Выбор подхода при идентификации почвенных коккоидных зеленых микроводорослей (Trebouxiophyceae, Chlorophyta) Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

УДК 631.466.3

ВЫБОР ПОДХОДА ПРИ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПОЧВЕННЫХ КОККОИДНЫХ ЗЕЛЕНЫХ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ (TREBOUXIOPHYCEAE, CHLOROPHYTA)

© 2018 г. А. Д. Темралеева*, С. В. Москаленко, Е. А. Портная

Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения

РАН,

Россия, 142290 Пущино, ул. Институтская, 2 * http://orcid.org/0000-0002-3445-0507 е-mail: temraleeva.anna@gmail.com Описываются морфологический и молекулярно-генетический подходы, использованные при идентификации зеленых микроводорослей класса Trebouxiophyceae из коллекции ACSSI. В бурой полупустынной и каштановой почвах были обнаружены водоросли Muriella terrestris, в погребенной лугово-каштановой почве - Edaphochlorella mirabilis. Еще 3 штамма являются новыми неописанными таксонами: ACSSI 014 - новый вид рода Watanabea, изолированный из серой лесной почвы и имеющий пиреноид с крахмальной обверткой в отличии от типового вида, и ACSSI 104 и 144 -NanшcЫoris-подобный род, представители которого найдены в солонце и каштановой почве и обладают скудными морфологическими признаками. Показано, что ни один критерий в отдельности: морфологический или иной признак, вычисление генетических дистанций, анализ и сравнение вторичной структуры ITS2, поиск компенсаторных замен и молекулярных подписей - не позволяет надежно классифицировать таксоны. В связи с чем необходимо использовать полифазный подход в систематике водорослей, особенно при идентификации таксонов с простой клеточной морфологией, которые часто встречаются в почвах.

Ключевые слова: дистанции, молекулярные подписи, 18S рРНК, вторичная структура ITS2, ACSSI DOI: 10.19047/0136-1694-2018-93-105-120

ВВЕДЕНИЕ

Почвенные водоросли - разнообразная группа фототрофных микроорганизмов, обитающих на поверхности и в толще почвы и отражающих ее генезис и состояние (Штина и др., 1998). Про- и эу-кариотические водоросли являются неотъемлемым компонентом почвенной микрофлоры и выполняют важные функции накопления

органического вещества, азотфиксации, противоэрозионной деятельности, участвуют в малом биологическом круговороте и влияют на водный режим почвы (Голлербах, Штина, 1969). Надежность их таксономической идентификации имеет в первую очередь чисто утилитарную, прикладную роль для всех аспектов их изучения, так как работа с любым биологическим объектом невозможна без его определения. Каждый из современных методов идентификации, основанный на анализе морфологических, биохимических, ультраструктурных, экологических и молекулярно-генетических данных, решает эту задачу с большим или меньшим успехом, имея разные преимущества и ограничения. Поэтому комплексный подход (polyphasic approach), комбинирующий несколько методов, значительно повышает надежность идентификации. Преимуществом классического ботанического подхода, основанного на сравнении морфологических признаков зеленых водорослей, является большой объем данных, накопленный в течение нескольких сотен лет. К недостаткам следует отнести трудности идентификации критических видов, а также видов со скудной морфологией. Так, повсеместно распространенные в различных биотопах мелкие коккоид-ные зеленые микроводоросли вызывают значительные затруднения при идентификации из-за простоты строения. Однако хорошо разделяются методами молекулярной систематики (Zhang et al., 2008; Neustupa et al., 2009, 2013; Krienitz et al., 2011; Somogyi et al., 2011; Darienko et al., 2010, 2016; Fucikova et al., 2014; Song et al.; 2015; Barcyte et al., 2017).

Целью настоящей работы стала идентификация некоторых коккоидных зеленых микроводорослей из коллекции ACSSI на основе анализа морфологических признаков, гена 18S рРНК и спей-сераITS2.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ

Изоляция и культивирование штаммов водорослей. Объектами исследования стали восемь штаммов зеленых микроводорослей класса Trebouxiophyceae (Chlorophyta), депонированных в Альгологическую коллекцию ACSSI (http://acssi.org) под номерами 014, 060, 102, 104, 122, 130, 135 и 144. Штаммы изолировали из почвенный образцов (табл. 1) при нанесении почвенной суспензии на

Таблица 1. Характеристика изученных ^ штаммов ACSSI

Порядок Вид № Почва*

Chlorellales Muriella terrestris 060 Бурая полупустынная

почва. Калмыкия

122 Каштановая пахотная

почва. Волгоградская об-

ласть

135 Каштановая почва. Волго-

градская область

130 Каштановая почва. Волго-

градская область

Nannochloris sp. 104 Солонец. Волгоградская

область

144 Каштановая почва. Волго-

градская область

Trebouxiales Watanabea 014 Серая лесная почва. Мос-

pyrenoidosa ковская область

sp.nov.

