CC BY
14Hemiflagellochloris (СМогоркусвав, СМогорку(а) — новый для флоры России род зеленых водорослей
А. Д. Темралеева1, Е. В. Минчева2, Ю. С. Букин2, М. В. Ельцов1, | В. А. Демкйн] 1, Д. Ю. Щербаков23,
Д. Л. Пинский1
1 Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН, ул. Институтская, д. 2, Пущино, 142290, Россия; temraleeva.anna@gmail.com
2 Лимнологический институт СО РАН, ул. Улан-Баторская, д. 3, Иркутск, 664033, Россия; elenakuznetsova01@gmail.com
3 Иркутский государственный университет, ул. Сухэ-Батора, д. 5, Иркутск, 664003, Россия; dysh007@gmail.com
Резюме. Род Hemiflagellochloris Watanabe et al. впервые приводится для территории России. Представитель рода был изолирован из погребенного солонца в зоне сухих степей (северная часть Ергенинской возвышенности, Волгоградская область). Описана морфология и экология данного штамма, на основе молеку-лярно-генетического анализа фрагмента гена 18S рДНК установлено его филогенетическое положение внутри класса Chlorophyceae.
Ключевые слова: зеленые водоросли, новая находка, Hemiflagellochloris, солонец, зона сухих степей, Ергенинская возвышенность, Россия.
Hemiflagellochloris (Chlorophyceae, Chlorophyta), a new for Russian flora genus of green algae
A. D. Temraleeva1, E. V. Mincheva2, Yu. S. Bukin2, M. V. Eltsov1,
V. A. Demkin I1, D. Yu. Sherbakov23, D. L. Pinsky1
1 Institute of Physico-Chemical and Biological Problems of Soil Science RAS,
Institutskaya Str., 2, Pushchino, 142290, Russia; temraleeva.anna@gmail.com
2 Limnological institute SB RAS, Ulan-Batorskaya Str., 3, Irkutsk, 664033, Russia;
elenakuznetsova01@gmail.com
3 Irkutsk State University, Sukhe-Bator Str., 5, Irkutsk, 664003, Russia; dysh007@
gmail.com
Abstract. The genus Hemiflagellochloris Watanabe et al. was found in Russia for the first time. The algal strain was isolated from a buried solonetz in the zone of dry steppes (the north-end of Ergeni Hills, Volgograd Region). The morphology and ecology of this isolate are described. Its phylogenetic position within Chlorophyceae is determined by molecular analysis of 18S rDNA gene.
Keywords: green algae, new record, Hemiflagellochloris, solonetz, zone of dry steppes, Ergeni hills, Russia.
Введение
Новый род зеленых водорослей Hemiflagellochloris Watanabe et al. был описан относительно недавно (Watanabe et al., 2006b). Штамм типового вида Hemiflagellochloris kazakhstanica Watanabe et al. был изолирован из почвенных образцов засоленных орошаемых земель бассейна р. Или, Казахстан. Зооспоры данной водоросли характеризуются отсутствием стигмы, наличием оболочки и двух жгутиков, сильно (почти в 2 раза) различающихся по длине. Молекулярно-ге-нетический анализ последовательностей 18S и 28S рДНК показал, что данный род формирует самостоятельную ветвь, отдельную от зеленых водорослей, имеющих слегка неравные жгутики: Hetero-chlamydomonas Cox et Deason, Spermatozopsis similis Preisig et Mel-konian, Fasciculochloris McLean et Trainor и Heterotetracystis Cox et Deason (Watanabe et al, 2006b). Поскольку до настоящего времени в альгологической литературе не было упоминаний о находках H. kazakhstanica в почвах России, данная работа представляет собой первое такое описание.
