления барьера ядерной мембраны.
Анализ базы данных нуклеотидных последовательностей генов гистонов человека и мыши показывает, что каждый тип гистонных белков состоит из нескольких подтипов. Первоначальные эксперименты по применению гистонов в качестве транс-фекционных агентов основывались на применении гетерогенных смесей гистонных белков из ядерных экстрактов, что затрудняло идентификацию наиболее эффективного белка для переноса нуклеиновых кислот. D. Balicki с соавт. предположили, что эффективность доставки ДНК гистоном Н2А объясняется
2 механизмами: электростатическим связыванием с ДНК (конденсацией) и ядерным транспортом ком-
плексов гистонов Н2А-ДНК посредством NLS последовательностей белка [11]. Мутации положительно заряженных остатков N-концевого домена Н2А приводят к снижению трансфекционной активности, что подчеркивает важность сохранения целостности а-спиральной структуры N-концевой области гисто-нов Н2А.
Транспорт комплексов ДНК-гистоны через плазматическую мембрану клеток — не единственный фактор высокой трансфекционной активности гисто-нов. Перенос через плазматическую мембрану осуществляют и другие трансфекционные агенты, такие как поли^-лизин, Lipofectamine® и полиэтиленимин [72, 73]. Однако преимущество гистонов заключается в том, что они остаются в комплексе с ДНК после проникновения в цитоплазму, участвуют в активном транспорте комплексов ДНК-гистон в ядро, где ДНК участвует в процессах транскрипции [11].
Понимание механизмов взаимодействия с клеточной поверхностью и проникновения внутрь клетки через плазматическую мембрану имеет большое значение для разработки эффективных систем переноса генов. Известно, что белки, пептиды, вирусы и ДНК-белковые комплексы проникают в клетки млекопитающих с помощью процесса рецептор-опосредованного эндоцитоза [74—77]. Кроме того, проникновение макромолекул в клетки может проходить по пути клатрин-независимого эндоцитоза, в том числе с помощью фагоцитоза, макропиноцитоза и кавеоляр-ных везикул [78—80]. Ряд исследований показал, что некоторые пептиды способны пересекать мембрану клетки без участия эндоцитозного механизма [81]. Общее свойство всех гистонов, поли^-лизина и поли^-аргинина — высокое содержание положительно заряженных аминокислотных остатков (Arg и Lys). При физиологическом рН эти молекулы положительно заряжены и, следовательно, вряд ли могут пассивно диффундировать через липидный бислой. Существует распространённая гипотеза, что проникновение комплексов ДНК-переносчик происходит в клетках через эндоцитозный путь [82—83]. I. Kopatz с соавт. (2004) предложили новую модель для клеточного проникновения ДНК с участием протеогли-канов как рецепторов ДНК-комплексов [84].
В литературе существуют противоречивые данные о механизмах проникновения комплексов нуклеиновых кислот с гистонами в клетки (рис.). E. Hariton-Gazal с соавт. (2003) экспериментально продемонстрировали, что гистоны H1, Н2А, H2B, H3 и H4 непосредственно проходят через плазматическую мембрану клеток HeLa and Colo-205 с помощью пассивной диффузии [85]. Было показано, что интернализация гистонов в этих клетках происходит при низкой температуре, недостатке АТФ (аденозинтри-фосфат) и высокой молярности сахарозы, что блокирует процесс эндоцитоза. Кавеол-опосредованный эндоцитоз и фагоцитоз не могут участвовать в интернализации гистонов, так как применение специфических ингибиторов этих механизмов не влияет на скорость поглощения гистонов [85, 86]. Проникновение нуклеосомных гистонов H2A, H2B, H3 и H4, не связанное с эндоцитозом, показано на примере растительных клеток и протопластов [87, 88]. В этом случае поглощение гистонов проходило при
4 °С и не ингибировалось блокаторами эндоцитоза. Используя гистоны, меченые биотинилированием, и ИФА-системы, J. Rosenbluh с соавт. (2005) уста-
новили, что гистоны Н2А, Н3 и Н4 могут проходить через липидный бислой больших однослойных или многослойных липосом [89]. В отличие от Н2А, Н3, Н4, гистон Н2В не мог проникать в липосомы.
