CC BY
56
adenylyl cyclase system in rabbit airway epithelium // Am. J. Respir Cell. Mol. Biol. -1994. - Vol. 2, №3.
- P. 287-295.
11. Meurs H., Kauffman H.F., Koeter G.H. et al. Regulation of the beta-receptor - adenylate cyclase system in lymphocytes of allergic patients with asthma: possible role for proteinkinase C in allergeninduced nonspecific refractoriness of adenylate cyclase // J. Allergy. -1987- Vol. 80, №1 - P. 326-329.
12. Morales-Olives F. Y., Morgillo E., Alpha-adrenerges receptors in respiratory airways // J. Pharmacol. -1982- Vol. 13, №1. -P. 173-174.
13. Wijkamp F.P., Henricks P.A. Receptors in airway disease. Beta-adrenoreceptors in lung inflammation // Am. Rev. Respir. Dis. -1990-. -Vol. 141, №3. - P. 145-150.
14. Raaijmakers J.A.M., Beneker C., van Geffen E.C.G. et al. Inflammatory mediators and p-adrenoreceptor function //Agents Actions. -1989. -Vol. 26, №1-2. - P. 45-47.
15. Oral inhaled asthma therapy. Proc. Cons. Combinations Fabbri L. M., Piattela M., Caramori G., Liaccia A. // Drugs -1996. -Vol. 52, №6 - P. 20-28.
16. Fuchs-Egli P. Therapie des Asthma bronchiale // Therapiewoche Schweiz. -1998. -Bd. 14, №2. - S. 64-66.
a a a
УДК 616.248:628.9.031/.032+612.015.36:612.112 М.Т.Луценко, И.А.Плюснина
ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ И ГИСТОХИМИЯ ЛЕЙКОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БОЛЬНЫХ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ
РЕЗЮМЕ
С помощью гистохимических и хемилюми-несцентных методов проведён анализ активности нейтрофилов периферической крови больных, страдающих бронхиальной астмой.
В период обострения, когда в организме резко повышается уровень продуктов перекис-ного окисления липидов и подавляется антиоксидантная реакция периферической крови, нейтрофилы отвечают на это состояние бурной ферментативной реакцией: усиливается сук-цинатдегидрогеназная, оксидазная (М и О), а также гидролитическая активность в широком спектре метаболической среды (при рН 5,7; 6,2 и 6,7).
На этом фоне на биохимическом уровне появляется пик окислительных процессов в лейкоцитах периферической крови, регистрируемых методом хемилюминесценции как на базальном, так и стимулированном уровнях.
После проведённого курса лечения акола-том, способствующего подавлению процесса образования лейкотриенов, у этих же больных в 90% случаев отмечалось резкое снижение базовой и стимулированной хемилюминесцен-ции лейкоцитов, а в их цитоплазме гистохимическими методами отмечено снижение реакции на окислительные (суцинатдегидрогеназа, ми-элопероксидаза, оксидазы М и О) и гидролитические (кислая фосфомоноэстераза при рН 5,7; 6,2 и 6,7) ферменты.
SUMMARY M.T.Lutsenko, I.A.Plusnina
LEUCOCYTE CHEMILUMINESCENCE AND HISTOCHEMISTRY IN PERIPHERAL BLOOD OF PATIENTS WITH BRONCHIAL ASTHMA
We analyzed neutrophil activity in peripheral blood of patients with bronchial asthma with histochemical and chemilumi-niscent methods.
During exacerbation period, lipid peroxide oxidation products are sharply increased and antioxidant peripheral blood responsiveness is depressed. Neutrphils show rapid enzyme reaction: succinatede-hydrogenase, oxidase (M and C) and hydrolytic activity is decreased in a broad metabolic range (pH 5,7; 6,2; 6,7).
Chemiluminescence showed oxide process peak in peripheral blood leucocytes at basal and stimulated levels.
90% of patients treated with acolate, inhibiting leukotriene development, showed decreased basic and stimulated leucocyte chemiluminiscence. Histochemical methods showed decreased reaction to oxide (succinat-edehydrogenase, myeloperoxidase, oxidase M and G) and hydrolytic (acid phosphomono-esterase with pH 5,7; 6,2; 6,7) enzymes.