Материалы и методы
Изоляция и культивирование штамма. Объектом данного исследования послужил штамм ACSSI 100 из коллекции культур водорослей ИФХиБПП РАН — ACS SI (Algal Collection of Soil Science Institute). Штамм был изолирован из верхнего горизонта А1 солонца мелкого, погребенного под почвенно-грунтовым слоем мощностью 25 см около кургана в результате мелиоративной распашки территории в 1970-х гг. Курган располагается в северной части Ергенинской возвышенности (Волгоградская область, Россия, зона сухих степей (Добровольский, Урусевская, 2004)). Географические координаты места отбора: 47°53'21" с. ш., 44°0'50" в. д. Содержание гумуса и pH почвы составляли 0.66 % и 8.6 соответственно. Культивирование штамма проводили на среде BG11 с азотом (1%-ный агар, pH = 7.0) при температуре +23-25 °С, освещенности 2000 Лк и световом режиме 12 : 12 ч.
Световая микроскопия. Изучение морфологии и жизненного цикла исследуемого штамма проводили методами световой микроскопии (светлое поле и интерференционный контраст) с помощью микроскопов Leica DM750 и Carl Zeiss Axio Scope A1 (Германия). Результаты наблюдений документированы рабочими рисунками и фотографиями, снятыми с помощью цветных цифровых камер «Видео-завр» (Россия) и Carl Zeiss MRc 5 (Германия). Для таксономической
идентификации проводили несколько прижизненных цитохимических реакций: на крахмал — раствором Люголя, на общие очертания слизи — 1%-ным раствором туши, на структуру слизи — 0.1%-ным раствором метиленового синего. Сроки наблюдения за штаммом составляли от 12 часов до 12 месяцев.
Экстракция, амплификация и секвенирование ДНК. ДНК выделяли из альгологически чистой культуры штамма с помощью 2%-ного лизирующего буфера СТАВ и протеиназы К (20 мг/мл) с последующей экстракцией смесью хлороформ-изоамиловый спирт (24 : 1) (Doyle, Dickson, 1987). Праймеры и условия амплификации фрагмента ядерного гена 18S рДНК указаны в таблице 1.
Таблица 1
Праймеры и условия амплификации фрагмента гена 18S рДНК (Katana et al., 2001)
Primers and amplification conditions for 18S rDNA analysis (Katana et al., 2001)
Праймер Последовательность (5-3") Условия амплификации
Primer Sequence (5'-3') Amplification conditions
18S F Aacctggttgatcctgccagt 95 °C
95 °C 55 °C
--72 °C
18S r tgatccttctgcaggttcacctacg 72 °C
Ампликоны анализировали электрофоретически в 1%-ном агароз-ном геле. Секвенирование нуклеотидных последовательностей проводили на базе ЗАО «Синтол» (Москва, Россия).
Филогенетический анализ. Для сравнительного филогенетического анализа был использован набор последовательностей 18Б рДНК штаммов зеленых водорослей из базы данных GenBank (табл. 2).
Реконструкцию филогенетических взаимосвязей осуществляли методом максимального правдоподобия (ML) в программе PhyML и методом Байеса в программе MrBayes 3.1 с повторностью 1000 реплик. В качестве внешней группы использовали представителей рода ТгеЬоихга Риута1у (ТтеЬоихюркусеае). Выравнивание нуклеотидных последовательностей осуществляли в программе ВюЕё^ по алгоритму C1usta1W. Общая длина анализируемых последовательностей составила 1349 пар нуклеотидов. Для выбора модели нуклеотидных замен использовали программу jMode1Test. Статистическая поддержка топологии деревьев была оценена с помощью бутстреп-анализа и апостериорной вероятности и указана в узлах ветвей.