Trebouxiophyceae Edaphochlorella 102 Погребенная лугово-кашта-

ordo incertae sedis mirabilis новая почва. Волгоградская

область

* Название почвы дано в полевых условиях с последующим лабораторным уточнением в соответствии с классификацией почв СССР (Классификация .... 1977).

твердую питательную среду BG11 с азотом (1% агар, pH 7.0) и дальнейшем многократном пересеве отдельных колоний до получения альгологически чистых культур. Все изоляты культивировали в климатостате при стандартных условиях (температура 23-25°С, свет 60-75 цмоль фотонов /(м2 с), фотопериод 12 ч).

Микроскопия. Изучение морфологии и жизненных циклов штаммов проводили методами световой микроскопии (светлое поле и интерференционный контраст) с помощью микроскопов Leica DM750 "Leica microsystems" и Carl Zeiss Axio Scope A1 "Carl Zeiss Microscopy GmbH" (Германия) в ЦКП ИФХиБПП РАН. Результаты наблюдений документировали рабочими рисунками и фотографиями, снятыми с помощью цветных цифровых камер "Видеозавр" (Россия) и Carl Zeiss MRc 5 (Германия). Для таксономической идентификации проводили несколько прижизненных цитохимических реакций: на крахмал - раствором Люголя, на слизь - 1%-ным раствором туши. Сроки

наблюдения за штаммами составляли до 6 месяцев. При морфологической идентификации штаммов зеленых микроводорослей учитывали тип организации таллома, наличие и толщину слизистых оболочек, количество и тип хлоропластов, наличие и структуру пиреноида, форму и размеры клеток, способы размножения и другие характеристики. Названия таксонов приведены согласно Международной электронной базе данных AlgaeBase (Guiry, Guiry, 2018).

Выделение, амплификация, очистка и секвенирование ДНК. ДНК выделяли из биомассы микроводорослей с помощью набора DNeasy Plant Mini Kit "Qiagen" (США), следуя протоколу производителя. При амплификации использовали готовую смесь для ПЦР Screen Mix-HS "Евроген" (Россия). Для амплификации гена 18S рРНК выбрали праймеры и условия из статьи Katana et al. (2001), для ITS2 использовали универсальные праймеры из статьи White et al. (1990) с оптимизированными условиями ПЦР: 95°С - 3 мин; 95°С -30 с, 57.6°C - 30 с, 72°С - 1 мин, 35 циклов; 72°С - 10 мин. Детекцию целевых ПЦР-продуктов проводили электрофоретически в 1%-ном агарозном геле. Для дальнейшей очистки ампликонов из геля применяли набор Cleanup Mini "Евроген" (Россия). Секвенирование нук-леотидных последовательностей осуществляли на базе ЗАО "Син-тол" (Россия).

Молекулярно-филогенетический анализ. Для молекулярно-филогенетического анализа была составлена выборка из 55 последовательностей гена 18S рРНК штаммов зеленых микроводорослей, которая включала собственные данные и данные GenBank. Выравнивание нуклеотидных последовательностей выполнили в программе BioEdit по алгоритму ClustalW. Общая длина анализируемых последовательностей для гена 18S рРНК составила 1772 п.н. При наличии интронов в гене 18S рРНК они были удалены из выравнивания. Для выбора модели нуклеотидных замен использовали программу jModelTest. Реконструкцию филогенетических взаимосвязей осуществляли методом максимального правдоподобия (ML) в программе PhyML. В качестве внешней группы выбрали представителя другого класса (Chlorophyceae) - Tetracystis tetraspora SAG 98.80. Статистическая поддержка топологии деревьев была оценена с помощью бутстреп-анализа (1000 повторностей) и указана в узлах ветвей. Генетические различия между нуклеотидными последовательностями охарактеризовали с помощью генетических дистанций.