Заболевания органов дыхания сопровождаются выраженной воспалительной реакцией [1, 2, 9]. Интенсификацию воспаления в настоящее время связывают с усилением свободнорадикальных процессов в легких. Основное значение при этом имеют активные формы кислорода (АФК), генерируемые фагоцитирующими клетками [10]. Стимуляция поверхности нейтрофила обычно связана со значительным увеличением метаболической активности, иногда называемой респираторным взрывом. Активаторами метаболической активности могут служить конканавалин А (КонА), фтористый натрий (МаР), форболмиристатацетат (ФМА), инофор А, активированные сывороткой частицы зимозана, частицы латекса, а также различные микроорганизма, покрытые соответствующими опсонинами.
Во время стимуляции фагоцитов возрастает поглощение кислорода, и появляются его высокореактивные метаболиты. В нейтрофилах этот процесс начинается через 30-60 с после стимуляции клеточной поверхности и не сопровождается ни фагоцитозом, ни секрецией лизосомальных ферментов, хотя эти три процесса обычно происходят одновременно. Среди активных производных кислорода в нейтрофилах обнаружены супероксид анион-радикал (О2), пероксид водорода (Н2О2), гидроксильный радикал (ОН ) и возможно, синглетный кислород (О2). Помимо нейтрофилов эти вещества вырабатываются также моноцитами, макрофагами, тучными клетками, базофилами, эозинофила-ми.
Производные кислорода способны повреждать ткани и микроорганизмы как сами по себе, так и в комбинации с другими компонентами нейтрофилов (например, с миелопероксидазой, активируемой Н2О2). Образование метаболитов кислорода в нейтрофилах, по-видимому, необходимо для эффективного уничтожения микроорганизмов. Весь кислород или его большая часть первоначально превращается в супероксидант-ный анион (О2), 80% которого в свою очередь превращаются в Н2О2 - спонтанным или ферментативным путем.
Ферментом, осуществляющим образование аниона, является, скорее всего, устойчивая к цианиду флаво-протеин-оксидаза, использующая в качестве донора электронов НАДФН, хотя данные по этому поводу противоречивы.
Одновременно повышается проницаемость клеточной мембраны для ионов Са2+ и активация фосфолипа-зы и 5-липооксигеназы. Под действием указанных ферментов идет метаболизм арахидоновой кислоты с образованием лейкотриенов, что стимулирует миграцию, агрегацию клеток и высвобождение биологически активных веществ. Ингибиторы фермента 5-липоксигеназы эти процессы подавляют, кроме того, лейкотриены могут стимулировать поступление Са2+ в клетку. Высокореактивные метаболиты кислорода, по-видимому, принимают участие в процессе хемилюми-несценции (ХЛ) фагоцитирующих клеток.
Существует гипотеза о том, что индукция хемилю-минесценции в нейтрофилах связана с образованием синглетного кислорода. Однако не исключены и другие возможности, например, взаимодействие пероксидазы галида и пероксида водорода с образованием метаста-бильных продуктов обмена, или участие продуктов деятельности липооксигеназы. Однако уже сейчас ясно,
что люминесценция нейтрофилов прямо или косвенно зависит от наличия аниона супероксида, поскольку этот процесс подавляется супероксиддисмутазой; кроме того, люминесценция может быть получена в присутствии изолированной системы образования супероксида [6, 7].
Активные формы кислорода играют значительную роль в патогенезе бронхиальной астмы (БА). Среди факторов подтверждающих это, прежде всего, следует назвать результаты опытов, проведенных японскими учеными, показавшими, что АФК являются одним из медиаторов, вызывающих бронхоконстрикцию, а, следовательно, медиатором приступа бронхиальной астмы. Опыты проводились на кошках, которым в дыхательные пути в виде аэрозоля вводили систему ксантиноок-сидаза-ксантин, генерировавшую АФК, в результате чего развивалась бронхоконстрикция. Предварительное введение супероксиддиамутазы или каталазы, конъюгированной с полимером, достоверно ингибировало бронхоконстрикцию. Наряду с этим установлено, что классический медиатор бронхиальной астмы гистамин в дозе 10-5 м реализует свое бронхокострикторное действие не только ранее известным прямым влиянием на гладкомышечные клетки бронхов, но и путем стимуляции генерации АФК, которые являются медиаторами бронхоконстрикции и приступа бронхиальной астмы. В норме гистамин in vitro, как правило, оказывает ингибирующее влияние на хемилюминесценцию (в среднем базальный показатель снижается в 2 раза, а при стимуляции в 1,2 раза). При бронхиальной астме происходит растормаживание генерации АФК лейкоцитами от ингибирующего влияния гистамина, благодаря чему образование АФК усиливается. Сходные с этим данные получены и для другого классического медиатора бронхиальной астмы - ацетилхолина.