— 5 мин
— 1 мин "I
— 1 мин у 25 циклов
— 1 мин
— 2 мин
Таблица 2
Список штаммов водорослей, использованных в филогенетическом анализе List of algal strains used for phylogenetic analysis
Коллекция, Номер последовательности в GenBank (18S рДНК) Accession number from GenBank (18S rDNA)
Таксон Taxon номер штамма Collection number of strain
Chlorophyceae
Carteria radiosa Korshikov UTEX 835 AF182819
Carteria sp. UTEX 2 AF182817
Chlamydomonas asymmetrica Korshikov SAG 70.72 U70788
C. baca Ettl SAG 24.87* U70781
C. oblonga Pringsheim SAG 11-60a* AF395434
C. rapa Ettl SAG78.72 U70790
C. reinhardtii Dangeard (T) CC-400 M32703
C. zebra Korschikov SAG 10.83* U70792
Chloromonas radiata (Deason et Bold) Pröschold, Marin, Schlösser et Melkonian (= Chlamydomonas radiata Deason et Bold) UTEX 966* U57697
C. reticulata (Goroschankin) Gobi (T) UTEX 1970 U70791
C. rosae Ettl UTEX 1337 U70796
Desmotetra delicata (Watanabe) Watanabe NIES 153 AB218710
D. stigmatica (Deason) Deason et Floyd (T) UTEX 962 AB218711
Fasciculochloris boldii McLean et Trainor (T) UTEX 1451* AB244240
Hemiflagellochloris kazakstanica Watanabe, Tsujimura, Misono, Nakamura et Inoue (T) BAKg15 = NIES 1722* AB244244
Hemiflagellochloris cf. kazakstanica ACSSI 100 KF652114
Heterochlamydomonas inaequalis Cox et Deason (T) UTEX 1705* = SAG 4.75* AF367857
H. lobata Langford et Cox UTEX 728 AF367858
H. rugosa Langford et Cox SAG 45.86 AF367859
Heterotetracystis akinetos Cox et Deason (T) UTEX 1675 AB244242
Lobochlamys culleus (Ettl) Pröschold, Marin, Schlösser et Melkonian (= Chlamydomonas culleus Ettl) SAG 17.73* AJ410461
L. segnis (Ettl) Pröschold, Marin, Schlösser et Melkonian (T) (= Chlamydomonas fimbriata Ettl) SAG 17.72* U70784
Neochlorosarcina auxotrophica (Groover et Bold) Watanabe UTEX 722 AB218696
N. deficiens (Groover et Bold) Watanabe UTEX 1700* AB218697
N. pseudominor (Groover et Bold) Watanabe UTEX 1702* AB218714
Окончание табл. 2
Коллекция, Номер последовательности в GenBank (18S рДНК) Accession number from GenBank (18S rDNA)
Таксон Taxon номер штамма Collection number of strain
Oogamochlamys gigantea (Dill) Pröschold, Marin, Schlösser et Melkonian (T) (= Chlamydomonas gigantea Dill) UTEX 1753 AJ410467
Oogamochlamys zimbabwiensis (Heimke et Starr) Pröschold, Marin, Schlösser et Melkonian (= Chlamydomonas zimbabwiensis Heimke et Starr) UTEX 2213* AJ410471
Paulschulzia pseudovolvox (Schultz) Skuja (T) UTEX 167 U83120
Sarcinochlamys stigmatica Watanabe (T) ASIB Т105 AB218709
Spermatozopsis similis Preisig et Melkonian SAG 1.85* X65557
Tetraspora sp. UTEX 234 U83121
Volvox carteri Stein UTEX 1885 X53904
Trebouxiophyceae (внешняя группа)
Trebouxia aggregata (Archibald) Gärtner SAG 219-1d* = CCAP 219/1D; UTEX 180 EU123942
T. asymmetrica Friedl et Gärtner SAG 48.88* = UTEX 2507 Z21553
Примечание. (Т) — типовой вид, * — аутентичный штамм, прочерк означает отсутствие данных.
Note. (Т) — type species, * — authentic strain, blank means data absence.
Результаты и обсуждение
Морфологическое описание. За жизненным циклом штамма ACS-SI 100 наблюдали в течение длительного периода времени (до 1 года включительно). Стадии жизненного цикла изолята представлены на рис. 1.