Мерой генетических различий являлся процент несовпадений нук-леотидов при попарном сравнении выровненных последовательностей, вычисление которого провели в программе MEGA 5.0. Для анализа вторичной структуры ITS2 выполняли аннотацию спейсера в ITS2 DataBase (http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de), его фолдинг с помощью веб-сервера Mfold (http://unafold.rna.albany.edu) и визуализацию с помощью программы PseudoViewer3 (Byun, Han, 2009). Сравнение вторичной структуры между штаммами, поиск консервативных мотивов и компенсаторных замен осуществляли в программе 4SALE (Seibel et al., 2006). При оценке правильности фол-динга ITS2 Chlorophyta ориентировались на работу Caisová et al. (2013).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Штаммы ACSSI 060, выделенный из бурой полупустынной почвы, и 122, 130 и 135, выделенные из каштановой почвы, имели мелкие размеры (диаметр клетки не превышал 5-7 мкм), шаровидную форму клетки, одно ядро, один пристенный хлоропласт у молодых клеток и несколько - у зрелых (рис. 1a-1d). Пиреноид отсутствовал, размножение - с помощью автоспор. В соответствии с описанными признаками был поставлен предварительный морфологический диагноз - Muriella terrestris, который впоследствии подтвердился по 18S рРНК-филогении. Все штаммы рода Muriella образовали отдельную независимую кладу со 100%-ной статистической поддержкой (рис. 2). Генетические дистанции по гену 18S рРНК внутри рода не превышали 0.3%, различия с ближайшими родственниками из рода Chlorella - C. vulgaris и C. sorokiniana составили 1.2-1.5%. ITS2 изученных штаммов не отличался, компенсаторных замен (CBC) выявлено не было. Ниже приводим анализ вторичной структуры ITS2 штамма ACSSI 135 (MG696581). Длина спейсера составила 262 нуклеотида и характеризовалась нетипичной разветвленной III шпилькой (рис. 3a). Ранее у некоторых зеленых водорослей была показана раздвоенная I шпилька, которая является апоморфным признаком представителей "core Sphaeropleales" (Keller et al., 2008). Раздвоенная III шпилька ITS2 зеленых микроводорослей рода Muriella описывается впервые.

Рис. 1. Фотографии штаммов Muriella terrestris ACSSI 060 (a), ACSSI 122 (b), ACSSI 130 (c), ACSSI 135 (d); Nannochloris sp. ACSSI 104 (e), ACSSI 144 (f); Edaphochlorella mirabilis ACSSI 102 (g); Watanabeapyrenoidosa sp. nov. ACSSI 014 (h). Шкала 10 мкм.

МипеЛат М,,,Ш1и1е г МиггсИл гр

100 I- мпгыы т

МипеНа се.ггеято АС881122 (МС696561) I

МипсПа тдав 1_Н08£03009 (КХ094763) !|

1а мггеза-и АСЬ5113(1 (МОб4656«) I

1. 060 (МСА96559) Ч

74 ЛСЯИ135 (МС69й564> (

■ МигкШ нтдой А£1Б V?« (АБ012845) I МипеПа N5 (КХ0947А11 1|

■ МчгкПа 5р. Ь21) (КХ094760) / Си.,. !,',.■,■".'■.. ,,„ АЛГ, ': )

■ СМомНа зогоЫтаиа и'ГЕХ 2805 (АМ4231Й) *

........о ЗАО 11 I-Як" (ТМ205834) I

Ь »р. .\CSS1144 {МС6963651 1 Л1птюсМи! а п. АСЯ.Ч1 104 (М 1 НалпасЫиги Г1. 4-6 (ЛУI95983)

'"0_г \<зппоск!огЬсоссаМа ССЛГ251- 1Ь (ЛШМШ1) и МаптШ ди/пмат НЛО 12.»8 (01020037) ■жга аяЖфЬИа ВЛС! 15.41" (КМ020039) июсМогй тасикпа ССАР 251-Л (ЛВ1К1Ш2) ■ КаппосЫот лттю ССАР251/7 (АВ080303) киясЫеШ ЫЫю«,? ССА1А 3 07* (КХ<5209 13)

