CC BY
63
УДК 616.3:612.0151:615.918
П. Г. CTOPOЖУK, В. В. OHOПPИEB, В. A. nEXOBA
ХЛОРОРГАНИЧЕСКИЕ ПЕСТИЦИДЫ И ИХ ДЕЙСТВИЕ НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ ОРГАНОВ ПИЩЕВАРЕНИЯ
Кубанский государственный медицинский университет, ФГУ «Российский центр функциональной хирургической гастроэнтерологии Росздрава», г. Краснодар
Изучение действия хлорорганических пестицидов (ХОП) на организм человека и животных, несмотря на запрещение и ограничение их применения еще в 70-х годах прошлого века, продолжает оставаться актуальной проблемой современной биологии и медицины. По данным краевой станции защиты растений «Краснодарская», в нашем крае накоплено 2501,3 т пестицидов, из них около 33% - хлорорганические и фос-форорганические соединения [5].
То обстоятельство, что ХОП относятся к стойким ядохимикатам с периодом полураспада до 15-20 лет и для полного исчезновения из природной среды необходимо 10 таких периодов [6], обусловливает их глобальное распространение в окружающей среде, циркуляцию в ней, накопление по трофическим цепям [7] и в конечном итоге негативное влияние на живые организмы.
Схема неблагоприятного воздействия пестицидов представляется следующей. При загрязнении водоемов ХОП в результате утечек, сброса в водную среду, дрейфа пестицидов из мест их применения [13] в первую очередь страдают водные микроорганизмы. Затем ХОП оказываются на более высоких трофических уровнях -в планктоне, моллюсках, рыбах и морских животных. ХОП накапливаются в больших количествах в растениях, которые напрямую употребляются человеком в пищу (овощи, фрукты, злаки) или трансформируются через продукты животноводства, птицеводства, рыбоводства [8]. В Краснодарском крае ситуация осложняется тем, что при высоком стоянии грунтовых вод, являющихся основным источником питьевой воды для населения, возникает прямая угроза их загрязнения пестицидами из-за нарушения правил хранения последних [5].
ХОП и их метаболиты аккумулируются во всех тканях организма животных и человека, особенно в жировой ткани, независимо от территории обитания. Например, в организме байкальской нерпы дихлордифенил-трихлорэтана (ДДТ) оказалось столько же, сколько у тюленей известных своей загрязненностью Северного и Балтийского морей [1] и пингвинов в Ан-тарктике [8].
ХОП и образующиеся из них диоксины являются канцерогенами и мутагенами. Они оказывают негативное действие на иммунную и гормональную системы, вызывают анемию, лейкемию, деструкцию печени, нарушения функционирования желудочно-кишечного тракта, расстройство психики [2, 6, 7], мочекаменную болезнь [3] и другие заболевания.
Установлено, что карбоматы и фосфорорганичес-кие соединения ингибируют активность ацетилхолин-эстеразы (АХЭ) - специфического фермента нервной системы, участвующего в передаче нервного импульса в синапсах с одного нервного окончания на другое. В результате блокады этого механизма развиваются судороги, паралич и смерть [8].
Относительно ХОП и продуктов их распада или
трансформации существуют лишь указания на то, что они более токсичны, чем пестициды предыдущих двух классов, и механизмы их действия до конца еще не раскрыты.
Целью настоящей работы явилось изучение действия XOП на активность ферментов органов пищеварения.
Поскольку XOП в организм человека попадают в основном с пищевыми продуктами через ротовую полость и органы пищеварительной системы, то и их действие в первую очередь направлено на ферменты ротовой полости, желудка, а затем и кишечника.
Методы исследования
В качестве объекта исследований были взяты амилаза, лизоцим и пепсин. Их активность изучалась (in vitro) под действием наиболее часто применявшихся в Краснодарском крае XO^ таких как ДДТ (дихлорди-фенил-трихлорэтан), ДДД (дихлордифенилдихлорэ-тан), ДДЕ (дихлордифенил-дихлорэтилен), a-^ЦГ (альфа-гексахлорциклогексан) и у-^ЦГ (гамма-гексахлор циклогексан), носительство которых у населения Кубани до настоящего времени остается высоким.
