CC BY
155
Химия растительного сырья. 2011. №4. С. 239-243.
УДК 615.322+58.085
ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ РАСТЕНИЯ И КАЛЛУСНОЙ ТКАНИ DIGITALIS PURPUREA L.
© Я.В. Смольникова , Н.А. Величко
Сибирский государственный технологический университет, пр. Мира, 82, Красноярск, 660049 (Россия), e-mail: [email protected]
Исследован химический, аминокислотный и элементный состав исходного, интактного растений и каллусной ткани наперстянки пурпурной (Digitalis purpurea L.). Выявлено повышенное содержание флавоноидов в каллусной ткани, установлено отличие элементного состава каллусной ткани и интактного растения по степени накопления меди и цинка, определено присутствие в каллусной ткани цистина, отсутствующего в исходном и интактном растениях.
Ключевые слова: наперстянка, Digitalis purpurea L., каллусная ткань, биологически активные вещества, элементный состав, аминокислотный состав.
Введение
Наперстянка (лат. Digitalis) — род травянистых растений, принадлежащий по системе классификации APG II к семейству подорожниковые (Plantaginaceae). Ранее, в системе классификации Кронквиста, растение относили к семейству норичниковых (Scrophulariaceae).
Наперстянка пурпурная (Digitalis purpurea L.) служит природным источником стероидных соединений карденолидов, которые широко применяются в современной фармакотерапии и не имеют синтетических аналогов.
Несмотря на значительное число работ, посвященных разработке условий культивирования наперстянки пурпурной in vitro и цитофизиологическим характеристикам полученной ткани, анализ химического состава полученных культур ограничен данными о содержании гликозидов, белка, хлорофилла и некоторых ферментов [1-5].
Определение основных групп биологически активных веществ, сравнительный анализ элементного и аминокислотного состава каллусной ткани и интактного растения представляет несомненный интерес, дает представление о возможных изменениях метаболической активности, произошедших после дедифференциации клеток, и позволяет оценить промышленную значимость полученного каллусного штамма.
Экспериментальная часть
Исходным материалом для введения в культуру являлись семена D. purpurea L., предоставленные Ивановской НИЛ Всероссийского научно-исследовательского института защиты растений (Ивановская государственная сельскохозяйственная академия имени академика Д. К. Беляева).
Для получения интактных растений семена наперстянки пурпурной стерилизовали и высаживали на агаризованную питательную среду с минеральным составом по Мурасиге и Скугу без добавления гормонов.
Каллусную ткань получали из листовых пластин интактных растений. Культивирование проводили на среде с минеральной основой по Мурасиге и Скугу с добавлением гормонов: ИУК (индолилуксусной кислоты) в концентрации 0,1 мг/л и 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты) в концентрации 0,1 мг/л, на свету (3500 люкс) с фотопериодом 16 ч день, 8 ч ночь, при температуре 22-25 °С, относительной влажности 70%.
Определение суммарного содержания флавоноидов проводили спектрофотометрическим методом с использованием комплексообразующей реакции с алюминия хлоридом [6-9]. Показания снимали в УФ-области при длине волны 410 нм.
Суммарное содержание тритерпеновых соединений определяли гравиметрическим методом [10], содержание аскорбиновой кислоты - титриметрическим методом (реакция Тильмана) [11].
* Автор, с которым следует вести переписку.
Хлорофиллы a, b и каротиноиды определяли спектрофотометрически, измерением оптической плотности вытяжки пигментов при длинах волн, соответствующих максимумам поглощения хлорофиллов a (663 нм), b (645 нм), каротиноидов (440,5 нм) с последующим расчетом концентрации пигментов по уравнениям Ветштейна и Хольма для 100% ацетона [11].
Для определения стериодных гликозидов использовали реакцию активного водородного атома пяти -членного кольца с пикратом натрия (реакция Балье). Общее содержание стериодных гликозидов определяли по методу А.И. Ермакова с изменениями П.М. Лошкарева (Всероссийский НИИ лекарственных и ароматических растений - ВИЛАР) [11]. Метод основан на получении спиртохлороформного экстракта, его дальнейшей очистке и колориметрировании. Для расчета концентрации гликозидов использовали калибровочный график, построенный путем колориметрирования стандартного раствора гликозида (дигоксина).
Для определения минерального состава пробу определенного объема предварительно минерализовали смесью кислот азотной и хлорной при нагревании. Минерализат переносили в мерную колбу и в растворе определяли содержание металлов на атомно-абсорбционном спектрофотометре «Квант-2а» (Россия) [12]. Одновременно проводили холостое определение для выяснения чистоты реактивов. Калибровочные графики строили по растворам соответствующих солей металлов.