Сшитули илаГгвг;ДК1В VI6 (110972994) туш.мзьа 2353 {1109~297]} 1 Сжеоткел юЬеШрмйШ ССАР 812Й <НС973972) '■а У!1ЫШр\Ше/> САЦР Н51П5 «НС472974) а хаШ'цяоЫеа 216-7* (НС»72976| и Ып'Шр.Чин!еа 5АО 09.80 (НЦ972У77) оеем&ха ниШШ'Жа 5АО 216-13 (ЫЩ7297В) - СЛюеотми рактогрка СЛиР Ш101 (НЦУ72Ч79| сЫств собаегепх 11ТГ,У 1707* (ГОЯ783721 акт юм 540 2007* (АУ7626(12) аО I МарЬгиМимИи тЬаЫП* АСЙЯТ 1 П2 ^

ГГН| ЯАфЛосЫигвОа тмЬШч КАП .1К.ЙЯ" (Г.Т360369) I

"'П ЬеЬфЬосЫопИа т/гаЬИп ЙЛО 211 -11 г Ш. 5ЫИ70) (

1 Ыф/юсШгеШтп-аЫ/Е ЪАО 211-30 (1'1'?«0371) )

■™> - " \emperwrens ССА1.А 363 (АМ412750) Шатки Я АО ЗАЛО* (А.1.111ЛИП КЫкМ Ьпяная ЙАО 470-14 (А130б?35) ' а иШек.га ЗАО 7.90* (КМ 1164641 ■¿ШосМ'Ж'Ш гнт&Ьеиыи 211-1а* (1Л"5<ЙЭ5<0

..........1Т.НИ1НС2Ш {КХ094К27)

ососсм ^р. 1.Н08805079 (КХ094&25) ■•щ' ¿топа 5АС 51-Й* ЬааНапч ССАР 379/5 fK.I7.S6S41) жЫапя тгтипЛкае. 5АС1 9.52* (КМ020167) 'кЛж-ргсиг пфцЫП* СС^АР 379/3 (АЛЛ 11 <¡38) Рэеис/тпскосмгкз топаПаптШ вАО 380-1 * (КМС2006Й) 1ГТГХ Я.Ч6* (Г11Я7Я373)

ШеПситл ?л0 10.152* |ТКГ95?4$ I) Иа1ипаЬеарутааШха АС'ЯЙ! 014 (МП696555) Л Ша/шЬеа «р. 13СР-ЯГ;У2\Т2 (КР6«805) 1

ШиииЬеа яр. ВСР-Х ЁV1 {КНС^З ^(54> |

ЧЫанаЬеа геп(/отав ЙЛ0211-9Ь' (№1^8480) )

СШп>и1шм ¡асс/мтрШа ЗЛО 211 -9а" (ШЯ460СЩ) - СШтиНнм стушШгПцтжГка ЗЛО 2115* (РМ946019)

ЕйаркосМогеИа

\Valanithea

чрога 5АС! 9R.R0* |.ГЧ06А5Я2)

0.01

Рис. 2. Укорененное филогенетическое дерево зеленых микроводорослей класса Trebouxюphyceae, построенное методом максимального правдоподобия (ML), на основе последовательностей гена 18S рРНК. В качестве статистической поддержки узлов дерева указаны бутстреп-значения ML; значения <70% не показаны. Модель нуклеотидных замен: GTR+I+G. Жирным шрифтом выделены штаммы АСББ^ звездочкой отмечены аутентичные штаммы. Цифрами на сером фоне обозначены представители полифилетичного рода МаппоеИ1ог18.

Штаммы ACSSI 104 и 144, изолированные из солонца и каштановой почвы, соответственно, характеризовались очень простой морфологией сходной с МусЪопа$1е5 НотозрНаега: мелкие шаровидные клетки 3-5 мкм в диаметре, одно ядро и один пристенный хлоропласт, отсутствие пиреноида, размножение автоспорами (рис. 1е-1Г). По литературным данным МусЪопа51е5 НотозрНаега повсеместно встречается в почвах России (Андреева, 1998). Однако 18S рРНК-анализ установил местоположение обоих штаммов в классе ТгеЬоихюрИусеае, а не СЫогорИусеае, где находится род МусЪопа51е5 (КЬеп^ е1 а1., 2011). Вероятно, что представители родаМусЪопа$1е5 распространены в водных экосистемах, а находки МусНопаз(е8 НотозрНаега в почвах сомнительны. На дереве 18S рРНК штаммы ACSSI 104 и 144 кластеризовались со штаммом, идентифицирован-

Рис. 3. Сравнение вторичной структуры ITS2Muriella terrestris ACSSI 135 (a) и Edaphochlorella mirabilis ACSSI 102 (b). Стрелками отмечены консервативные мотивы II и III шпилек, черными точками - компенсаторные замены.