В работе использованы растворы ферментов, предварительно проинкубированных с раствором одного из вышеперечисленных XO^ взятые в соотношении 1:10. Контроль ставили с интактными растворами фермента.
Определение активности амилазы. Для определения активности фермента использована методика, предложенная П. Г. Сторожуком и Т. И. Анашкиной [11], а затем усовершенствованная П. Г. Сторожу-ком и Корочанской С. П. [12]. В основу метода положено определение скорости (в секундах) гидролиза крахмала до эритродекстринов (карминово-красный цвет в присутствии раствора Люголя), образующихся под действием амилазы (Sigma, США).
Ход реакции
В центрифужные пробирки вносят 5 мл 0,1%-ного раствора крахмала, помещают в водяной термостат (35о С) и инкубируют 10 мин. В одну из пробирок добавляют 0,1 мл раствора (0,025 мг) амилазы и одновременно включают секундомер. На белую фарфоровую тарелку наносят каплю раствора Люголя, ровно через 30 секунд добавляют каплю реакционной смеси (раствор крахмала с амилазой) и перемешивают стеклянной палочкой. Эту процедуру с контрольной пробой повторяют через каждые 30 секунд до тех пор, пока не появятся эритродекстрины. Точно так же проделывается процедура с амилазой, предварительно проинкубированной с XOП (опытная проба).
Активность амилазы с помощью полученных данных рассчитывается по следующей формуле:
А - в - с
Аам =-------------- 10, или 654 : д,
д
где Аам - активность амилазы,
А - количество мг субстрата (5 мг крахмала), взятого в опыт,
в - количество единиц амилазы (4,125 ед.), содержащейся в 0,025 мг фермента, взятого в опыт (эталон),
с - время гидролиза крахмала до эритродекстринов в опыте с эталоном, мин,
д - время гидролиза крахмала в опытной пробе (мин),
10 - коэффициент для пересчета на 1 мл ферментосодержащего раствора.
Определение активности лизоцима
В основу метода определения активности лизоци-ма был положен способ, описанный в патенте на изобретение Российской Федерации № 2170932 (Сторо-жук П. Г., Сафарова И. В., Еричев В. В., 2001).
Для определения активности фермента используются патентованные препараты - лиофилизированный
Мюгососсиэ Lysodеikticus (МЦ Б1дта, США) и ЬуЕОЕуте с активностью 20 000 и/ мг (АррИСИет, ФРГ).
Суть методики состоит в том, что об активности фермента судят по количеству разрушенных клеток МЦ которые служат субстратом, а лизоцим используется в качестве стандарта для построения калибровочного графика.
Ход реакции
В кювету с толщиной слоя 10 мм вносят 5,0 мл прогретого до 250 С рабочего раствора МЦ измеряют его оптическую плотность, которая должна быть в пределах 0,290-0,310 экстинкций при 1=540 нм и записывают результат. Затем добавляют 0,1 мл рабочего раствора лизоцима, измеряют оптическую плотность и включают секундомер. Спустя 10 минут вновь измеряют оптическую плотность. По разности между исходной и конечной оптической плотностью раствора МЬ и специально выведенной формуле судят об активности фермента:
(К-О) ■ 1000 ■ 2,5
Лак =---------------------: 10,
3,75
или Лак = (К - О) ■ 66,66, где: К - экстинкции исходной пробы МЬ,
О - экстинкции этой же пробы МЬ через 10 мин инкубации,
1000 - разведение лизоцима,
2,5 - число пересчета на объем раствора МЬ, взятого в опыт,
3,75 - коэффициент пересчета,
10 - число минут эксперимента,
66,66 - коэффициент пересчета, полученный после выполнения математических действий в формуле 1.
Определение активности пепсина
Для определения действия препаратов на активность пепсина (Sigma, США) был использован экспресс-метод Н. П. Пятницкого [10]. Субстратом служит молочно-ацетатная смесь (МАС), составленная из равных объемов свежего обезжиренного молока и ацетатного буфера с рН 5,0. Oпpeдeлeниe активности фермента проводится при 25о С.
Ход реакции
В сухую чистую пробирку автоматической пипеткой отмеривается 0,1 мл раствора пепсина и вносится на дно пробирки. Затем пипеткой 5 мл (с широким отверстием) быстро вносится 5 мл МАС и перемешивается. Oднoвpeмeннo включается секундомер. При появлении хлопьев казеина на стенке пробирки секундомер останавливается и отмечается время (в секундах), затраченное на свертывание МАС.
