Некоторые показатели энергозависимой системы нейтрофилов периферической крови у беременных с хронической герпес-вирусной инфекцией Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 618.2/3:616.523:616.155.34:612.112.1 А.С.Соловьева

НЕКОТОРЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ ЭНЕРГОЗАВИСИМОЙ СИСТЕМЫ НЕЙТРОФИЛОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У БЕРЕМЕННЫХ С ХРОНИЧЕСКОЙ ГЕРПЕС-ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ

ГУ Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания СО РАМН

РЕЗЮМЕ

С целью исследования окислительных процессов в нейтрофилах периферической крови с учетом энергозависимых систем проведено исследование опсоно-фагоцитарной и метаболической характеристики этих клеток у женщин с хронической герпес-вирусной инфекцией (ХГВИ) на разных этапах беременности. Использованы методы по определению фагоцитарного звена иммунитета, хемилюминесцентный анализ, а также гистохимическое определение сукцинатдегидрогеназ-ной и аденозинтрофосфатазной (АТФазной) активности. Подтверждено, что герпес-вирусная

инфекция оказывает влияние на характер окислительно-восстановительных процессов в лейкоцитах периферической крови. Обострение ХГВИ приводит к усилению фагоцитарного и хемилю-минесцентного ответа за счет увеличения энергетических процессов, сопровождающихся повышением уровня активности сукцинатдегидрогеназы и снижением АТФазной активности нейтрофилов. Латентное течение ХГВИ характеризовалось снижением хемилюминесценции и метаболических процессов гранулоцитарных клеток.

SUMMARY

A.S.Solovieva

ENERGY-DEPENDENT NEUTROPHIL SYSTEM VALUES IN PERIPHERAL BLOOD IN PREGNANT PATIENTS WITH CHRONIC HERPES VIRUS INFECTION

To study oxidizing processes on peripheral blood neutrophils subject to energy-dependent systems we investigated their opson - phagocyte characteristics in patients with chronic herpes infection (CHI) during different gestation periods. We determined immunity phagocyte component, and carried out chemoluminiscent analysis and histochemical analysis of succinate dehydroge-nate and ATP activity. It was established that herpes infection affects oxidation-reduction processes in peripheral leukocytes. CHI exacerbation leads to increased phagocyte and chemoluminiscent response resulting from enhanced energy processes, accompanied by increased succinate dehydrogenate activity and decreased ATP activity in neutrophils. Latent course of CHI was characterized by decrease in chemoluminiscence and metabolic processes in granulocytes.

Герпетическая инфекция, возникшая, вероятнее всего с появлением биологической жизни на земле, являясь одной из самых древних патологий, сопровождающих человека, не потеряла свою актуальность

и в настоящее время [5]. Учитывая то, что существует возможность проникновения вируса через плаценту и заражения плода [14], герпес-вирусная инфекция занимает одно из ведущих причин перинатальной смертности.

У больных с инфекцией вируса простого герпеса (ВПГ) имеет место иммунодефицитное состояние, сопровождающееся угнетением функциональной активности иммунокомпетентных клеток и клеток мо-ноцитарно-макрофагального ряда [3].

В последние годы вырос интерес ученых к изучению роли факторов неспецифической резистентности в противовирусном иммунитете. Объяснением этому служит то, что компоненты неспецифической резистентности организма, являясь более древними механизмами защиты организма, вносят определенный вклад в комплекс ответных реакций организма на вирусную инфекцию. Кроме того, по времени эти события предшествуют развитию специфической иммунной реакции [8, 16]. Неполноценность многих факторов неспецифической резистентности организма при ХГВИ, наряду с разбалансировкой систем Ти В-клеточного иммунитета, которым отводится решающая роль в противовирусной защите, отмечена и другими авторами [14].

Известно, что ВПГ тесно взаимодействует с лейкоцитами. При этом наблюдаются грубые повреждения хромосом и большие скопления антигена ВПГ в лейкоцитах [3].

Зрелые нейтрофилы - это высокодифференцированные, не способные к дальнейшей пролиферации клеточные эффекторы, содержащие богатейший набор готовых к употреблению биологически активных субстанций [13, 17]. Сочетание готового эффектор-ного потенциала со способностью к быстрой его мобилизации делает нейтрофилы одним из главных участников ранней ответной реакции на любые изменения, происходящие в тканях организма [1].

