CC BY
4в
естник АПК
Ставрополья
: № 4(28), 2017
Ветеринария
49
УДК 619:616-092.19:636.52/58
П. Ю. Царев, Н. В. Донкова, Е. Г. Турицына
Tsarev P. Yu., Donkova N. V., Turitsyna E. G.
ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНЫ1Й АНАЛИЗ В ОЦЕНКЕ ПОВРЕЖДАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ТЕМПЕРАТУРНОГО СТРЕССА У ПТИЦ
CHEMILUMINESCENCE ANALYSIS IN ESTIMATING THE DAMAGE OF TEMPERATURE STRESS IN POULTRY
У суточных цыплят исследовано влияние теплового и холодового стресса на продукцию активных форм кислорода клетками крови методом хемилюминесцентного анализа, изучен клеточный состав лейкоцитов и их фагоцитарная активность. Повреждающее действие температурного стресса на организм птицы оценивали с помощью хемилюминесцентного анализа на хемилюминометре «CL-3604». Определяли спонтанную и активированную частицами латекса in vitro суммарную продукцию активных форм кислорода (АФК) клетками крови опытной птицы. В качестве хемилюминесцентных зондов использовали люци-генин и люминол. Установлено, что температурный стресс ведёт к сокращению общего содержания лейкоцитов, умеренной стимуляции их фагоцитарной активности и росту генерации всех видов кислородных радикалов, что несёт угрозу повреждения клеточных мембран. Высокий уровень спонтанной продукции радикалов кислорода клетками, находящимися в состоянии покоя, относительно клеток, стимулированных in vitro частицами латекса, ведёт к снижению индекса активации и указывает на низкие потенциальные возможности лейкоцитов крови адекватно реагировать на антигенные раздражения при температурных стрессовых воздействиях.
Ключевые слова: хемилюминесценция, активные формы кислорода, температурный стресс, клетки крови, цыплята.
We studied the influence of heat and cold stress on the production of reactive oxygen species by blood cells by the method of chemiluminescence analysis, the cellular composition of leukocytes and their phagocytic activity. The damaging effect of temperature stress on the poultry organism was assessed by chemiluminescence analysis with the «CL-3604» chemiluminometer. We determined spontaneous and activated by latex in vitro the total production of reactive oxygen species (ROS) by the cells of the test poultry's blood. As chemiluminescent probes we used lucigenin and luminol. It was found that the temperature stress leads to a reduction in the total content of leukocytes, a moderate stimulation of their phagocytic activity, and an increase in the generation of all types of oxygen radicals, which threatens damage to the cell membranes. The high level of spontaneous production of oxygen radicals by cells at rest with respect to cells stimulated in vitro with latex leads to a decrease in the activation index and indicates a low capacity of blood leukocytes to react to antigens at temperature stresses.
Key words: chemiluminescence, reactive oxygen species, temperature stress, blood cells, chickens.
Царев Павел Юрьевич -
аспирант кафедры анатомии, патологической
анатомии и хирургии института прикладной
биотехнологии и ветеринарной медицины
ФГБОУ ВО «Красноярский государственный аграрный
университет»
г. Красноярск
Тел.: 8-983-150-45-87
E-mail: jet500000@bk.ru
Донкова Наталья Владимировна -
доктор ветеринарных наук, профессор, заведующая кафедрой анатомии, патологической анатомии и хирургии института прикладной биотехнологии и ветеринарной медицины
ФГБОУ ВО «Красноярский государственный аграрный
университет»
г. Красноярск
Тел.: 8-923-322-54-55
E-mail: dnv-23@mail.ru
Турицына Евгения Геннадьевна -
доктор ветеринарных наук, профессор кафедры анатомии, патологической анатомии и хирургии института прикладной биотехнологии и ветеринарной медицины
ФГБОУ ВО «Красноярский государственный аграрный
университет»
г. Красноярск
Тел.: 8-960-752-69-45
E-mail: turitcyna@mail.ru
Tsarev Pavel Yurevich -
Postgraduate Student of the Department of Anatomy,
Pathological Anatomy and Surgery of Applied
Biotechnology and Veterinary Medicine Institute
FSBEI HE «Krasnoyarsk State Agrarian University»