Однако участие эндоцитоза в прохождении гистонов в комплексе с ДНК в клетку не может быть абсолютно исключено. Действительно, хлорохин повышает
Для определения механизма доставки комплексов гистона Н1-ДНК внутрь клетки, S.V. Zaitsev с соавт. (2002) использовали в экспериментах флуоресцентно меченые ДНК и гистон Н1 [19]. С помощью флуоресцентной микроскопии и иммунофлуоресценции авторы показали локализацию комплексов гистона Н1-ДНК в эндосомах/лизосо-мах, что свидетельствует о поглощении трансфекци-онных комплексов с помощью эндоцитоза. Авторами также установлено, что ионы кальция контролируют реорганизацию трансфекционных комплексов в эн-досомах/лизосомах и их высвобождение в цитозоле, что важно для экспрессии трансгенов, тогда как поглощение трансфекционных комплексов клетками не зависит от присутствия ионов кальция.
Гистоны могут участвовать в ядерном транспорте не только нуклеиновых кислот, но и других биомолекул. Например, показано, что ковалентное присоединение гистонов к БСА приводило к проникновению комплексов в клетки [85]. В отличие от проникновения в клетку неконъюгированных гистонов, эффективность прохождения комплексов гистона-БСА в клетку снижалась при снижении уровня АТФ в клетке или понижении температуры, что свидетельствует о том, что часть комплексов гистона-БСА проникает в клетку с помощью эндоцитоза.
Для анализа механизма проникновения гистона Н2В в клеточное ядро K.M. Wagstaff с соавт. (2007) создали димер GFP и трех различных частей гистона H2B: N-концевой хвост, который содержал консервативный стандартный NLS; глобулярный домен (неконсервативный), который отвечает за форми-
активность трансфекции гистона Н1 [21, 27].
Хлорохин, как известно, нейтрализует кислую рН эндоцитозных пузырьков, что снижает деградацию макромолекул эндосомальных везикул. Также было установлено, что хлорохин повышает рецептор-опосредованный перенос генов — процесс, происходящий с помощью эндоцитоза.
рование октамера и связывание с ДНК; С-концевой хвост, который играет роль в поддержании структуры нуклеосомы. Было показано, что трансдукция зависит от N-концевого хвоста и глобулярного домена. При добавлении еще одного сигнала ядерной локализации к гистону H2B увеличивалась скорость его проникновения в клеточное ядро. Было показано, что гистоны в комплексе с ДНК проникают в ядро посредством трансдукции белков, а не эндоцитоза [36].
Комбинированные системы доставки
рекомбинантных нуклеиновых кислот
в клетки
Трансфекционные агенты на основе катионных наночастиц и полимеров — перспективные векторы для генного переноса. Однако многие катионные полимеры в высоких концентрациях токсичны для клеток. Положительно заряженные белки, такие как гистоны, являются биологически безопасной альтернативой традиционным трансфекционным агентам, особенно in vivo. Одно из перспективных направлений — комбинирование различных катионных наночастиц с ги-стонными белками для повышения эффективности трансфекции. Так, было показано, что экстракт ги-стонов из тимуса телёнка и из куриных эритроцитов способен связывать ДНК и трансфицировать различные культуры клеток [90]. Однако исследователи наблюдали лишь незначительную экспрессию рекомбинантных репортерных генов. Эффективность трансфекции существенно возрастала при добавлении в комплексы катионного полимера полиэтилени-
Г истон
ДНК
У
\
Цитоплазма Ядро
Пассивная
диффузия
NLS-опосредованный ядерный транспорт
#) (&)
& 1
г'А
Эндоцитоз
Схема транспорта комплексов нуклеиновых кислот с гистонными белками через цитоплазматическую и ядерную мембраны
мина (PEI, от англ. polyethylenimine). Ни PEI, ни одни гистоны по отдельности не могли достичь эффективности, сравнимой с комплексами PEI-гистон-ДНК. Эти результаты показывают, что смеси гистонов (рекомбинантных или из природных источников) в сочетании с минимальными концентрациями PEI могут использоваться в качестве низкотоксичных эффективных векторов для трансфекции клеток in vitro и in vivo.