За единицу пепсина Н. П. Пятницким предложено принимать количество фермента, способного 5 мл МАС при 25о С в течение 60 секунд превратить в казеин. Активность пепсина рассчитывают по формуле: а
Пак =------- 1O,
в
где а - 60 сек. - стандартное время для определения активности ферментов,
в - время (сек.), затраченное на свертывание МАС,
1O - коэффициент пересчета на 1 мл жидкости, содержащей пепсин.
Результаты и обсуждение
Ферменты органов пищеварения приводят к дезинтеграции основных питательных веществ (белков, жиров, углеводов) до простых метаболитов (аминокислот, глицерина, жирных кислот, моносахаридов), которые всасываются в тонком кишечнике.
К таким ферментам относятся амилаза и пепсин, а лизоцим обеспечивает бактерицидность ротовой жидкости. Поэтому ингибирование их активности XOri отражается не только на процессах пищеварения, но и на устойчивости к патогенной микрофлоре.
Амилаза - фермент слюнных желез, гидролизующий крахмал до дисахарида мальтозы. И, хотя в процессе пищеварения крахмала в ротовой полости амилаза практического значения не имеет, так как он почти полностью переваривается в тонком кишечнике под действием панкреатической a-амилазы, этот фермент способствует самоочищению полости рта от остатков пищи, делая их углеводы более доступными для сапрофитной микрофлоры.
Лизоцим - фермент, гидролизующий гликозидные связи в муреине, который составляет основу плазматических мембран бактериальных клеток. Тем самым
Действие ХОП на активность амилазы, лизоцима и пепсина
Пестицид Амилаза, ед./мл Лизоцим, ед./мл Пепсин, ед./мл
М±^1 % М±^1 % М±^і %
Контроль 204,20-5,46 100 10,13±1,03 100,0 5,3±0,31 100,0
ДДЕ 183,18-2,63 89,7* 6,77±0,25 66,8* 4,5±0,03 84,9
ДДД 181,59-1,03 88,9* 8,52±0,76 84,1 5,9±0,56 111,3
ДДТ 179,70-4,36 88,0* 9,14±0,66 89,9 6,0±0,50 113,2
a-ГОЦГ 175,61-8,01 86,0* 8,04±0,46 79,3* 5,5±0,39 103,8
у-ГХЦГ 204,60-8,85 100,2 8,15±0,26 80,4* 5,1 ±0,51 96,2
Примечание: * - отмечено р<0,05.
УДК 616. 155. 1: 612. 0151: 615.918
лизоцим поддерживает физиологическую норму сапрофитных бактерий в ротовой жидкости и бактерицидно действует на патогенную микрофлору.
Пепсин - это протеиназа желудочного сока. Он играет очень важную роль в пищеварении пищевых белков. По данным кафедры биохимии КГМУ, в норме в полости желудка под действием пепсина подвергается гидролизу до 30-33% пептидных связей.
С каждым ферментом и каждым ХОП ставили 6-9 совпадающих опытов, результаты которых подвергали вариационной статистической обработке [4] и внесли в таблицу.
Из данной таблицы видно, что амилаза является наиболее чувствительным ферментом по отношению к исследуемым ХОП. Её активность снижается на 10,3-14,0%, что носит статистически достоверный характер. Активность этого фермента не изменяется только при действии у-ГХЦГ.
Активность лизоцима больше всего снижается под действием ДДЕ (33,2%), меньше всего - при действии ДДТ (10,1%). Однако при действии ДДД и ДДТ это снижение из-за большого разброса показателей является статистически недостоверным. Что же касается активности пепсина, то она имеет тенденцию к снижению на 13,2% под действием ДДТ и на 11,3% - под действием ДДД (р> 0,05).