Krasnoyarsk
Tel.: 8-983-150-45-87
E-mail: jet500000@bk.ru
Donkova Natalia Vladimirovna -
Doctor of Veterinary Sciences, Professor, Head of the Department of Anatomy, Pathological Anatomy and Surgery of Applied Biotechnology and Veterinary Medicine Institute
FSBEI HE «Krasnoyarsk State Agrarian University»
Krasnoyarsk
Tel.: 8-923-322-54-55
E-mail: dnv-23@mail.ru
Turitsyna Evgenia Gennadievna -
Doctor of Veterinary Sciences, Professor of Department of Anatomy, Pathological Anatomy and Surgery of Applied Biotechnology and the Veterinary Medicine Institute
FSBEI HE «Krasnoyarsk State Agrarian University»
Krasnoyarsk
Tel.: 8-960-752-69-45
E-mail: turitcyna@mail.ru
*>естеик АПК
ЖВ Ставрополья
научно-практическии журнал
В условиях промышленного содержания организм сельскохозяйственных птиц, особенно молодняк раннего возраста, находится под воздействием многочисленных стрессов, таких как транспортировка [1], чередование разных режимов освещения [2], воздействие высоких и низких температур [3, 4]. Стрессовые факторы различного происхождения и продолжительности вызывают изменения морфологической и функциональной характеристики клеток крови [5, 6]. Особенно значимые сдвиги гематологических показателей наблюдаются при интенсивных тепловых воздействиях, поскольку птица способна существовать без критических изменений в организме в узком диапазоне внешних температур, что связано с отсутствием потовых желез, слабой сосудистой реакцией и прочими особенностями [3, 6]. Не менее опасны для организма птицы низкие температуры.
Значительные отклонения температуры от нормальных величин особенно критичны для цыплят раннего возраста, поскольку они негативно влияют на рост, половое созревание, а также снижают качество продукции, особенно у птицы мясных кроссов. Известно, что экстремальные тепловые нагрузки приводят к развитию окислительного стресса, при котором нарушается баланс между продукцией свободных радикалов и количеством нейтрализующих их антиоксидантов и повреждаются клеточные мембраны вследствие развития перекисного окисления липидов [3]. Развитие окислительного стресса традиционно оценивают по содержанию конечных продуктов перекисного окисления липидов. Однако существуют более высокотехнологичные методы исследования, в том числе хемилюминесцентный анализ, который позволяет регистрировать уровень продукции свободных кислородных радикалов на ранних этапах генерации на молекулярном уровне. Таким образом, изучение влияния температурного стресса на птицу, особенно молодняк раннего возраста, является достаточно актуальным и имеет практическое значение.
Цель исследования - оценить повреждающее действие температурного стресса на организм птицы методом хемилюминесцентного анализа. В задачи исследования входило определение продукции активных форм кислорода клетками крови цыплят раннего возраста при холодовом и тепловом стрессе, а также при чередовании низких и высоких температур.
Исследования проведены в сентябре 2017 года на кафедре анатомии, патологической анатомии и хирургии института прикладной биотехнологии и ветеринарной медицины Красноярского государственного аграрного университета и на базе Международного научного центра при Президиуме Красноярского научного центра СО РАН.
Для исследования сочетанного действия низких и высоких температур создано две груп-
пы суточных петушков. Птица первой группы (16 гол.) в течение суток находилась при температуре 40±2 оС под инфракрасной лампой мощностью 250 Вт, подвешенной на расстоянии 50 см от пола клетки, затем в течение вторых суток -в прохладном помещении при температуре 20±2 оС. Цыплята второй группы (16 гол.) содержались 24 часа при температуре 20±2 оС, а следующие сутки - под инфракрасной лампой при 40±2 0С. Контроль температуры осуществлялся спиртовыми термометрами на уровне головы птицы. Материалом для исследований служила гепаринизированная венозная кровь из наружной ярёмной вены. Контролем служили исходные показатели суточных цыплят (8 голов). Всего исследована кровь от 40 голов.