J. Deng с соавт. (2011) синтезировали катионный сополимер низкомолекулярного полиэтилени-мина и L-глутаминовой кислоты (PLGE, от англ. Poly (L-glutamic Acid) Grafted Polyethylenimine). Для улучшения эффективности доставки генов PLGE применяли в комплексе с гистонами, содержащими NLS, в качестве кофактора применяли хлорохин. В работе использовался линкерный гистон Н1 и нуклеосом-ные гистоны Н2А, Н2В, Н3 и Н4. Авторы показали успешное формирование комплексов ДНК-гистон-PLGE размером около 200 нм в диаметре. Применение гистона значительно повышало эффективность трансфекции PLGE и экспрессию GFP in vitro (клетки линии HeLa) и in vivo (у плодовой мушки Drosophila meianogaster). Комплексы ДНК-гистон-PLGE низкотоксичны для клеток [91].
Было показано [92, 93], что концевые пептиды гистона Н3 в сочетании с полиэтиленгликолем (PEG, от англ. polyethylene glycol) являются высокоэффективными и нетоксичными средствами доставки генов. M.O. Sullivan с соавт. (2008) создали полиплексы PEG, содержащие триметилированные в четвертой позиции концевые пептиды гистона Н3 (H3K4me3). Наличие NLS-последовательностей позволяло H3K4me3 взаимодействовать с ядерными эффекторными комплексами, инициируя транскрипционную активность. При использовании поли-плексов с H3K4me3 экспрессия репортерных генов начиналась в два раза быстрее, чем при использовании полиплексов PEG без пептида H3K4me3. Также авторы разрабатывают способ доставки нуклеиновых кислот с помощью комплексов, содержащих катионные наночастицы золота и H3K4me3 (HMGNs, от англ. histone-mimetic gold nanoparticles) [94]. Такие комплексы имеют сильный положительный заряд, что обеспечивает хорошую конденсацию ДНК и ее защиту от деградации нуклеазами. Было показано, что комплексы HMGN-плазмидная ДНК стабильны в присутствии нуклеаз сыворотки крови. Также эффективны для доставки нуклеиновых кислот комплексы PEI-H3K4me3 [94]. Эффективность трансфекции клеток линии СНО-К1 комплексами PEI-H3K4me3 была выше, чем при использовании PEI и H3K4me3 по отдельности.
Гистонные белки и пептиды успешно применяют в сочетании с другими системами доставки генов, что значительно повышает их эффективность. J.E. Hagstrom с соавт. (1996) для трансфекции клеточной линии NIH3T3 использовали тройные комплексы: плазмидная ДНК-гистон H1-DOPE (от англ. dioleoyl phosphatidylethanlamine) и плазмидная ДНК-гистон Ж-фосфатидилсерин [24]. Они показали, что тройные комплексы, содержащие гистон Н1 и DOPE, трансфицируют клетки с большей эффективностью, чем двойные комплексы, содержащие только плаз-мидную ДНК и DOPE. Гистон H1 способствует более плотной упаковке ДНК и стабилизирует её комплек-
сы с липосомными трансфекционными агентами. Гистоны Н2А, H2B, H3 и H4 менее эффективны в сочетании с другими липосомными трансфекционными агентами [24]. Также показано, что в клетках, трансфицированных комплексами гистон Ж-плазмидная ДНК-Lipofectin®, экспрессируется в 20 раз больше люциферазы, чем в клетках, трансфицированных комплексами плазмидная ДНК-Lipofectin® [21].
K.M. Wagstaff с соавт. (2008) показали, что реконструированный хроматин в комплексе с пистонными белками H2B, содержащими дополнительные NLS, повышает эффективность электропорации и липофек-ции [35]. Использование реконструированного хроматина с гистонными белками H2B при электропорации или липофекции (Lipofectamine®) значительно повышало эффективность доставки ДНК в клетки линии MCF7 и экспрессию репортерного гена GFP.
В настоящее время проводятся исследования по разработке адресных (тканеспецифичных) невирусных систем доставки рекомбинантных нуклеиновых кислот [63]. Эти системы основаны на доставке ДНК при помощи поликатионных носителей (например, поли^-лизин) с синтетическими олигопептид-ными лигандами, которые специфичны к рецептору клетки-мишени. Основной недостаток липидной и полимерной систем адресной доставки — произвольное сшивание специфичных липидных и полимерных олигопептидов, что влияет на эффективность доставки, уменьшая её специфичность [64, 65]. Для повышения специфичности доставки были сконструированы генетические конструкции, содержащие последовательности ДНК, кодирующие гистоны и специфические лиганды. F.H. Dai с соавт. (2003) сконструировали серию векторов, содержащих последовательность кДНК, кодирующую гистон Н1, и рецептор эпидермального фактора роста [95]. Эти векторы эффективно и специфично трансфицировали клетки in vitro (клеточные линии: U2OS, клетки остеосаркомы человека, BEL-7402, клетки гепатомы человека, и SKOV3, клетки аденокарциномы яичника человека) и in vivo (мыши линии BALB/c после введения клеток BEL-7402 и SKOV3).