Общее содержание белка в исследуемых пробах определяли с помощью красителя амидового черного 10В [13].
Для анализа аминокислотного состава 50 мг пробы переносили в ампулу из толстого стекла и добавляли 20 мл 6N HCl. Ампулу запаивали, гидролиз сухого остатка проводили в термостате при 110 °Св течение 22 ч. После гидролиза содержимое ампулы охлаждали, фильтровали и выпаривали. Сухой остаток растворяли в 20 мл буфера pH 2,2. К 1900 мкл сухого остатка добавляли 100 мкл диметилсульфоксида, после чего 100 мкл раствора пропускали через патрон для очистки раствора аминокислот от примесей. Анализ аминокислот проводили на аминокислотном анализаторе A0326V1 (Knauer, Германия).
Обсуждениерезультатов
Культивирование каллусной ткани в условиях in vitro вызывает изменения метаболической активности клеток. Это выражается в изменении количества и состава биологически активных веществ в каллусной ткани по сравнению с исходным растением. Образовавшаяся клеточная биомасса может не продуцировать часть метаболитов исходного растения или начать синтез новых метаболитов, не присутствующих в материнском растении.
Содержание биологически активных веществ в каллусной ткани наперстянки пурпурной, листьях интактного и исходного растений приведено в таблице 1.
При исследовании состава вторичных метаболитов каллусной ткани и интактного растения наперстянки пурпурной установлено присутствие флавоноидов, тритерпеновых соединений, аскорбиновой кислоты, белка, фотосинтетических пигментов, гликозидов.
В интактном растении и каллусной ткани Digitalis purpurea L. наблюдалось повышенное содержание флавоноидов (1,13 и 1,84% соответственно) относительно исходного растения (0,95%). Содержание тритерпеновых соединений сопоставимо во всех образцах, наименьшее содержание наблюдалось в листьях интактного растения и составило 5,13%. Содержание аскорбиновой кислоты одинаково низкое (0,38-0,68%) в интактном и исходном растениях, в каллусной ткани в 1,79 раза ниже (0,38%), чем в исходном растении.
Максимальное содержание суммарного белка в исходном растении составило 6,75% от а.с.с., в интактном растении и каллусной ткани - 5,52 и 3,76% от а.с.с. соответственно.
Таблица 1. Содержание биологически активных веществ в Digitalis purpurea L.
Биологически активные вещества Содержание, от массы а. с. с.
листья исходного растения листья интактного растения каллусная ткань
Флавоноиды, % 0,95±0,01 1,13±0,03 1,84±0,04
Тритерпеновые соединения,%о 7,05±0,08 5,13±0,05 6,12±0,01
Аскорбиновая кислота,% 0,68±0,04 0,66±0,04 0,38±0,03
Суммарный белок, % 6,75±0,16 5,52±0,08 3,76±0,12
Хлорофилл а, мг % 339,21±0,02 381,17±0,01 132,79±0,03
Хлорофилл Ь, мг % 188,41±0,07 195,31±0,03 102,21±0,05
X хлорофиллов, мг % 527,62±0,09 576,48±0,12 235,78±0,05
Каротиноиды, мг % 2,73±0,04 1,15±0,03 1,23±0,05
X карденолидов, мг/г 0,71±0,03 0,96±0,01 0,67±0,02
Максимальное содержание хлорофиллов обнаружено в интактном растении (576,48 мг %), в исходном растении - незначительно ниже (527,62%). В каллусной ткани суммарное содержание хлорофиллов в 2,24 раза меньше, чем в исходном растении. Согласно литературным данным, снижение концентрации хлорофиллов в каллусной ткани наблюдалось при культивировании Digitalis lanata Ehrh. [14], а также при исследовании фотоавтотрофных и фотомиксотрофных каллусных культур и побегов Digitalis purpurea L. [4].
Суммарное содержание гликозидов в полученном штамме каллусной ткани и в интактном растении сопоставимо с концентрацией в исходном растении - 0,668; 0,960 и 0,701 мг/г соответственно.
Известно, что растения накапливают тяжелые металлы как за счет атмосферных загрязнений, так и поглощая их из почвы. Каллусная ткань в этом случае имеет преимущество перед растительным сырьем, произрастающим в естественных условиях, так как возможен контроль параметров окружающей среды, следовательно, исключается поступление загрязняющих веществ за счет атмосферных осадков.