Повреждающее действие температурного стресса на организм птицы оценивали с помощью хемилюминесцентного анализа на хеми-люминометре «CL-3604» [7]. Определяли спонтанную и активированную частицами латекса in vitro суммарную продукцию активных форм кислорода (АФК) клетками крови опытной птицы. В качестве хемилюминесцентных зондов (ХЛ-зонды) использовали люцигенин - для выявления первичных радикалов, таких как супероксид-анион, и люминол - для определения вторичных радикалов: гипохлорид-аниона, перекиси водорода, гидроксила и др.
После окончания хемилюминесцентной реакции определяли общее содержание лейкоцитов, их фагоцитарную активность в отношении частиц латекса и лейкоцитарный профиль на мазках, окрашенных по Паппенгейму. Полученные цифровые данные обрабатывали методом вариационной статистики, различия между показателями считали достоверными при Р<0,05.
Исследования температурного стресса показали, что любые отклонения температуры окружающей среды на 10 оС относительно оптимальных параметров в 30-32 оС негативно влияли на клиническое состояние и стимулировали продукцию активных форм кислорода клетками крови.
Цыплята первой группы в первые 2-3 часа высокотемпературного воздействия чувствовали себя удовлетворительно, были подвижны, активно перемещались по клетке, клевали корм и пили воду. Через 4-5 часов появились первые признаки развития стрессовой реакции - вялость и малоподвижность. Спустя 22-24 часа у цыплят нарастали признаки угнетения, они были малоподвижны, лежали или сидели с закрытыми глазами и растопыренными крыльями, аппетит и жажда отсутствовали, дыхание частое и поверхностное. После прекращения высокотемпературного воздействия клиническое состояние птицы нормализовалось. Цыплята становились подвижными, активными, появлялся аппетит и умеренная жажда.
Исследование способности клеток крови к образованию кислородных метаболитов показало значительный рост суммарных объёмов всех видов свободных радикалов (табл.). Так, при спонтанной хемилюминесценции генера-
в
естник АПК
Ставрополья
;№ 4(28), 2017
Ветеринария
51
ция первичных и вторичных АФК выросла на 64 и 71 % (Р<0,05), а при стимулированной латексом ХЛ-реакции - на 12 и 36 % соответственно.
Прекращение действия теплового фактора и снижение окружающей температуры до 20±2 оС не привело показатели кислородного метаболизма клеток крови к фоновым величинам, несмотря на нормализацию клинического состояния. Продукция кислородных радикалов сохранялась на высоком уровне и отличалась большой вариабельностью индивидуальных показателей. Более того, соотношение между суммарными объёмами АФК, генерированными при активированной и спонтанной хемилюминесценции, называемое индексом активации, сократилось на 30-40 % (Р<0,01). Эти данные свидетельствовали о значительном снижении функциональных возможностей фагоцитов крови птицы реагировать на потенциальные антигенные угрозы при чередовании теплового и холодового воздействий.
Анализ фоновых показателей лейкоцитарного профиля крови суточных цыплят показал незначительное преобладание псевдоэози-нофильных гранулоцитов (46,50±2,18 %) над лимфоцитами (44,50±2,11 %). Тепловой стресс продолжительностью 24 часа привел к достоверному сокращению общего содержания лейкоцитов на 21 % относительно исходных показателей (Р<0,01). При этом содержание лимфоцитов и псевдоэозинофилов упало на 1 и 8 % соответственно, а относительное содержание базофилов, моноцитов и, особенно, эози-нофилов выросло на 17, 43 и 73 % (Р<0,01).
Последующее холодовое воздействие привело к росту общего содержания лейкоцитов на 19 % относительно фоновых показателей и почти на 51 % по сравнению с предыдущими сутками (Р<0,01). При этом содержание лимфоцитов сократилось на 13 %, а псевдоэозинофилов выросло почти на 7 % относительно исходных величин. Наметилась тенденция к возвращению к исходным показателям уровня эозинофилов, базофилов и моноцитов.
Тепловой стресс умеренно стимулировал фагоцитарную активность лейкоцитов, что характеризовалось её ростом на 15 % по сравнению с контрольными величинами и отличалось
значительным разбросом индивидуальных показателей (50,63±6,93 %). Последующее понижение температуры окружающей среды до 20±2 оС вызвало некоторое торможение поглотительной способности фагоцитов крови в отношении частиц латекса и снижение фагоцитарной активности до 46,38±2,42 %.