При стимуляции нейтрофилов различными агентами (зимозаном, частицами латекса и др.) происходит быстрое изменение внутриклеточных метаболических процессов, при котором одновременно возрастают потребление и окисление глюкозы в реакциях гексозомонофосфатного шунта, поглощение кислорода и продукция ряда биологически высокоактивных форм кислорода: суперактивного анион-радикала, гидроксильного радикала, перекиси водорода и, возможно, синглетного кислорода. Эта серия метаболических реакций объединяются термином «респираторный взрыв». Биохимической основой респираторного взрыва является оксидаза - фермент, который при соответствующей стимуляции катализирует одноэлектронную редукцию кислорода. При этом расходуется никотинамидадениндинуклеотид-фосфат (НАДФН), который оксидаза нейтрофилов при респираторном взрыве использует в качестве донора электронов. В процессе респираторного взры-

ва глюкоза, окисляясь в реакциях гексозомонофос-фатного шунта, вновь восстанавливает НАДФ+ в НАДФН. Известно, что нейтрофилы содержат большое количество гликогена, являющегося главным источником энергии. Высокий уровень АТФ в цитоплазме способствует ускорению синтеза глюкозы из предшественников, не относящихся к углеводам. В течение дыхательного взрыва клетка секретирует протоны [10]. Хемилюминесценция (ХЛ) вследствие выхода протонов, которая сопровождает «дыхательный взрыв», может использоваться для регистрации этого типа клеточной реакции [7, 9]. К тому же, при герпесвирусной инфекции меняется характер окислительно-восстановительных процессов. Сукцинатде-гидрогеназа (СДГ) является одним из представителей системы ферментов цикла трикарбоновых кислот и участвует в окислительных процессах.

В ранее опубликованных наших работах были представлены результаты по опсоно-фагоцитарной характеристике лейкоцитов периферической крови у женщин с хронической герпесной инфекцией на разных этапах беременности [11, 12]. В основе развития этих биохимических процессов находятся изменения в цитоплазме нейтрофилов на гистохимическом уровне, которые различны в период обострения и ремиссии герпес-вирусной инфекции и требуют определенные энергетические затраты. Поэтому целью нашей работы явилось исследование окислительных процессов в лейкоцитах периферической крови с учетом энергозависимых систем с помощью определения сукцинатде-гидрогеназной и аденозинтрофосфатазной (АТФазной) активности этих клеток при ХГВИ.

Материалы и методы исследования

Проводилось обследование 79 женщин в возрасте от 18 до 36 лет. Обострение хронической герпесвирусной инфекции на разных этапах гестации отмечалось у 26 беременных, а 38 женщин обследованы в период латентного течения ХГВИ. Диагноз устанавливался клинически на основании жалоб, анамнестических данных и характерных морфологических элементов высыпаний (локальная эритема, сгруппированные везикулы, эрозии, покрытые сероватым налетом с тенденций к слиянию). Диагноз подтверждался обнаружением специфических к вирусу простого герпеса иммуноглобулинов класса М, регистрируемых иммуноферментным анализом. Группой контроля явились 22 практически здоровых беременных, не имеющие никакой гематологической, соматической и аллергической патологии и отягощенной наследственности по аллергическим заболеваниям в анамнезе.

С целью коррекции иммунного и интерфероново-го статуса применяли курс терапии иммуноглобулином с титром антител (АТ) к вирусу простого герпеса (во II триместре беременности) и «Виферон» (150000 ME) [15].

В качестве материала исследования взята периферическая кровь вышеописанных групп женщин. Лей-коконцентрат получали путем отстаивания гепарини-зированной крови в термостате при температуре 37°С в течение 20-30 минут.

Объектом фагоцитоза служила культура Staphylococcus aureus (209 музейный штамм) в концентрации 500 млн микр. тел в 1 мл. В пробирку с лейкоцитарной взвесью вносили микробную культуру в рабочем разведении (соотношение 1:1) и перемешивали однократ-

но пипеткой. Смесь ставили в термостат при 37°С на 30 мин. (с целью определения поглотительной способности). Приготовленные из микробно-лейкоцитарной взвеси, препараты окрашивали по Романовскому-Гимзе и подсчитывали фагоцитарную активность и коэффициент завершенности фагоцитоза [4].

Для проведения ХЛ - анализа 100 мкл приготовленной лейковзвеси (в конечной концентрации 200/мкл) помещали в кювету для сцинтилляционного счетчика (хемилюминометр СЬ-3603 ПО «Диалог», Россия) и регистрировали фоновый показатель ХЛ в течение 3-4 циклов. После добавления 40 мкл насыщенного изоосмолярного водного раствора люмино-ла (5,6 *10-4 М, рН 7,85) и 40 мкл фагоцитирующих частиц (опсонизированный зимозан) определяли, соответственно, базальный показатель интенсивности ХЛ и стимулированный показатель интенсивности ХЛ. Индекс активности ХЛ оценивали соотношением индуцированной зимозаном ХЛ к базальному уровню [2].