Молодые клетки, развивающиеся из зооспор, широкоэллипсоидные, яйцевидные или веретеновидные (рис. 1, а). По мере роста клетки приобретают шаровидную форму, до 13-16 мкм в диам., иногда с выступающим утолщением, которое является остатком вытянутого конца зооспоры (рис. 1, b), диаметр зрелых клеток может достигать 30 мкм и более. Оболочка тонкая. Хлоропласт один, пристенный, полый, шаровидный. Пиреноид один, с несплошной оберткой из 3-6 крахмальных скорлупок. В культуре часто наблюдаются не только одиночные вегетативные клетки, но и сарциноидные пакеты в материнской оболочке по 2, 4, 8 клеток (рис. 1, c, d), образованные, вероятно, путем десмосхизиса. Бесполое размножение апланоспорами и зооспорами,
Рис. 1. Hemiflagellochloris cf. kazakhstanica ACSSI 100. a — молодые вегетативные клетки, развившиеся из зооспор; b — вегетативные клетки со слизистым утолщением; c, d — формирование пакетов клеток; e — зооспора с двумя неравными жгутиками; f — зооспорангий; g — апланоспорангий; h — старая клетка с концентрической слизистой оболочкой. Масштабная линейка:
10 мкм.
a — young vegetative cells,derived from zoospores; b — vegetative cells with mucilaginous thickening; c, d — a formation of cell pakets; e — a zoospore with two flagella of unequal lengths; f— a zoosporangium; g — an aplanosporangium; h — an old cell with concentric mucilage. Scale bar: 10 p,m.
которые образуются при последовательном делении. В зооспоран-гии находится от 4 до 16 зооспор с носиком, но без стигмы (рис. 1, /). Зооспоры удлиненно-веретеновидной или эллипсоидной формы, 3.8-7 мкм шир. и 12.9-15 мкм дл., с 2 неравными жгутиками: более длинный 15-18 мкм, более короткий 9-10 мкм (рис. 1, е). При движении длинный жгутик направлен вперед, а короткий назад. Хлоропласт занимает большую часть клетки с центральным пиреноидом; ядро, как правило, переднее. На переднем конце клетки присутствуют 2 сократительные вакуоли. Зооспоры после движения не округляются и сохраняют свою форму. В апланоспорангиях находится до 8 апланоспор, 8.5-11 мкм в диам. (рис. 1, g). Половое размножение не наблюдали. Старая культура приобретает темно-оранжевую окраску, оболочка клеток утолщается до 5-6 мкм, становится концентрической (рис. 1, к). Запасной продукт: липиды.
Отличительные черты штамма ЛС8Б1 100. Штамм АС8Б1 100 отличается от типового штамма Hemiflagellocкloris ка2акк81апгса, согласно описанию Watanabe е1 а1. (2006Ь), более крупными вегетативными клетками (до 30 мкм в диам.) и зооспорами (до 7 мкм шир. и до 15 мкм дл.), а также более толстой слизистой оболочкой в старой культуре (до 5-6 мкм).
Филогенетический анализ. Деревья, построенные ML и байесовским методом, имели сходную топологию, поэтому за основу было взято байесовское дерево (рис. 2). Названия клад и их объем даны в понимании Watanabe е1 а1. (2006a, Ь). По данным анализа 18Б рДНК исследуемый штамм АС8Б1 100 является представителем рода Нетг-flagellockloris и расположен в корневом регионе Уо1уох-клады. Данная клада имеет высокие статистические поддержки и образована предста-
Рис. 2. Укорененное филогенетическое дерево, сконструированное байесовским методом и ML, на основе последовательностей 18S рДНК (1349
пар нуклеотидов).
The rooted phylogenetic tree constructed by Bayesian analysis and ML for 18S
rDNA sequence data (1349 bp). Примечание. В качестве статистической поддержки узлов дерева указаны байесовские апостериорные вероятности (над ветвью) и бутстреп-значения ML (под ветвью); значения <0.8 и 50, соответственно, не показаны. Модель нуклеотидных замен: GTR+I+G. Штаммы, выделенные жирным шрифтом, имеют два анизо-
контных жгутика. Звездочкой отмечены аутентичные штаммы. Note. Node support of the tree is given as Bayesian posterior probabilities (above branch) and ML bootstrap values (below branch); values <0.8 and 50, respectively, are not shown. Model of nucleotide changes is GTR+I+G. The strains typed in bold letters have two anisokont flagella. Authentic strains were marked with an asterisk.