Цыплята второй опытной группы, содержащиеся при пониженной температуре, в течение первых 5-6 часов стрессового воздействия были малоподвижны, сбивались в угол клетки, жались друг к другу, отказывались от корма и воды. Спустя 14-16 часов наблюдались признаки адаптации к окружающей температуре. Цыплята начали активно двигаться, появился аппетит, при этом жажда практически отсутствовала. При перемещении под инфракрасную лампу у птицы постепенно появилась жажда, но аппетит начал исчезать. Продолжительное нахождение при температуре 40±2 оС привело к снижению двигательной активности и нарастанию одышки, поверхностному и учащенному дыханию. Цыплята прятались от света, сидели с раскрытыми крыльями и закрытыми глазами, аппетит и жажда полностью отсутствовали.
Исследование кислородного метаболизма клеток крови показало значительный рост продукции свободных радикалов при спонтанной хемилюминесценции как люцигенинзависимых, так и люминолзависимых- в 2,5 раза и на 34,7 % соответственно после первых суток низкотемпературного стресса (см. табл.). Клетки, активированные частицами латекса, демонстрировали разнонаправленные изменения. Генерация активированных первичных радикалов выросла на 17,3 %, в то время как образование вторичных люминолзависимых АФК сократилось почти на 22 %.
Рост суммарной продукции кислородных радикалов клетками крови в состоянии покоя и снижение генерации АФК клетками, стимулированными частицами латекса in vitro, привели при холодовом стрессе к резкому падению индекса активации. При образовании люцигенинзависимых АФК он упал в 2 раза (Р<0,001), а при продукции люминолзависимых - на 77 % (Р<0,01).
Таблица - Суммарная продукция люцигенинзависимых и люминолзависимых АФК клетками крови цыплят при температурном стрессе, млн имп. за 90 мин
Условия эксперимента Люци генинзависимые АФК Люминолзависимые АФК
активир. спонтан. активир. спонтан.
Исходное (фон) n=8 1,674±0,247 0,568±0,093 0,153±0,024 0,075±0,015
Первая опытная группа (n = 16)
40±2 oC 24 часа 2,270±0,281 0,930±0,102* 0,171±0,028 0,128±0,043
20±2 оС 24 часа 2,144±0,372 1,035±0,176* 0,145±0,250 0,102±0,011
Вторая опытная группа (n = 16)
20±2 оС 24 часа 1,963±0,207 1,420±0,190* 0,120±0,010 0,101±0,013
40±2 оС 24 часа 3,211±0,416** 3,700±0,702* 0,186±0,039 0,117±0,027
Примечание: * - Р<0,05; ** - Р<0,01 относительно исходных контрольных показателей.
Пеегаш АПК
ЖВ Ставрополья
научно-практическии журнал
Холодовой стресс продолжительностью 24 часа вызвал снижение общего содержания лейкоцитов на 27 % (Р<0,001). Относительный уровень лимфоцитов упал на 12 %, а псевдоэози-нофилов и эозинофилов - вырос на 8 и 53 % соответственно. При этом содержание базофи-лов и моноцитов не отличалось от исходных величин. Стресс практически не влиял на фагоцитарную активность.
Последовательное увеличение температуры с 20±2 до 40±2 оС в течение двух суток привело к росту генерации первичных люцигенинза-висимых радикалов кислорода при спонтанной в 6,5 раза (Р<0,05) и при антигениндуцирован-ной хемилюминесценции в 2 раза (Р<0,01). Продукция вторичных АФК выросла при спонтанной и активированной ХЛ-реакции на 56 и 22 % соответственно. Резкий выброс радикалов при спонтанной хемилюминесценции и умеренно повышенная продукция при активированной реакции привели к сокращению индекса активации: при образовании люминол-зависимых АФК показатель снизился на 26 %, а при генерации люцигенинзависимых радикалов - в 3 раза (Р<0,001) по сравнению с фоном.
Общее содержание лейкоцитов сократилось на 21 % по сравнению с исходными данными и составило 16,87±0,70х109/л (Р<0,01), а их фагоцитарная активность выросла на 5,5 %. При этом относительное содержание лимфоцитов и базо-филов упало на 15,5 % (Р<0,05) и 11 % соответственно, а уровень псевдоэозинофилов, эозино-филов и моноцитов вырос на 12, 26,6 и 23 %.