Результаты исследования содержания минеральных компонентов в каллусной ткани, интактном и исходном растениях приведены в таблице 2.
Как видно из полученных результатов, минеральный состав интактного растения близок по составу к исходному растению. Отличия могут быть обусловлены разным содержанием микро- и макроэлементов в почве и минеральной основе среды, используемой при культивировании растений in vitro.
Несмотря на одинаковую концентрацию микро- и макроэлементов в среде, минеральный состав каллусной ткани отличается от интактного растения содержанием меди и цинка.
В каллусной ткани содержание меди почти в 2 раза больше, а цинка в 2 раза меньше, чем в интактном растении.
Медь играет специфическую роль в жизни растений: регулирует фотосинтез и концентрацию образующихся в растении ингибиторов роста, водный обмен и перераспределение углеводов, входит в состав ферментов, повышает устойчивость к полеганию и способствует их морозо-, жаро- и засухоустойчивости. Можно предположить, что повышенная концентрация меди в каллусной ткани обусловлена компенсаторной реакцией на стресс клеток.
Цинк играет важную роль в белковом, углеводном и фосфорном обмене, биосинтезе витаминов и ауксинов. Можно предположить, что содержание синтетических ауксинов в среде, на которой культивировался каллус, снижает синтез эндогенных ауксинов, и, как следствие, концентрацию цинка в клетках.
Анализ литературных источников показал недостаточность сведений об аминокислотном составе белков растения наперстянки пурпурной и полное отсутствие данных по аминокислотному составу каллусной ткани.
Анализ аминокислотного состава каллусной ткани представляет интерес, так как отличия в протекании метаболических процессов могут выражаться в различии аминокислотного состава белков исходного растения и полученной из него каллусной ткани.
Результаты аминокислотного состава наперстянки пурпурной приведены в таблице 3.
Таблица 2. Элементный состав Digitalis purpurea L.
Наименование элемента Содержание элементов
исходное растение интактное растение каллусная ткань
Fe, мг/кг 440,12 411,54 449,45
Cu, мг/кг 6,21 6,6В 13,16
Zn, мг/кг 141,32 149,31 76,02
Mn, мг/кг 24,56 15,4В 15,55
Cr, мг/кг 0,43 0,69 0,92
K, г/кг 29,61 34,51 30,01
Na, г/кг 1,87 1,89 1,61
Ca, г/кг 2,06 1,80 0,99
Mg, г/кг 2,82 1,75 1,51
Таблица 3. Содержание аминокислот в Digitalis purpurea L.
Наименование
Содержание аминокислот, в % от суммы учтенных аминокислот
аминокислоты исходное растение интактное растение каллусная ткань
Аспарагиновая кислота 12,75 11,36 9,66
Треонин 5,18 4,65 4,77
Серии 5,61 7,86 5,44
Глутаминовая кислота 16,28 17,86 21,14
Глицин 5,98 8,43 5,01
Аланин 5,70 7,01 5,64
Валин 6,01 5,89 6,07
Цистин - - 0,24
Метионин 3,32 2,92 1,74
Изолейцн 5,21 3,99 4,93
Лейцин 8,81 10,25 8,16
Тирозин 4,45 2,33 4,93
Фенилаланин 5,61 5,28 5,13
Гистидин 3,06 1,33 3,00
Лизин 9,35 2,55 7,85
Аргинин 6,53 6,81 6,31
В различных образцах наперстянки обнаружено 16 аминокислот. В каллусной ткани, как и в растениях, наблюдалось наибольшее содержание аспарагиновой и глутаминовой кислот. Аспарагиновая кислота синтезируется путем прямого аминирования, аланин и глутаминовая кислота образуются в результате восстановительного аминирования и являются первичными. Все остальные аминокислоты являются вторичными, поскольку образуются в результате реакций переаминирования указанных выше аминокислот с соответствующими кетокислотами, возникающими в процессе обмена веществ, а также путем превращения одних кислот в другие [15]. Сведения о содержании первичных аминокислот могут дать важную информацию о наличии связи ме^ду первичным и вторичным метаболизмом.
Содержание первичных аминокислот в листьях интактного растения составило 36,05%, в исходном растении - 34,73%, в каллусной ткани - 36,64%.