Заключение
Таким образом, применение гистонных и других ядерных белков для переноса рекомбинантных нуклеиновых кислот в клетки — перспективный метод невирусной трансфекции in vitro и in vivo. Гистонные белки могут быть использованы как в виде самостоятельных векторов для генного переноса, так и в виде компонентов более сложных трансфекционных систем, позволяя повысить стабильность нуклеиновых кислот и эффективность транспорта в ядро клетки.
Благодарности
Работа частично финансировалась грантами Российского Фонда Фундаментальных Исследований, государственными контрактами ФЦП Федерального Агентства по Науке и Инновациям 16.512.11.2101, Региональным центром коллективного пользования физико-химических исследований веществ и материалов (РЦКП ФХИ) и Научно образовательным центром фармацевтики Казанского (Приволжского) федерального университета, ОАО «Институт стволовых клеток человека» (г. Москва).
ЛИТЕРАТУРА
1. Balicki D., Beutler E. Gene therapy of human disease. Medicine. 2002; 81[1]: 69-86.
2. Kovesdi I., Brough D.E., Bruder J.T. et al. Adenoviral vectors for gene transfer. Curr. Opin. Biotechnol. 1997; 8[5]: 583-9.
3. Felgner P.L., Barenholz Y., Behr J.P. et al. Nomenclature for synthetic gene delivery systems. Hum. Gene Ther. 1997; 8[5]: 511-2.
4. Mahato R.I., Smith L.C., Rolland A. Pharmaceutical perspectives of nonviral gene therapy. Adv. Genet. 1999; 41: 95-156.
5. Balicki D., Reisfeld R.A., Pertl U. et al. Histone H2A-mediated transient cytokine gene delivery induces efficient antitumor responses in murine neuroblastoma. PNaS USA 2000; 97[21]: 11500-4.
6. Schwartz B., Ivanov M.A., Pitard B. et al. Synthetic DNA-compacting peptides derived from human sequence enhance cationic lipid-mediated gene transfer in vitro and in vivo. Gene Ther. 1999; 6[2]: 282-92.
7. Morris M.C., Vidal P., Chaloin L. et al. A new peptide vector for efficient delivery of oligonucleotides into mammalian cells. Nucleic. Acids Res. 1997; 25[14]: 2730-6.
8. Derossi D., Chassaing G., Prochiantz A. Trojan peptides: the penetratin system for intracellular delivery. Trends Cell Biol. 1998; 8[2]: 84-7.
9. Harbottle R.P., Cooper R.G., Hart S.L. et al. An RGD-oligolysine peptide: a prototype construct for integrin-mediated gene delivery. Hum. Gene Ther. 1998; 9[7]: 1037-47.
10. Balicki D., E. Beutler. Histone H2A significantly enhances in vitro DNA transfection. Mol. Med. 1997; 3[11]: 782-7.
11. Balicki D., Putnam C.D., Scaria P.V. et al. Structure and function correlation in histone H2A peptide-mediated gene transfer. PNAS USA 2002; 99[11]: 7467-71.
12. Kornberg R.D., Lorch Y. Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryote chromosome. Cell 1999; 98[3]: 285-94.
13. Palau J., Climent F., Aviles F.J. et al. Interactions of histones and histone peptides with DNA Thermal denaturation and solubility studies. Biochim. Biophys. Acta. 1977; 476[2]: 108-21.
14. Baake M., Doenecke D., Albig W. Characterisation of nuclear localisation signals of the four human core histones. J. Cell Biochem. 2001; 81[2]: 333-46.
15. Wiethoff C.M., Gill M.L., Koe G.S. et al. The structural organization of cationic lipid-DNA complexes. J. Biol. Chem. 2002; 277[47]: 44980-7.
16. Ryser H.J., Hancock R. Histones and basic polyamino acids stimulate the uptake of albumin by tumor cells in culture. Science 1965; 150[3695]: 501-3.