Ферментативную активность сукцинатдегидроге-назы и АТФазы в нейтрофилах периферической крови определяли гистохимическими методами [6].

Результаты и обсуждения

В I триместре беременности у женщин с остро-протекающей герпес-вирусной инфекцией исходные показатели ХЛ-анализа, включающие базальную и стимулированную интенсивность лейкоцитов периферической крови были повышены по сравнению с контролем (372,78±52,43; 3924,58±316,39; и

213,00±26,70 имп/с, соответственно). Несмотря на то, что фагоцитарная активность нейтрофилов достоверно превышала контрольный уровень (р<0,05), кил-линговая способность этих клеток была снижена почти на 20%. Необходимо отметить повышенную активность сукцинатдегидрогеназы (табл. 1) и, как следствие, снижение уровня активности АТФазы (табл. 2), что явилось адекватной реакцией в ответ на повышенный титр антител в этот период (1:64001:12800). К концу госпитализации отмечалось снижение как базальной, так и зимозаниндуцированной хемилюминесценции. Можно предположить, что снижение индекса стимуляции с 10,55±0,83 до 6,04±0,73 является следствием истощения метаболических резервов в клетках крови, необходимых для адекватного ответа. Подтверждением этому явилось снижение активности СДГ, уровень которого практически не отличался от контроля (76,54±3,77 и 78,32±3,17 ед.опт.пл., соответственно).

Метаболическая активность лейкоцитов периферической крови у женщин с обострением ХГВИ во II триместре имела следующие особенности. Исходно повышенные уровни базальной и стимулированной хемилюминесценции к концу лечения продолжали увеличиваться. Известно, что кроме концентрации аллергена на интенсивность хемилюминесценции нейтрофилов оказывает влияние тип сформировавшихся иммунных комплексов, усиливающих или угнетающих активность фагоцитов [8]. Возможно, после проведенного курса лечения иммуноглобулином с титром АТ к ВПГ в условиях избытка антител создаются крупнорешетчатые иммунные комплексы, которые вызывают интенсивный ответ нейтрофилов при поглощении. К тому же, такая динамика показателей хемилюминесценции положительно коррели-

Таблица 1

Ферментативная активность СДГ в нейтрофилах периферической крови у беременных с ХГВИ в стадии обострения, %

Группы Степень активности в ед. опт. пл.

отсутствие 0,5-1,0 27-29 220-225 К

I триместр, 25,82±3,29 51,14±4,85 20,86±2,27 4,57±0,64 107,71±3,77***

п=13 35,15±8,61 37,08±5,48 14,30±4,33 4,25±0,22 76,54±3,77

II триместр, 29,50±3,81 57,56±4,17 11,00±2,36 3,88±0,47 91,38±4,23

п=9 25,25±2,99 45,25±2,82 23,00±1,92 6,95±0,73 110,75±5,60***

III триместр, 12,50±0,81 49,78±3,70 37,50±2,99 2,25±0,22 131,86±9,87***

п=6 24,97±1,46 56,74±3,92 16,32±1,44 3,19±0,72 98,87±4,13***

Контроль, п=22 78,32±3,17

Примечание: здесь и далее - в числителе значение до лечения, в знаменателе - после лечения. * - р<0,05 ; ** - р<0,01; *** - р<0,001. К - коэффициент цитохимической активности.

Таблица 2

Ферментативная активность АТФ-азы в нейтрофилах периферической крови у беременных с ХГВИ в стадии обострения, %

Группы Степень активности в ед. опт. пл.

отсутствие 0,5-1,0 27-29 220-225 К

I триместр, 16,11±0,17 50,52±3,84 32,23±3,16 4,17±0,13 127,13±7,37***

п=13 1,53±0,04 35,59±3,17 55,23±3,93 7,83±1,35 169,54±7,96

II триместр, 1,62±0,09 59,36±3,14 32,17±1,92 6,85±1,02 144,25±9,30**

п=9 7,29±1,41 29,04±1,85 50,57±3,16 13,10±1,96 169,48±6,82

III триместр, 4,23±1,14 67,68±4,72 34,43±2,26 2,12±0,75 142,90±7,10**

п=6 5,14±0,16 21,94±2,05 67,33±3,82 5,59±0,36 173,37±,92

Контроль, п=22 181,32±5,97

ровала не только с данными фагоцитарного звена иммунитета (поглотительной и переваривающей способностью нейтрофилов), но и с нарастающими уровнями активности сукцинатдегидрогеназы (табл. 1) и АТФазы (табл. 2). По-видимому, это свидетельствовало о повышении уровня метаболической активности клеток и связанных с ней энергетических возможностях нейтрофилов.