ным как Nannochloris sp. Однако род Nannochloris оказался поли-филеточным: виды Nannochloris eucaryotum, Nannochloris maculata и Nannochloris atomus перешли в новый род Picochlorum, Nannochloris coccoides в новый род Marvania (Henley et al., 2004). Штаммы ACSSI с Nannochloris/Mychonastes-подобной морфологией не группируются ни с Mychonastes, который относится к

другому классу водорослей - Chlorophyceae, ни в пределах класса Trebouxiophyceae с истинным представителем рода - аутентичным штаммом Nannochloris normandinae SAG 9.82. Это позволяет предположить, что изученные штаммы являются видами нового неописанного рода класса Trebouxiophyceae с очень простой морфологией и, по-видимому, широко распространены в почвах. Генетические дистанции по 18S рРНК гену между штаммами внутри предлагаемого рода составили 0%, с близкими родами Marvania и Pumiliosphaera - 2.1 и 1.2% соответственно.

Штамм ACSSI 102, изолированный из погребенной лугово-каштановой почвы (возраст погребения около 2 тыс. лет), по данным морфологии идентифицирован как Chlorella mirabilis. Он обладал следующими признаками (рис. 1g): клетки одиночные, шаровидные, 3-8 мкм в диаметре; хлоропласт один пристенный, чашевидный; пиреноид один хорошо заметный, с крахмальной обверткой из мелких зерен; ядро одно, с трудом различимо; размножение автоспорами шаровидной, яйцевидной или коротко эллипсовидной формы, обычно по 2-4; пустые оболочки автоспорангиев в культуре отсутствуют. Также ранее показано присутствие спорополле-нина, устойчивого к химическому и биологическому воздействию биополимера, в клеточной стенке штамма ACSSI 102 (Temraleeva et al., 2017). Данный вид не группировался с истинными хлореллами, например, с C. vulgaris и C. sorokiniana, и на этом основании недавно был перенесен в новый род - Edaphochlorella (Darienko et al., 2016). 18S рРНК-анализ подтвердил принадлежность изученного штамма данному роду. В гене 18S рРНК была только 1 замена при сравнении с аутентичным штаммом E. mirabilis SAG 38.88. Вторичная структура ITS2 исследованного штамма (MG523284) оказалась практически идентичной ITS2 аутентичного штамма SAG 38.88. CBC между штаммами выявлено не было. Спейсер имел все отличительные признаки вторичной структуры ITS2 зеленых водорослей (Coleman, 2007; Buchheim et al., 2011; Caisova et al., 2013): длина 264 нуклеотида; 4 неразветвленные шпильки (helix); пиримидин-пиримидиновое несовпадение (mismatch) - неспаренный участок U-U, U-C, C-C во II шпильке; III шпилька самая длинная и содержит мотив 5' GGUAGG 3' на верхушке (рис. 3b). Сравнение вторичных структур ITS2 двух родов Muriella (ACSSI 135) и Edaphochlorella

(ACSSI 102) показало наличие 7 компенсаторных замен, причем 4 из них в консервативной III шпильке.

Таким образом, ACSSI 102 был идентифицирован как Edaphochlorella mirabilis - вид, который, вероятно, повсеместно распространен в современных дневных почвах, а также способен сохраняться за счет мелких размеров и присутствия в клеточной стенке спорополленина в погребенных тысячи лет назад почвах.

Еще один интересный представитель класса Trebouxiophyceae - штамм ACSSI 014 - изолирован из серой лесной почвы. Он был морфологически сходен с членами рода Elliptochloris (рис. 1h): клетки одиночные, молодые эллипсоидно-удлиненной формы 3.5-5.0 мкм шириной и 7.0-10 мкм длиной, по мере старения приобретают широкоэллипсоидную или шаровидную форму диаметром 5.0-10 мкм; оболочка тонкая; хлоропласт в молодых клетках лентовидный, занимает половину клеточного пространства, в зрелых клетках лопастной, рассеченный, занимает почти все пространство; ядро одно; пиреноид один, с обверткой из нескольких крупных зерен крахмала, в зрелых клетках иногда плохо различим; автоспоры крупные по 2-4 эллипсоидные или яйцевидные (иногда 1 автоспора может быть крупнее остальных) или мелкие по 16-32 заостренные эллипсоидные или яйцевидные (одинакового размера); 1-2 автоспоры часто остаются внутри спорангия. Зооспоры и половой процесс у штамма за весь период наблюдения отмечены не были. Однако 18S рРНК-анализ неожиданно утвердил положение исследуемого штамма внутри клады Watanabea. При сравнении последовательностей гена 18S рРНК штамма ACSSI 014 и аутентичного штамма W. reniformis SAG 211-9b выявлена одна замена и наличие интрона длиной 362 п.н. у последнего. Кроме того, от W. reniformis штамм ACSSI 014 отличался формированием большего количества автоспор, наличием пиреноида с крахмальной обверткой и почвенным, а не водным местообитанием. Таким образом, приведенные различия могут быть основанием для выделения данного штамма в новый вид - W. pyrenoidosa sp. nov. и изменения морфологического диагноза рода Watanabea.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Несмотря на возможность использования различных подходов: описательной морфологии и морфометрии, учета