17. Ryser H.J. Uptake of protein by mammalian cells: an underdeveloped area. The penetration of foreign proteins into mammalian cells can be measured and their functions explored. Science 1968; 159[813]: 390-6.
18. Ryser H.J. Studies on protein uptake by isolated tumor cells. 3. Apparent stimulations due to pH, hypertonicity, polycations, or dehydration and their relation to the enhanced penetration of infectious nucleic acids. J. Cell Biol. 1967; 32[3]: 737-50.
19. Zaitsev S., Buchwalow I., Haberland A. et al. Histone H1-mediated transfection: role of calcium in the cellular uptake and intracellular fate of H1-DNA complexes. Acta Histochem. 2002; 104[1]: 85-92.
20. Budker V., Hagstrom J.E., Lapina O. et al., Protein/amphipathic polyamine complexes enable highly efficient transfection with minimal toxicity. Biotechniques 1997; 23[1]: 139, 142-7.
21. Fritz J.D., Herweijer H., Zhang G. et al. Gene transfer into mammalian cells using histone-condensed plasmid DNA. Hum. Gene Ther. 1996; 7[12]: 1395-404.
22. Haberland A., Dalluge R., Zaitsev S. et al. Ligand-histone H1 conjugates: increased solubility of DNA complexes, but no enhanced transfection activity. Somat. Cell Mol. Genet. 1999; 25[4]: 237-45.
23. Haberland A., Knaus T., Zaitsev S.V. et al. Histone H1-mediated transfection: serum inhibition can be overcome by Ca2+ ions. Pharm. Res. 2000; 17[2]: 229-35.
24. Hagstrom J.E., Sebestyen M.G., Budker V. et al. Complexes of non-cationic liposomes and histone H1 mediate efficient transfection of DNA without encapsulation. Biochim. Biophys. Acta. 1996; 1284[1]: 47-55.
25. Kott M., Haberland A., Zaitsev S. et al. A new efficient method for transfection of neonatal cardiomyocytes using histone H1 in combination with DOSPER liposomal transfection reagent. Somat. Cell Mol. Genet. 1998; 24[4]: 257-61.
26. Lucius H., Haberland A., Zaitsev S. et al. Structure of transfection-active histone H1/DNA complexes. Mol. Biol. Rep. 2001; 28[3]: 157-65.
27. Zaitsev S.V., Haberland A., Otto A. et al. H1 and HMG17 extracted from calf thymus nuclei are efficient DNA carriers in gene transfer. Gene Ther. 1997; 4[6]: 586-92.
28. Demirhan I., Hasselmayer O., Chandra A. et al., Histone-mediated transfer and expression of the HIV-1 tat gene in Jurkat cells. J. Hum. Virol. 1998; 1[7]: 430-40.
29. Bottger M., Zaitsev S.V., Otto A. et al. Acid nuclear extracts as mediators of gene transfer and expression. Biochim. Biophys. Acta. 1998; 1395[1]: 78-87.
30. Haberland A., Knaus T., Zaitsev S.V. et al. Calcium ions as efficient cofactor of polycation-mediated gene transfer. Biochim. Biophys. Acta. 1999; 1445[1]: 21-30.
31. Puebla I., Esseghir S., Mortlock A. et al. A recombinant H1 histone-based system for efficient delivery of nucleic acids. J. Biotechnol. 2003; 105[3]: 215-26.
32. Moran F., Montero F., Azorin F. et al. Condensation of DNA by the C-terminal domain of histone H1. A circular dichroism study. Biophys. Chem. 1985; 22[1-2]: 125-9.
33. Jung H.J., Hwang D.S., Wei Q.D. et al. Carassius auratus-originated recombinant histone H1 C-terminal peptide as gene delivery material. Biotechnol. Prog. 2008; 24[1]: 17-22.
34. Liu H., Soderhall I. Histone H2A as a transfection agent in crayfish hematopoietic tissue cells. Dev. Comp. Immunol. 2007; 31[4]: 340-6.
35. Wagstaff K.M., Fan J.Y., De Jesus M.A. et al. Efficient gene delivery using reconstituted chromatin enhanced for nuclear targeting. FASE 2008; 22[7]: 2232-42.
36. Wagstaff K.M., Glover D.J., Tremethick D.J. et al. Histone-mediated transduction as an efficient means for gene delivery. Mol. Ther. 2007; 15[4]: 721-31.