В III триместре беременности на фоне повышенной интенсивности как базальной, так и стимулированной ХЛ отмечался достоверно высокий уровень активности СДГ, который, несмотря на снижение его к концу госпитализации, так и не достиг контрольных значений (табл. 1). В то же время, активность АТФ-азы повысилась в основном за счет процентного содержания клеток с максимальной активностью фермента (табл. 2).

Анализируя данные, полученные при обследовании женщин с латентным течением ХГВИ на разных этапах беременности, следует отметить некоторые особенности в метаболической характеристике лейкоцитов. Недостоверно повышенный исходный уровень базальной ХЛ во все триместры гестации (I триместр - 223,13±65,74; II триместр - 317,41±42,48; III триместр - 215,29±39,13 имп/с), к концу госпитализации увеличивался, причем, в I и II триместрах это повышение было статистически достоверным (р<0,01). Значения зимозаниндуцированной ХЛ также были повышены во все периоды беременности (2309,38±538,72; 3087,09±464,90; 2159,17±382,51

имп/с). Однако, к концу госпитализации лишь в I триместре этот показатель снижался, а во II и III -увеличивался. По-видимому, это связано с тем, что на всем протяжении беременности отмечался высокий уровень активности сукцинатдегидрогеназы,

максимальное значение которого наблюдалось во II триместре (табл. 3). Необходимо отметить, что для латентнопротекающей инфекции характерно увеличение длительности плато ХЛ, т. е. ингибирование образования активных форм кислорода продолжалось дольше, чем в группе с обострением.

Несмотря на разнонаправленность исходных и конечных результатов фагоцитарной активности ней-трофилов, на всем протяжении беременности отмечалась исходно низкая переваривающая способность нейтрофилов. К концу лечения показатель коэффициента завершенности фагоцитоза имел тенденцию к еще большему снижению и находился в пределах от

0,68±0,08 до 0,81±0,06 (при контроле 0,95±0,05). Иначе, активность нейтрофилов, вызывающая усиление фагоцитарной активности, не сопровождалась повышением их киллинговой функции. Возможно, это связано с метаболической реакцией СДГ и АТФазы на хроническую антигенную нагрузку и функциональное перенапряжение фагоцитов у больных в период ремиссии (табл. 3, 4).

Таким образом, подтверждено, что ХГВИ оказывает влияние на характер окислительновосстановительных процессов в лейкоцитах периферической крови. Следует отметить, что обострение ХГВИ приводит к увеличению интенсивности хеми-люминесцентного ответа и фагоцитарной активности нейтрофилов за счет усиления энергетических процессов. Подтверждением этому явилось повышение уровня активности СДГ и снижение АТФ-азной активности. Латентное течение ХГВИ характеризовалось сниженным хемилюминесцентным ответом и компенсаторными изменениями метаболических показателей в ответ на хроническое перенапряжение фагоцитов.

Таблица З

Ферментативная активность СДГ в нейтрофилах периферической крови у беременных с ХГВИ в стадии ремиссии, %

Группы Степень активности в ед. опт. пл.

отсутствие 0,5-1,0 27-29 220-225 К

I триместр, 35,82±0,40 44,36±4,43 13,91±2,50 5,91±0,91 89,91±4,80

n=12 20,17±2,71 52,50±3,25 26,75±1,93 1,00±0,03 108,60±2,68***

II триместр, 27,44±3,77 64,09±4,60 8,18±0,74 1,18±0,64 84,82±4,78

n=9 20,57±2,88 60,50±4,18 14,17±1,38 7,17±1,97 109,85±5,39***

III триместр, 33,80±2,76 50,00±3,08 10,60±1,83 6,00±1,20 88,40±4,73

n=8 30,67±1,46 56,71±3,58 12,71±1,89 2,35±0,26 88,32±5,02

Контроль, n=22 78,32±3,17

Таблица 4

Ферментативная активность АТФ-азы в нейтрофилах периферической крови у беременных с ХГВИ в стадии ремиссии, %

Группы Степень активности в ед. опт. пл.