Cañería radiosa UTEX 835 (AF182819)
^- Cartería sp. UTEX 2 (AF182817)
- Spermatozopsis similis SAG 1.85* (X65557)
Chloromonas radíala (= Chlamydomonas radíala) UTEX 966* (U57697) - Chloromonas relículala UTEX 1970(U70791) Chloromonas rosae UTEX 1337 (U70796) Lobochlamys culleus (= Chlamydomonas culleus) SAG 17.73* (AJ4I0461) Lobochlamys segnis(= Chlamydomonas fimbríata) SAG 17.72* (U70784)
Oogamochlumys gigantea (= Chlamydomonas gigantea) UTEX 1753 (AJ410467) Oogamochlamys zimbabwiensis (= Chlamydomonas zimbabwiensis) UTEX 2213* (AJ410471) Sarcinochlamys stigmatica ASIB.T105 (AB218709)
jl— Desmotetra stigmatica UTEX 962 (AB218711) " - Desmotetra delicata NIES-153 (AB218710)
Heterochlamydomonas ¡naequalis UTEX 1705* (AF367857) Heterochlamydomonas rugosa SAG 45.86 (AF367859) Heterochlamydomonas Mata UTEX 728 (AF367858)
Chlamydomonas asymmetrica SAG 70.72 (U70788)
Heterotetracystis akinetos UTEX 1675 (AB244242) Chlamydomonas oblonga SAG 1 l-60a* (AF395434) Chlamydomonas rapa SAG 78.72 (U70790) Fasciculochloris boldii UTEX 1451 * (AB244240) Chlamydomonas baca SAG 24.87 (U70781)
- Neochlorosarcina auxotrophica UTEX 722 (AB218696)
Neochlorosarcina deficiens UTEX 1700* (AB218697) Neochlorosarcina pseudominor UTEX 1702* (AB218714) Chlamydomonas reinhardtii CC-400 (M32703) Volvox carteri UTEX 1885 (X53904)
Chlamydomonas zebra SAG 10.83* (U70792) Pautschulzia pseudovolvox UTEX 167 (U83120) Tetraspora sp. UTEX 234 (U83121) Hemiflagellochloris cf. kazakstanica ACSS1 100 (KF652114) Hemiflagettochloris kazakstanica N1ES-1722* (AB244244) - Trebouxia asymmetrica SAG 48.88* (Z21553) -Trebouxia aggregata SAG 219-ld* (EU123942)
Cartería клада 1
Chloromonas клада
Lobochlamys клада Oogamochlamys клада
Desmotetra клада Heterochlamydomonas клада
'Asymmetrica 'клада Neochlorosarcina клада
Volvox клада
Trebouxiophyceae (внешняя группа)
0.05
вителями родов колониальных зеленых водорослей Paulschulzia Skuja, Tetraspora Link и Volvox L., монадной водорослью Chlamydomonas Ehr. и сарциноидной Hemiflagellochloris. Последний род имеет зооспоры с двумя жгутиками, сильно неравными по длине. Volvox-клада является сестринской для клад Neochlorosarcina и 'Asymmetrica' (рис. 2). В кладе 'Asymmetrica' есть роды с неравными жгутиками: зооспоры Fasciculochloris и Heterotetracystis (клада 'Asymmetrica') имеют по два анизоконтных жгутика. Еще два представителя зеленых водорослей также имеют анизоконтные жгутики: Heterochlamydomonas (клада Heterochlamydomonas) и Spermatozopsis similis. Однако в последнем случае морфологическое описание вида не согласуется с родовым диагнозом — с наличием четырех равных жгутиков у остальных представителей Spermatozopsis Korshikov. По данным анализа 18S рДНК (рис. 2) S. similis близок к первой кладе Carteria.