Открытие АФК, являющихся тригерами свободнорадикального перекисного окисления липидов (ПОЛ), привлекло к себе внимание ученых практически во всех областях медицины [8]. Однако накопившиеся данные литературы относительно роли свободнорадикальных кислородных и липидных процессов при бронхиальной астме малочисленны и противоречивы [2, 5]. Некоторые авторы обнаружили усиление генерализации АФК лейкоцитами у больных бронхиальной астмой, другие -не выявили существенных различий ее у больных БА и здоровых. Ряд авторов утверждают, что при БА усиливается ПОЛ и снижается антиоксидантная активность, другие наоборот, выявили ее увеличение [3, 4].
Материал и методы
Целью работы было изучение генерации АФК лейкоцитами у больных БА. Больные обследованы в период обострения и ремиссии. Для получения лейкокон-центрата кровь забирается из локтевой вены утром, натощак. В сухую центрифужную пробирку вносятся
0,5 мл раствора гепарина и до 5 мл крови. Для осаждения эритроцитов кровь отстаивается 30 мин при комнатной температуре. Обогащенная лейкоцитами плазма осторожно отстаивается пастеровской пипеткой в чистую пробирку и сразу же используется для анализа.
Затем проводится подсчет концентрации лейкоцитов. АФК определяли методом люминолзависимой хе-милюминесценции, на хемилюминометре при 37° С. В
первую кювету помещали исследуемую суспензию (100 мкл) + 100 мкл физиологического раствора. Во вторую - 100 мкл клеток + 100 мкл физиологического раствора + 1 мкл аколата. В третью кювету добавлялась к основному раствору арахидоновая кислота. Опытные и контрольные пробы инкубировали 5 мин, после чего извлекали, добавляли по 40 мкл люминола и регистрировали хемилюминесценцию до выхода на плато-максимум, что соответствовало базальному показателю ХЛ. Затем добавляли опсонизированного зимозана по 40 мкл и продолжали измерение до второго плато-максимума (что соответствовало стимулированному показателю ХЛ). После измерения ХЛ производили расчёты:
- показатель интенсивности ХЛ лейкоцитов: базальный показатель интенсивности (ХЛ) и стимулированный опсонизированным зимозаном (ХЛс);
- коэффициент стимуляции Кх=ХЛс/ХЛб.
Результаты
В ходе проведенных исследований мы обнаружили у больных бронхиальной астмой в фазе обострения по сравнению со здоровыми донорами повышение генерации АФК.
На стадии обострения заболевания у больных бронхиальной астмой в плазме периферической крови резко повышается содержание продуктов пе-рекисного окисления липидов: при обострении -1,7-2,0 нмоль/мл (у здоровых доноров содержание MDA зарегистрировано на уровне 1,23 нмоль/мл). Содержание а-токоферола в это время у обследованных пациентов с бронхиальной астмой не превышало 2,0 мкг/мл (здоровые лица содержат в среднем до 3,5 мкг/мл).
Изучение ферментативной активности нейтрофилов периферической крови у больных с бронхиальной астмой в период обострения заболевания показывает усиление интенсивности реакции на сукцинатдегидрогена-зу (рис. 1 а), миэлопероксидазу (рис. 1 б), оксидазу М (рис. 1 в), G (рис. 1 г), а также гидролитические ферменты (кислая фасфатаза) при рН 5,7; 6,2 и 6,7 (рис. 1 г, д, е). Такая реакция обусловлена, по-видимому, стимуляцией ацетилхолином активности АФК и ослаблением тормозного влияния гистамина на генерацию АФК лейкоцитами.
Цепь событий начинается от взаимодействия тучных клеток с антигеном. При достаточном уровне накопления антигенов в крови происходит выброс в периферическую кровь тучными клетками хемотак-сических компонентов, что и приводит к ферментативной активности нейтрофилы и эозинофилы. Под влиянием гистамина усиливается свободнорадикальное окисление арахидоновой кислоты и усиление перекисного окисления липидов в нейтрофилах и эозинофилах периферической крови (рис. 1 а - е).