отсутствие 0,5-1,0 27-29 220-225 К

I триместр, 1,75±0,76 19,72±0,94 69,34±4,52 9,19±1,74 185,97±5,91

n=12 2,38±0,14 40,47±3,21 54,82±4,37 2,33±1,16 157,10±4,86**

II триместр, 5,53±0,97 30,54±2,69 52,67±4,25 11,25±1,13 169,66±3,72

n=9 7,42±1,12 17,65±1,44 59,12±3,71 15,81±1,86 183,32±6,15

III триместр, 3,27±0,84 29,54±2,15 58,03±3,04 9,16±1,47 173,08±4,52

n=8 1,92±0,87 32,44±2,21 54,18±4,13 13,46±1,19 178,39±8,43

Контроль, n=22 181,52±5,97

ЛИТЕРАТУРА

1. Нейтрофилы, их роль в регуляции метаболизма тканей[Текст]/Бахов Н.И. [и др.]//Успехи современной биологии.-1987.-Т.104, Вып.2.-С.281-296.

2. Изучение функционального состояния фагоцитов человека (кислородный метаболизм и подвижность клеток) [Текст]/В.М.Земсков, А.А.Барсуков: методические рекомендации.-М., 1988.-19 с.

3. Герпес: патогенез и лабораторная диагностика. Руководство для врачей [Текст]/В.А.Исаков,

В.В.Борисова, Д.В.Исаков.-СПб.: Изд-во "Лань", 1999.192 с.

4. Иммунологические методы в клинических исследованиях [Текст]/А.С.Козлюк, Л.А.Анисимова, И.Г.Шройт.-Кишинев, 1987.-118 с.

5. Герпесвирусная инфекция в конце ХХ века [Текст]/Т.В.Латышева, Л.М.Хутиева//Аллерг., астма и клин. иммунол.-2001.-№4.-С.16-23.

6. Гистохимия ферментов. Лабораторные методы [Текст]/З. Лойда, Р.Госсрау, Т.Шиблер; пер. с англ.-М.: Мир, 1982-270 с.

7. Хемилюминесценция и гистохимия лейкоцитов периферической крови больных бронхиальной астмой [Текст]/М.Т.Луценко, И.А.Плюснина//Бюл. физиол. и патол. дыхания.-2000.-Вып.7.-С.49-54.

8. Резорбтивная клеточная резистентность [Текст]/Ю. А.Мазинг, М. А. Данилова

//Моделирование и клиническая характеристика фагоцитарных реакций .-Г орький, 1989.-С.103-109.

9. Хемилюминесцентный анализ функционального состояния клеточного и гуморального звеньев системы нейтрофильного фагоцитоза при рецидивирую-

щей вирусной инфекции Herpes Simplex [Текст]/А.В.Резайкина [и др.]//Клин. лаб. диагн.-1995.-№1.-С.21-23.

10. Руководство по иммунофармакологии

[Текст]: пер. с англ./под ред. М.М. Дейла,

Дж.К.Формена.-М.: Медицина, 1988.-322 с.

11. Опсоно-фагоцитарная характеристика лейкоцитов периферической крови у беременных с хронической герпесвирусной инфекцией в 1 триместре беременности [Текст]/А.С.Соловьева//Бюл. физиол. и патол. дыхания.-2001.-Вып.8.-С78-81.

12. Хемилюминесцентный анализ и опсонофаго-цитарная функция лейкоцитов периферической крови у беременных с хронической герпесной инфекцией [Текст]/А.С.Соловьева//Бюл. физиол. и патол. дыха-ния.-2003.-Вып.13.-С.29-32.

13. Участие в процессах активации лимфоцитов факторов, продуцирующих нейтрофилами женщин с физиологической беременностью и с беременностью, осложненной поздним гестозом [Текст]/Н.Ю.Сотникова [и др.]//Иммунология.-1998.-№1.-С.51-54.

14. Иммунитет и генитальный герпес

[Текст]/Г.Т.Сухих, М.В.Ванько, В.И.Кулаков.-

Н.Новгород, 1997.-224 с.

15. Недостаточность плаценты и ВПГ-инфекция [Текст]/В.Л.Тютюнник//Акуш. и гин.-2000.-№6.-С.57.

16. Основные задачи клинической иммунологии

по изучению функциональной активности фагоцитирующих клеток [Текст]/Р.М.Хаитов, Б.В.Пине-

гин//Иммунология.-1995.-№3.-С.6-10.

17. Neutrophil defenses induse histamine secretion on from mast cells: Mehanism of action [Text]/S.D.Befus [et al.]//J. Immn.no1.-1999.-Vo1.163. №2.-P.947-953.

П □ □