Заключение
Сравнительный анализ последовательностей фрагмента 18S рДНК подтвердил самостоятельность рода Hemiflagellochloris и принадлежность к нему штамма ACS SI 100, который был изолирован из погребенного солонца в зоне сухих степей (северная часть Ерге-нинской возвышенности, Волгоградская обл.). Таким образом, впервые на территории России был обнаружен представитель данного рода. В морфологии описанного штамма имеются отличия от диагноза голотипа H. kazakhstanica, а именно более крупные размеры вегетативных клеток (до 30 мкм в диам.) и зооспор (до 7 мкм шир. и до 15 мкм дл.), более толстая слизистая оболочка в старой культуре (до 5-6 мкм). Согласно морфологической концепции вида, этих оснований могло бы быть достаточно для описания нового таксона. С позиций современной систематики зеленых водорослей, новый таксон может быть выделен при использовании полифазного подхода, комбинируя морфологические, экологические и молекулярные данные, что мы и попытались сделать. Тем не менее, вопрос о принадлежности данного штамма к типовому виду Hemiflagellochloris kazakhstanica остается открытым и требует дальнейшего изучения с применением других молекулярных маркеров, например rbcL и ITS2.
Фрагмент ядерного гена 18S рДНК исследованного штамма Hemiflagellochloris cf. kazakhstanica ACSSI 100 был депонирован в GenBank под номером KF652114. Штамм ACSSI 100 был передан в международные альгологические коллекции: коллекцию культур водорослей Киевского национального университета им. Т. Шевченко (ACKU) и коллекцию водорослей и цианобактерий Башкортостана (BCAC).
Благодарности
Авторы благодарят зав. кафедрой ботаники Учебно-научного центра «Институт биологии» Киевского национального университета им. Т. Шевченко И. Ю. Костикова за консультации и валидацию штамма ACSSI 100 Hemiflagellochloris cf. kazakhstanica.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 14-04-31016 мол_а и 12-04-00385 и.
Литература
[Dobrovolskiy, Urusevskaya] Добровольский Г. В., Урусевская И. С. 2004. География почв. М.: 460 с.
Doyle J. J., Dickson E. 1987. Preservation of plant samples for DNA restriction endo-
nuclease analysis. Taxon. 36: 715-722. Katana A., Kwiatowski J., Spalik K. et al. 2001. Phylogenetic position of Koliella (Chlorophyta) as inferred from nuclear and chloroplast small subunit rDNA. J. Phycol. 37(3): 443-451. Watanabe S., Mitsui K., Nakayama T., Inouye I. 2006a. Phylogenetic relationships and taxonomy of sarcinoid green algae: Chlorosarcinopsis, Desmotetra, Sarcinochla-mys gen. nov., Neochlorosarcina, and Chlorosphaeropsis (Chlorophyceae, Chlorophyta). J. Phycol. 42(3): 679-695. Watanabe S., Tsujimura S., Misono T. et al. 2006b. Hemiflagellochloris kazakhstanica gen. et sp. nov.: a new coccoid green alga with a flagella of considerably unequal lengths from a saline irrigation land in Kazakhstan (Chlorophyceae, Chlorophyta). Phycologia. 42(3): 696-706.
References
Dobrovolskiy G. V., Urusevskaya I. S. 2004. Geografiya pochv [Soil geography].
Moscow: 460 p. (In Russ.). Doyle J. J., Dickson E. 1987. Preservation of plant samples for DNA restriction endo-
nuclease analysis. Taxon. 36: 715-722. Katana A., Kwiatowski J., Spalik K. et al. 2001. Phylogenetic position of Koliella (Chlorophyta) as inferred from nuclear and chloroplast small subunit rDNA. J. Phycol. 37(3): 443-451. Watanabe S., Mitsui K., Nakayama T., Inouye I. 2006a. Phylogenetic relationships and taxonomy of sarcinoid green algae: Chlorosarcinopsis, Desmotetra, Sarcinochla-mys gen. nov., Neochlorosarcina, and Chlorosphaeropsis (Chlorophyceae, Chlorophyta). J. Phycol. 42(3): 679-695. Watanabe S., Tsujimura S., Misono T., Nakamura S., Inoue H. 2006b. Hemiflagellochloris kazakhstanica gen. et sp. nov.: a new coccoid green alga with a flagella of considerably unequal lengths from a saline irrigation land in Kazakhstan (Chloro-phyceae, Chlorophyta). Phycologia. 42(3): 696-706.