Регистрируя с помощью метода хемилюминесцен-ции интенсивность окислительной активности нейтро-филов мы отмечаем, что у больных с бронхиальной астмой на стадии обострения заболевания отмечается повышенная базальная и стимулированная хемилюми-несценция (рис. 1 ж). Больные прошедшие курс лечения аколатом показывают низкий уровень базальной и стимулированной люминесценции (рис. 2). Моделирование этих ситуаций в опытах показали (рис. 2, 3), что если в инкубационную среду добавлять раствор аколата ба-
зальная хемилюминесценция снижается, а при введении в раствор арахидоновой кислоты базальная и стимулированная хемилюминесценция повышаются. Одновременно после проведения курса лечения аколатом мы наблюдали в нейтрофилах периферической крови снижение до нормы интенсивности сукцинатдегидро-геназной (рис. 3), оксидазной (рис. 4 а, б) и гидролитической активности (рис. 4 в, г, д).
Обсуждение
Полученные данные, свидетельствующие об активации свободнорадикальных кислородных и липидных процессов и угнетении антиперекисной активности плазмы при БА, подтверждают имеющиеся в литературе сообщения по этому вопросу, и позволяют предположить патогенетическую роль этих факторов в развитии этого заболевания.
По-видимому, в процессе аллергической реакции при взаимодействии тучной клетки с антигеном происходит выброс биологически активных веществ, среди которых имеются и хемотаксический фактор. Последний вызывает возбуждение нейтрофилов и эозинофи-лов, которые начинают усиленно генерировать АКФ, что в свою очередь приводит к выбросу тучными клетками гистамина, с одной стороны, а с другой - усиливает свободнорадикальное окисление арахидоновой кислоты, т.е. вызывает усиление ПОЛ в нейтрофилах и эозинофилах, продуктами метаболизма которых являются такие сильные бронхоконстрикторы, как лейкот-риены.
Кроме того, АФК повреждают клеточные мембраны и увеличивают их проницаемость, участвуют в повреждении тканей иммунными комплексами, что может приводить к воспалению мелких бронхов, потенцированию и пролонгированию приступов удушья.
Обобщая изложенные выше данные, можно заключить следующее:
1. АФК играют медиаторную роль в патогенезе бронхиальной астмы.
2. Гистамин и ацетилхолин реализуют свое патогенное действие отчасти через АФК.
3. В периферической крови больных бронхиальной астмой на стадии обострения резко повышается интенсивность окислительных (сукцинатдегидрогеназа, ми-элопероксидаза, оксидаза) и гидролитических ферментов (кислые фосфомоноэстеразы при рН 5,7; 6,2 и 6,7), что способствует энергетическому внутриклеточному «взрыву».
4. В фазе обострения у больных БА возрастают базальная и стимулированная хемилюминесценция лейкоцитов. В фазе ремиссии у больных БА снижается базальная и стимулированная ХЛ лейкоцитов, однако они остаются выше нормы.
5. БА по особенностям патогенеза в значительной степени является фагоцитозависимой кислородной свободнорадикальной патологией типа аутоагрессии следует отметить, что представленные выше данные хорошо согласуются с принятым ныне представлением о том, что БА - это заболевание характеризующееся обратной обструкцией дыхательных путей, вызванной их воспалением и гиперреактивностью, поскольку АФК и гистамин являются медиаторами как БА, так и воспаления.
Рис. 1. Ферментативная активность нейтрофилов периферической крови человека, страдающего бронхиальной астмой в период обострения заболевания. Увеличение х 90. а - высокая активность сукцинатдегидрогеназы. Реакция по Шелтон-Шнейдеру; б - интенсивная реакция на миэлопероксидазу. Окраска по Грэхему; в - активность оксидазы М. Реакция по Винклеру-Шульце; г - активность (высокая) оксидазы G;
д - интенсивная реакция кислой фосфомоноэстеразы при рН 5,7. Реакция Гомори; е - интенсивная реакция кислой фосфомоноэстеразы при рН 6,2. Реакция Гомори; ж - высокая интенсивность реакции на кислую фосфомоноэстеразу при рН 6,7. Реакция по Гомори.
Рис. 2. Интенсивность хемилюминесценции лейкоцитов периферической крови человека с бронхиальной астмой до лечения аколатом. Базовая (ХЛб) и стимулированная (ХЛс) хемилюминесценция лейкоцитов высокие по сравнению с показателями после лечения.