37. Hasselmayer O., Demirhan I., Chandra A. et al. Inhibition of histone-mediated gene transfer in eucaryotic cells by anti-histone IgG. Anticancer Res. 2001; 21[4A]: 2377-86.
38. Kamiya H., Goto H., Kanda G. et al. Transgene expression efficiency from plasmid DNA delivered as a complex with histone H3. Int. J. Pharm. 2010; 392[1-2]: 249-53.
39. Weng L., Liu D., Li Y. et al. An archaeal histone-like protein as an efficient DNA carrier in gene transfer. Biochim. Biophys. Acta. 2004; 1702[2]: 209-16.
40. Li Y.Y., Wang R., Zhang G.L. et al. An archaeal histone-like protein mediates efficient p53 gene transfer and facilitates its anticancer effect in vitro and in vivo. Cancer Gene Ther. 2007; 14[12]: 968-75.
41. Esser D., Amanuma H., Yoshiki A. et al. A hyperthermostable bacterial histone-like protein as an efficient mediator for transfection of eukaryotic cells. Nat. Biotechnol. 2000; 18[11]: 1211-3.
42. Бобровский П.А., Левицкий С.А. Влияние гистоноподобного HU белка из Acholeplasma laidlawii на эффективность трансфекции клеток линии HEK293 плазмидной ДНК. Материалы VI Международной [XV Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых. Вест. РГМУ. 2011; 1[спец.вып.]: 231.
43. Kaneda Y., Iwai K., Uchida T. Introduction and expression of the human insulin gene in adult rat liver. J. Biol. Chem. 1989; 264[21]: 12126-9.
44. Kato K., Nakanishi M., Kaneda Y. et al. Expression of hepatitis B virus surface antigen in adult rat liver. Co-introduction of DNA and nuclear protein by a simplified liposome method. J. Biol. Chem. 1991; 266[6]: 3361-4.
45. Tomita N., Higaki J., Morishita R. et al., Direct in vivo gene introduction into rat kidney. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992; 186[1]: 129-34.
46. Sawa Y., Suzuki K., Bai H.Z. et al. Efficiency of in vivo gene transfection into transplanted rat heart by coronary infusion of HVJ liposome. Circulation 1995; 92[9 Suppl]: II479-82.
47. Bottger M., Vogel F., Platzer M. et al. Condensation of vector DNA by the chromosomal protein HMG1 results in efficient transfection. Biochim. Biophys. Acta. 1988; 950[2]: 221-8.
48. Namiki Y., Takahashi T., Ohno T. Gene transduction for disseminated intraperitoneal tumor using cationic liposomes containing non-histone chromatin proteins: cationic liposomal gene therapy of carcinomatosa. Gene Ther. 1998; 5[2]: 240-6.
49. Mistry A.R., Falciola L., Monaco L. et al. Recombinant HMG1 protein produced in Pichia pastoris: a nonviral gene delivery agent. Biotechniques 1997; 22[4]: 718-29.
50. Haberland A., Bottger M. Nuclear proteins as gene-transfer vectors. Biotechnol. Appl. Biochem. 2005; 42[Pt 2]: 97-106.
51. Goodwin G.H., Sanders C., Johns E.W. A new group of chromatin-associated proteins with a high content of acidic and basic amino acids. Eur. J. Biochem. 1973; 38[1]: 14-9.
52. Scheule R.K., St George J.A., Bagley R.G. et al. Basis of pulmonary toxicity associated with cationic lipid-mediated gene transfer to the mammalian lung. Hum. Gene Ther. 1997; 8[6]: 689-707.
53. Tousignant J.D., Gates A.L., Ingram L.A. et al. Comprehensive analysis of the acute toxicities induced by systemic administration of cationic lipid:plasmid DNA complexes in mice. Hum. Gene Ther. 2000; 11[18]: 2493-513.
54. Filion M.C., Phillips N.C. Toxicity and immunomodulatory activity of liposomal vectors formulated with cationic lipids toward immune effector cells. Biochim. Biophys. Acta. 1997; 1329[2]: 345-56.
55. Filion M.C., Phillips N.C. Anti-inflammatory activity of cationic lipids. Br. J. Pharmacol. 1997; 122[3]: 551-7.
56. Lappalainen K., Jaaskelainen I., Syrjanen K. et al. Comparison of cell proliferation and toxicity assays using two cationic liposomes. Pharm. Res. 1994; 11[8]: 1127-31.