Итак, ХОП обладают способностью в той или иной мере ингибировать активность ферментов амилазы и лизоцима, которые гидролизуют гликозидные связи в крахмале и муреине. Это, вероятнее всего, связано с взаимодействием хлора ХОП с реагеноспособными радикалами, входящими в состав активных центров этих ферментов. А пепсин относится к сериновым ферментам, и для него субстратом являются белки, в которых он гидролизует пептидные связи. Гидроксил серина, входящего в состав активного центра этого фермента, по-видимому, больше замаскирован. Поэтому пепсин более устойчив по отношению к действию ХОП.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бурлакова Т. // Аргументы и факты в Бурятии. 2002. 09, № 36 (1141).
2. Голубовская Е. // Народная газета. 21 апреля 2006 г. Вып. 88-89.
3. Грищенко С. В., Степанова М. Г., Ганенко О. Н., Брагин Ш. Б. / / Вестник гигиены и эпидемиологии. М., 2002. Т. 6, вып. 2. С. 15.
4. Каминский Л. С. Обработка клинических и лабораторных данных. Л., 1959. 312 с.
5. Краснодарская краевая целевая программа «Отходы» на 2004-2013 гг. Краснодар, 2003.
6. Липик Л. // Новости: Здоровье. 23.05.2006.
7. Мазитова Г. // Межд. симп. «Научные основы защиты животных от экоток сикантов, радионуклеидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний». Казань. Агентство национальных новостей. 2005.
8. Максименко О. // Наука и жизнь. Архив. 2003. № 3. С. 32.
9. Надеждина Г. // Панорама. Информ. еженедельник. Находка. 30.04.2006.
10. Пятницкий Н. П. // Клин. медицина. 1965. Т. 33, вып. 4. С. 74.
11. Сторожук П. Г., Анашкина Т. И. Тезисы 2-го Всесоюзного биохимического съезда. Ташкент. 1969, секция 24. С. 90.
12. Сторожук П. Г., Корочанская С. П. Лабор. дело. 1974. № 5. С. 310.
13. De Lorenzo M., Scott G. I., Ross P. E.// Environ. Toxicol. and Chem.: An International Journal. 2001. Vol. 20, № 1. P. 84.
P. G. STOROZHUK, V. V. ONOPRIEV, V. A. PEKHOVA
CHLORIDE-ORGANIC PESTICIDES AND THEIR EFFECT ON ACTIVITY OF DIGESTIVE FERMENTS
In this research we studied (in vitro) effect of COP (DDT, DDD, DDE, a-GCCG и g-GCCG) on activity of digestive ferments (amylase, lysozyme, pepsin).
We determined that amylase is the most sensitive to COP. Its activity statistically and reliably decreases by 11-14% under influence of the studied preparations, except for g-GCCG. All five preparations also inhibit activity of lysozyme. g-GCCG, a-GCCG and DDE have the highest inhibiting effect. Under their influence ferment activity decreases by 19,6, 20,7, 3,2%0 correspondingly. Pepsin activity under influ-ence of DDT and DDE tends to increase by 13,2 and 11,3%o correspondingly.
П. Г. СТОРОЖУК, В. А. ПЕХОВА, В. В. ОНОПРИЕВ
ХЛОРОРГАНИЧЕСКИЕ ПЕСТИЦИДЫ И ИХ ДЕЙСТВИЕ НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ ЭРИТРОЦИТОВ, УЧАСТВУЮЩИХ В ИНИЦИАЦИИ ПРОЦЕССОВ ОКСИГЕНАЦИИ ГЕМОГЛОБИНА
Кубанский государственный медицинский университет, ФГУ «Российский центр функциональной хирургической гастроэнтерологии Росздрава», г. Краснодар
Хлорорганические пестициды (ХОП) относятся к хлорорганические и фосфорорганические соединения
стойким органическим загрязнителям (СОЗ) окружаю- [9]. ХОП способны переноситься на значительные рас-
щей среды. Из-за отсутствия эффективных средств де- стояния от места их применения с воздухом, водными токсикации они в значительных количествах аккуму- стоками и живыми организмами [22]. Хотя из-за своей лируются во внешней среде. Так, из использованных в гидрофобности ХОП не могут проникать в растения че-
прошлом 1,5 млн. тонн ДДТ до настоящего времени в рез корневую систему, но они хорошо поглощаются
природе сохраняется около 70%. В Краснодарском крае листьями из воздушной среды [1]. накоплено 2501,3 т пестицидов, из них около 33% - До 95% ХОП поступает в организм человека