1 - интактная взвесь клеток,
2 - после добавления аколата,
3 - после добавления арахидоновой кислоты.
Рис. 3. Интенсивность хемилюминесценции лейкоцитов периферической крови человека с бронхиальной астмой после проведения курса лечения. Базовая (ХЛб) и стимулированная (ХЛс) хемилюминесценция лейкоцитов снижены по сравнению с начальным этапом (до лечения).
1 - интактная взвесь клеток,
2 - взвесь, содержащая аколат,
3 - взвесь, содержащая арахидоновую кислоту.
б
а
в
г д е ж
Рис. 4. Интенсивность ферментативной активности нейтрофилов периферической крови человека, страдающего бронхиальной астмой после курса лечения аколатом. Увеличение х 90. а - интенсивность реакции на сукцинатдегидрогеназу резко снизилась по сравнению с периодом обострения заболевания. Реакция по Шелтон-Шнейдеру; б - интенсивность реакции на миэлопероксидазу значительно ниже по сравнению с периодом обострения заболевания. Реакция по Грэхему; в - интенсивность реакции на оксидазу М ниже по сравнению с периодом обострения заболевания.
Реакция по Винклеру-Шульце; г - интенсивность реакции на оксидазу в несколько снижена по сравнению с периодом обострения заболевания. Реакция по Винклеру-Шульце; д - интенсивность реакции на кислую фосфомоноэстеразу при рН 5,7 снижена по сравнению с периодом обострения заболевания. Реакция по Гомори; е - реакция на кислую фосфомоноэстеразу при рН 6,2 значительно снижена по сравнению с периодом обострения заболевания. Реакция по Гомори; ж - интенсивность реакции на кислую фосфомоноэстеразу при рН 6,7 резко снижается по сравнению с периодом обострения заболевания. Реакция по Гомори.
ЛИТЕРАТУРА
1. Балтийская Н.В., Коркина Л.Г., Селиванов И.И. и др. Исследование хемилюминесценции изолированных полиморфноядерных лейкоцитов и цельной крови у больных острыми пневмониями//Тер.архив.-1991.- Т.63, № 12.- С. 23-27.
2. Болевич С., Даниляк И.Г., Коган А.Х. и др. Роль свободнорадикальных процессов в патогенезе бронхиальной астмы // Пульмонология.-1995.- № 1.- С. 18-28.
3. Болевич С., Даниляк И.Г., Коган А.Х. Новые доказательства включения активных форм кислорода в патогенез бронхиальной астмы // Клиническая медици-на.-1997.- № 8.- С. 34-36.
4. Даниляк И.Г., Коган А.Х., Болевич С. Свободнорадикальные кислородные липидные процессы и антиоксидантная защита у больных бронхиальной астмой // Тер. архив.-1992.- Т. 64, № 3.- С. 54-57.
5. Влияние СО2 на генерацию АФК лейкоцитами крови у больных бронхиальной астмой / И.Г.Даниляк, А.Х.Коган, А.В.Сумароков, С.Болевич // Пульмоноло-гия.-1995.-№ 3.- С. 79-84.
6. Иммунология: В 3-х т. Т.З: Пер. с англ. / Под ред. У.Пола.- М.: Мир, 1989.- 360 с.
7. Генерация активных микробоцидных форм кислорода лейкоцитами при прохождении через сосудистое русло легких / А.Х.Коган, Н.И.Лосев, А.Б.Цибин, Б.М.Мануйлов // Бюл. эксперим. биол. и мед.-1989.- №
6.- С. 685-688.
8. Коган А.Х., Даниляк И.Г., Стремухов А.А. Реакция генерации АФК лейкоцитами на гистамин при различных формах и тяжести обострения бронхиальной астмы // Пульмонология.-1995.- № 3.- С. 30-34.
9. Пыцкий В.И., Филатов О.Ю. К механизму специфического подавления стимулированной хемилюминес-ценции полиморфноядерных лейкоцитов при аллергических процессах // Бюл. эксперим. биол. и мед.-1994.- №
3.- С. 299-302.
10. Развитие свободнорадикальных процессов при экспериментальном брнхоспазме. Влияние бронхорасширяющего препарата тровентола / Б.Х.Ягмуров, А.А.Тимофеев, С.К.Сеодаев, А.Г.Чучалин // Бюл. эксперим. биол. и мед.-1994.- № 6.- С. 619-622.