Таким образом, температурные стрессы ведут к избыточной продукции свободных радикалов кислорода, которые способны повреждать мембраны клеток и запускать механизмы перекисно-го окисления липидов. Повышенная генерация радикалов при спонтанной хемилюминесцен-ции обусловливает снижение индекса активации и свидетельствует о сокращении функциональных возможностей фагоцитов крови реагировать на антигенные нагрузки. Наибольшим повреждающим действием на организм птицы раннего возраста обладает чередование холодовых и тепловых воздействий. Температурные стрессы сопровождаются лейкопенией, сокращением относительного содержания лимфоцитов и ростом уровня псевдоэозинофилов и моноцитов, а также кратковременной стимуляцией фагоцитарной активности лейкоцитов.
Литература
1. Донник И. М., Дерхо М. А., Харлап С. Ю. Клетки крови как индикатор активности стресс-реакций в организме цыплят // Аграрный вестник Урала. 2015. № 5(135). С.68-71.
2. Беляева Е. Ю., Бусловская Л. К., Ковту-ненко А. Ю. Морфофункциональные параметры клеток крови у кур при адаптации к режимам освещения // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Серия: Естественные науки. 2013. Т. 23, № 10. С. 107-111.
3. Фисинин В. И., Кавтарашвили А. Ш. Тепловой стресс у птицы. Сообщение 1. Опасность, физиологические изменения в организме, признаки и проявления // Сельскохозяйственная биология. 2015. Т. 15, № 2. С. 162-171.
4. Campo J. L., Prieto M. T., Davila S. G. Effects of housing system and cold stress on heterophil-to-lymphocyte ratio, fluctuating asymmetry, and tonic immobility duration of chickens // Poultry Science. 2008. Vol. 87, № 4. P. 621-626.
5. Мифтахутдинов А. В. Экспериментальные подходы к диагностике стрессов в птицеводстве // Сельскохозяйственная биология. 2014. № 2. С. 20-30.
6. Изменения функциональной активности лейкоцитов в условиях острого перегревания организма / С. В. Надеждин, М. 3. Федорова, Н. А. Павлов, Е. В. Зубарева // Научные ведомости. 2008. № 3 (43). С. 5-11.
7. Makarskaya G. V., Tarskikh S. V., Turitsyna E. G. Luminol- and lucigenin-dependent chemiluminescence of chicken whole-blood cells during postnatal ontogeny // Russian Agricultural Sciences. 2011. Т. 37, № 3. PP. 254-257.
References
1. Donnik I. M., Derkho M. A., Kharlap S. Yu. Blood cells as the indicator of activity of stress-reactions in the organism of chickens // Agrarian Bulletin of the Urals. 2015. № 5(135). P. 68-71.
2. Belyaeva E. Yu., Buslovskaya L. K., Kovtunenko A. Yu. Morphological and functional parameters of the chickens blood cells during the adaptation to the modes of lighting // Scientific journal of Belgorod State University. Natural sciences. 2013. Vol. 23, № 10. P. 107-111.
3. Fisinin V. I., Kavtarashvili A. Sh. Heat stress in poultry. I. Danger, related physiological changes and symptoms // Agricultural Biology. 2015. Vol. 50, № 2. P. 162-171.
4. Campo J. L., Prieto M. T., Davila S. G. Effects of housing system and cold stress on heterophil-to-lymphocyte ratio, fluctuating asymmetry, and tonic immobility duration of chickens // Poultry Science. 2008. Vol. 87, № 4. P. 621-626.
5. Miftakhutdinov A. V. Experimental approaches to stress diagnostics in poultry // Agricultural Biology. 2014. № 2. P. 20-30.
6. The change of leukocytes' active properties in conditions of organism acuity overheating / S. V. Nadezhdin, M. Z. Fyodorova, N. A. Pavlov, E. V. Zubareva // Scientific bulletin. 2008. № 3 (43). P. 5-11.
7. Makarskaya G. V., Tarskikh S. V., Turitsyna E. G. Luminol- and lucigenin-dependent chemiluminescence of chicken whole-blood cells during postnatal ontogeny // Russian Agricultural Sciences. 2011. Vol. 37, № 3. P. 254-257.