57. Monestier M. Autoantibodies to nucieosomes and histone-DNA compiexes. Methods 1ВВ7; 11[1]: 3B-43.
5В. Hardin J.A., Thomas J.O. Antibodies to histones in systemic iupus erythematosus: iocaiization of prominent autoantigens on histones H1 and H2B. PNAS USA 1ВВЗ; ВШ24]: 74Ю-4.
5В. Iborra S., Soto M., Carrion J. et ai. Vaccination with a piasmid DNA cocktaii encoding the nucieosomai histones of Leishmania confers protection against murine cutaneous ieishmaniosis. Vaccine 2ВД4; ЗЗ^В-З^]: 3865-76.
6^. Coiiins L., Asuni A.A., Anderton B.H. et ai. Efficient gene deiivery to primary neuron cuitures using a synthetic peptide vector system. J. Neurosci. Methods. 2ВДЗ; 125[1-2]: 113-20
B1. Zhang X., Coiiins L., Sawyer G.J. et ai. In vivo gene deiivery via portai vein and biie duct to individuai iobes of the rat iiver using a poiyiysine-based nonvirai DNA vector in combination with chioroquine. Hum. Gene Ther. 2Ш1; 12[1В]: 217В-В^.
B2. Torchiiin V.P., Lukyanov A.N. Peptide and protein drug deiivery to and into tumors: chaiienges and soiutions. Drug Discov. Today. 2ШЗ; В[6]: 25В-66.
B3. Kaneda Y., Iwai K., Uchida T. Increased expression of DNA cointroduced with nuciear protein in aduit rat iiver. Science 1ВВВ; 24З[4ВВВ]: З75-В.
64. Hagstrom J.E., Ludtke J.J., Bassik M.C. et ai. Nuciear import of DNA in digitonin-permeabiiized ceiis. J. Ceii Sci. 1ВВ7; 11Ü [Pt 1в]: 2323-31.
65. Conary J.T., Erdos G., McGuire M. et ai. Cationic iiposome piasmid DNA compiexes: in vitro ceii entry and transgene expression augmented by synthetic signai peptides. Eur. J. Pharm. Biopharm. 1ВВ6; 42[4]: 277-В5.
66. Zanta M.A., Beiguise-Vaiiadier P., Behr J.P. Gene deiivery: a singie nuciear iocaiization signai peptide is sufficient to carry DNA to the ceii nucieus. PNAS USA 1ВВВ; В6[1]: В1-6.
67. Coiias P., Aiestrom P. Rapid targeting of piasmid DNA to zebrafish embryo nuciei by the nuciear iocaiization signai of SV4^ T antigen. Moi. Mar. Bioi. Biotechnoi. 1ВВ7; 6[1]: 4В-5В.
6В. Mosammaparast N., Jackson K.R., Guo Y. et ai. Nuciear import of histone H2A and H2B is mediated by a network of karyopherins. J. Ceii Bioi. 2Ш1; 153[2]: 251-62.
6В. Mosammaparast N., Guo Y., Shabanowitz J. et ai. Pathways mediating the nuciear import of histones H3 and H4 in yeast. J. Bioi. Chem. 2Ш2; 277[1]: В62-В.
7^. Moreiand R.B., Langevin G.L., Singer R.H. et ai. Amino acid sequences that determine the nuciear iocaiization of yeast histone 2B. Moi. Ceii Bioi. 1ВВ7; 7[11]: 4МВ-57.
71. Wiike M., Fortunati E., van den Broek M. et ai. Efficacy of a peptide-based gene deiivery system depends on mitotic activity. Gene Ther. 1ВВ6; 3[12]: 1133-42.
72. Itaka K., Harada A., Yamasaki Y. et ai. In situ singie ceii observation by fiuorescence resonance energy transfer reveais fast intra-cytopiasmic deiivery and easy reiease of piasmid DNA compiexed with iinear poiyethyienimine. J. Gene Med. 2ВД4; 6[1]: 76-В4.
73. Okuda T., Niidome T., Aoyagi H. Cytosoiic soiubie proteins induce DNA reiease from DNA-gene carrier compiexes. J. Controi. Reiease. 2Ш4; ВВ[2]: 325-32.
74. Zeiphati O., Szoka F.C. Mechanism of oiigonucieotide reiease from cationic iiposomes. PNAS USA 1ВВ6; ВЗ[21]: 114ВЗ-В.