биохимических, физиологических и экологических показателей, вычисления генетических дистанций, анализа и сравнения вторичной структуры ITS2, поиска компенсаторных замен и молекулярных подписей - общей проблемой при идентификации маленьких зеленых шариков - почвенных коккоидных зеленых микроводорослей остается субъективность выбора признака (морфологической или иной характеристики, молекулярного маркера) и установление его границ для конкретной таксономической категории. Поэтому в настоящее время в систематике водорослей принят полифазный подход, который отражает высказывание одного из основателей теории эволюции Ч. Дарвина: "Нет никакого сомнения, что организмы, подобно другим предметам, могут быть классифицированы различно: или искусственно, на основании отдельных признаков, или более естественно, на основании суммы признаков" (1991).

БЛАГОДАРНОСТЬ

Авторы выражают признательность зав. кафедрой ботаники Учебно-научного центра "Институт биологии" Киевского национального университета им. Т. Шевченко, д.б.н., проф. И.Ю. Костикову за ценные консультации по анализу вторичной структуры ITS2, а также к.б.н., с.н.с. лаборатории археологического почвоведения ИФХиБПП РАН М.В. Ельцову за организацию полевой экспедиции, помощь в описании почв и отборе образцов.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта №16-34-60020 мол_а_дк.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Андреева 5.М.Почвенные и аэрофильные зеленые водоросли (Chlorophyta: Tetrasporales, Chlorococcales, Chlorosarcinales). СПб.: Наука, 1998. 351 с.

2. ГоллербахМ.М., Штина Э.А. Почвенные водоросли. Л.: Наука, 1969. 228 с.

3. Дарвин Ч. Происхождение видов путем естественного отбора. Л.: Наука, 1991. 539 с.

4. Классификация и диагностика почв СССР. М.: Колос, 1977. 224 с.

5. Штина Э.А., Зенова Г.М., Манучарова Н.А. Альгологический мониторинг почв // Почвоведение. 1998. № 12. С.1449-1461.

6. Barcyte D., Hodac L., Nedbalová L. Lunachloris lukesovae gen. et sp. nov. (Trebouxiophyceae, Chlorophyta), a novel coccoid green alga isolated from soil

in South Bohemia, Czech Republic // European J. of Phycology. 2017. V. 52. No. 3. P. 281-291

7. Buchheim M.A., Keller A., Koetschan C. et al. Internal transcribed spacer 2 (nu ITS2 rRNA) sequence-structure phylogenetics: to-wards an automated reconstruction of the green algal tree of life // PLoS ONE. 2011. V. 6. No. 2. P. e16931.

8. Byun Y., Han K. PseudoViewer3: generating planar draw-ings of large-scale RNA structures with pseudoknots // Bioinformatics. 2009. V. 25. P. 1435-1437.

9. Caisova L., Marin B., Melkonian M. A Consensus Secondary Structure of ITS2 in the Chlorophyta Identified by Phylogenetic Reconstruction // Protist. 2013. V. 164. P. 482-496.

10. Coleman A. W. Pan-eukaryote ITS2 homologies revealed by RNA secondary structure // Nucleic Acids Res. 2007. V. 35. P. 3322-3329.

11. Darienko T., GustavsL., Mudimu O., Menendez C.R., SchumannR., Karsten U., Friedl T., Proschold T. Chloroidium, a common terrestrial coccoid green alga previously assigned to Chlo-rella (Trebouxiophyceae, Chlorophyta) // European J. of Phycology. 2010. V. 45. No. 1. P. 79-95.