Характерным отличием аминокислотного состава общего белка каллусной культуры является присутствие цистина в количестве 0,24%, при полном его отсутствии в интактном и исходном растениях. Известно, что цистин образуется из двух молекул аминокислоты цистеина. В синтезе цистеина, в свою очередь, участвует аминокислота метионин, содержание которой в интактном и исходном растениях больше почти в 2 раза.
Выводы
1. Определено содержание биологически активных веществ в каллусной ткани наперстянки пурпурной, листьях интактного и исходного растений. Установлено повышенное содержание флавоноидов в каллусной ткани на фоне снижения концентрации хлорофиллов, аскорбиновой кислоты и белка. Суммарное содержание гликозидов в полученном штамме каллусной ткани и в интактном растении сопоставимо с концентрацией в исходном растении и составило 0,668; 0,960 и 0,701 мг/г соответственно.
2. Установлен элементный состав каллусной ткани, интактного и исходного растения, выявлены отличия в накоплении меди и цинка в каллусной ткани и в интактном растении.
3. Проанализирован аминокислотный состав белка каллусной ткани, интактного и исходного растения. В каллусной ткани обнаружена аминокислота цистин, отсутствующая в растениях.
Список литературы
1. Hagimori M., Matsumoto T., Kisaki T. Studies on the production of Digitalis cardenolides by plant tissue culture I. Determination of digitoxin and digoxin contents in first and second passage calli and organ redifferentiating calli of several Digitalis species by radioimmunoassay // Journal Plant & Cell Physiology. 1980. V. 21, N8. Pp. 1391-1404.
2. Hagimori M., Matsumoto T., Obi Y. Studies on the Production of Digitalis cardenolides by plant tissue culture II. Effect of light and plant growth substances on digitoxin formation by Undifferentiated cells and shoot-forming cultures of Digitalis purpurea L. grown in liquid media // Journal Plant & Cell Physiology. 1982. V. 69. Pp. 653-656.
3. Manabu H., Takashi M., Obi Y. Studies on the Production of Digitalis cardenolides by plant tissue culture III. Effects of nutrients on digitoxin formation by shoot-forming cultures of Digitalis purpurea L. grown in liquid media // Journal Plant & Cell Physiology. 1982. V. 23. N7. Pp. 1205-1211.
4. Hagimori M., Matsumoto T., Yoichi M. Photoautotrophic culture of undifferentiated cells and shoot-forming cultures of Digitalis purpurea L. // Journal Plant & Cell Physiology. 1984. V. 25. N6. Pp. 1099-1102.
5. Ghanem S.A., Aboul-Enein A.M., El-Sawy A., Rady M.R., Mona M.I. In vitro propagation and cardiac glycosides content of Digitalis lanata // International journal of academic research. 2010. V. 2. N6. Part II. Pp. 349-356.
6. МиназоваГ.И., Денисова С.Б., Данилов В.Т. Спектрофотометрическое определение суммы флавоноидов в сборе «Гепафит» // Фармация. 1997. № 1. С. 27-28.
7. Лякина М.Н., Виноградов А.К. Определение содержания суммы флавоноидов в траве душицы обыкновенной // Фармация на современном этапе — проблемы и достижения. М., 2000. Т. XXXIX. Ч. 2. С. 74-79.
8. Компанцева Е. В., Айрапетова А. Ю. Идентификация и количественное определение флавоноидов в многокомпонентном лекарственном средстве кардиотонического действия // Фармация. 2000. №1. С. 40-41.
9. Государственная фармакопея СССР. Вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье. М., 1989. 400 с.
10. Химический анализ лекарственных растений / под ред. Гринкевич Н.И., Сафронич Л.Н. М., 1983. 176 с.
11. Ермаков А.И. Методы биохимического исследования растений. Л., 1987. 320 с.
12. Брицке М.Э. Метод атомной абсорбции. Атомно-абсорбционный спектрохимический анализ. М., 1982. 222 с.
13. БузунГ.А., Джемухадзе К.Н., Милешко Л.Д. Определение белков в растениях с помощью амидо-черного // Физиологиярастений. 1982. Т. 29. №1. С. 198-204.
14. Fatima Z., Mujib A., Fatima S., Arshi A., Umar S. Callus induction, biomass growth, and plant regeneration in Digitalis lanata Ehrh.: influence of plant growth regulators and carbohydrates // Turk J Bot. 2009. V. 33. Pp. 393-405.
15. Филиппович Ю.Б. Биологическая химия: учебное пособие для студентов вузов. М., 2008. 254 с.
Поступило в редакцию 21 февраля 2011 г.
После переработки22 сентября 2011 г.