75. Zeiphati O., Szoka F.C. Intraceiiuiar distribution and mechanism of deiivery of oiigonucieotides mediated by cationic iipids. Pharm. Res. 1ВВ6; 1З[В]: 1367-72.
76. Zelphati O., Szoka F.C. Liposomes as a carrier for intracellular delivery of antisense oligonucleotides: a real or magic bullet? J. Control. Release. 1996; 41[1-2]: 99-119.
77. Sieczkarski S.B., Whittaker G.R. Dissecting virus entry via endocytosis. J. Gen. Virol. 2002; 83[Pt 7]: 1535-45.
78. Bratosin D., Mazurier J., Tissier J.P. et al. Cellular and molecular mechanisms of senescent erythrocyte phagocytosis by macrophages. A review. Biochimie 1998; 8o[2]: 173-95.
79. Cardelli J. Phagocytosis and macropinocytosis in Dictyostelium: phosphoinositide-based processes, biochemically distinct. Traffic 2001; 2[5]: 311-20.
80. Nichols B.J., Lippincott-Schwartz J. Endocytosis without clathrin coats. Trends Cell Biol. 2001; 11[10]: 406-12.
81. Schwartz J.J., Zhang S. Peptide-mediated cellular delivery. Curr. Opin. Mol. Ther. 2000; 2[2]: 162-7.
82. Gao X., Huang L. Cationic liposome-mediated gene transfer. Gene Ther. 1995; 2[10]: 710-22.
83. Niidome T., Wakamatsu M., Wada A. et al. Required structure of cationic peptide for oligonucleotide-binding and delivering into cells. J. Pept. Sci. 2000; 6[6]: 271-9.
84. Kopatz I., Remy J.S., Behr J.P. A model for non-viral gene delivery: through syndecan adhesion molecules and powered by actin. J. Gene Med. 2004; 6[7]: 769-76.
85. Hariton-Gazal E., Rosenbluh J., Graessmann A. et al. Direct translocation of histone molecules across cell membranes. J. Cell Sci. 2003; 116[Pt 22]: 4577-86.
86. Murphy R.F., Jorgensen E.D., Cantor C.R. Kinetics of histone endocytosis in Chinese hamster ovary cells. A flow cytofluorometric analysis. J. Biol Chem. 1982; 257[4]: 1695-701.
87. Vives E., Charneau P., van Rietschoten J. et al. Effects of the Tat basic domain on human immunodeficiency virus type 1 transactivation, using chemically synthesized Tat protein and Tat peptides. J. Virol. 1994; 68[5]: 3343-53.
88. Vives E., Brodin P. Lebleu B. A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus. J. Biol. Chem. 1997; 272[25]: 16010-7.
89. Rosenbluh J., Hariton-Gazal E., Dagan A. et al. Translocation of histone proteins across lipid bilayers and Mycoplasma membranes. J. Mol. Biol. 2005; 345[2]: 387-400.
90. Schneeweiss A., Buyens K., Giese M. et al. Synergistic effects between natural histone mixtures and polyethylenimine in non-viral gene delivery in vitro. Int. J. Pharm. 400M-2]: 86-95.
91. Deng J., Wen Y., Wang C. et al. Efficient intracellular gene delivery using the formulation composed of poly [L-glutamic acid) grafted polyethylenimine and histone. Pharm. Res. 2011; 28(4): 812-26
92. Sullivan M.O., Larsen J.D., Reilly M.J. Intracellular trafficking and activity of histone-mimetic gene delivery vehicles. Poster 549a. in Biochemical and Molecular Engineering XVII; 2011; Seattle, Washington, USA.
93. Sullivan M.O., Lenhoff A.M., Robinson A.S. et al. Using the epigenetic code to promote site specific DNA release and transcription from non-viral gene delivery vehicles. in winter research review; 2011; Delaware, USA.
94. Reilly M.J., Sullivan M.O. Histone-mimetic gold nanoparticles as self-activating & tailorable gene delivery scaffolds. Proceedings in AIChE Annual Meeting; 2008; Philadelphia, USA.
95. Dai F.H., Chen Y., Ren C.C. et al. Construction of an EGF receptor-mediated histone H1(0)-based gene delivery system. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 2003; 129[8]: 456-62.
Поступила 07.03.2011