12. Darienko T., Gustavs L., Pröschold T. Species concept and nomenclatural changes within the genera Elliptochloris and Pseudochlorella (Tre-bouxiophyceae) based on an integrative approach // J. Phycol. 2016. V. 52. P. 1125-1145. doi: 10.1111/jpy.12481

13. Fucikova K., Lewis P.O., Lewis L.A. Widespread desert affiliation of tre-bouxiophycean algae (Trebouxiophyceae, Chlorophyta) including discovery of three new desert genera // Phycol. Res. 2014. V. 62. No. 4. P. 294-305.

14. Guiry M.D., Guiry G.M. AlgaeBase // World-wide electronic publication, National University of Ireland, Galway. 2018. URL: http://www.algaebase.org (searched on 19 March 2018)

15. Henley W.J., Hironaka J.L., Guillou L., Buchheim M.A., Buchheim J.A., Fawley M.W., Fawley K.P. Picochlorum oklahomensis gen. et sp. nov. (Trebouxiophyceae, Chlorophyta) // Phycologia. 2004. V. 43. P. 641-652.

16. Katana A., Kwiatowski J., Spalik K., Zakrys B., Szalacha E., Szymanska H. Phylogenetic position of Koliella (Chlorophyta) as inferred from nuclear and chloroplast small subunit rDNA // J. Phycol. 2001. V. 37. No. 3. P. 443-451.

17. Keller A., Schleicher T., Förster F., Ruderisch B., Dandekar T., Müller T., Wolf M. ITS2 data corroborate a monophyletic chlorophycean DO-group (Sphaeropleales) // BMC Evol Biol. 2008. V. 8. P. 218. doi: 10.1186/14712148-8-218

18. KrienitzL., Bock C., Dadheech P.K., Proschold T. Taxonomic reassessment of the genus Mychonastes (Chlorophyceae, Chlorophyta) including the description of eight new species // Phycologia. 2011. V. 50. No. 1. P. 89-106.

19. Neustupa J., Nemcova Y., ElieasM., SkaloudP. Kalinella bambusicola gen. etsp. nov. (Trebouxiophyceae, Chlorophyta), a novel coccoid Chlorella-like

subaerial alga from Southeast Asia // Phycological Research. 2009. V. 57. No. 3. P. 159-169.

20. Neustupa J., Nemcova Y., Vesela J., Steinova J., Skaloud P. Parachloroidium gen. nov. (Trebouxiophyceae, Chlorophyta), a novel genus of coccoid green algae from subaerial corticolous biofilms // Phycologia. 2013. V. 52. No. 5. P. 411-421.

21. Seibel P.N., Muller T., Dandekar T., Schultz J., Wolf M. 4SALE - A tool for synchronous RNA sequence and secondary structure alignment and editing // BMC Bioinformatics. 2006. V. 7. P. 498.

22. Somogyi B., Felfoldi T., Solymosi K., Makk J., Homonnay Z.G., Horvath G., Turcsi E., Boddi B., Marialigeti K., Voros L. Chloroparva pannonicagen. et sp. nov. (Trebouxiophyceae, Chlorophyta) - a new picoplanktonic green alga from a turbid, shallow soda pan // Phycologia. 2011. V. 50. No. 1. P. 1-10.

23. SongH.Y., Zhang Q., Liu G.X., Hu Z.Y. Polulichloris henanensis gen. et sp. nov. (Trebouxiophyceae, Chlorophyta), a novel subaerial coccoid green alga // Phytotaxa. 2015. V. 218. No. 2. P. 137-146.

24. Temraleeva A.D., Moskalenko S.V., El'tsov M.V., Vagapov I.M., Ovchinni-kov A.Yu., Gugalinskaya L.A., Alifanov V.M., Pinskii D.L. Stability and morphological and molecular-genetic identification of al-gae in buried soils // Eurasian Soil Science. 2017. V. 50. No. 8. P. 952-960. doi: 10.1134/S1064229317080129

25. White T.J., Bruns T., Lee S., Taylor J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics // PCR Protocols. San Diego: Acad. Press,1990. Pt. 3. P. 315-322.

26. Zhang J., Huss V.A.R., Sun X., Chang K., Pang D. Morphology and phylo-genetic position of a trebouxiophycean green alga (Chlorophyta) growing on the rubber tree, Hevea brasiliensis, with the description of a new genus and species // European J. Phycology. 2008. V. 43. No. 2. P. 185-193.

CHOOSING AN APPROACH FOR IDENTIFICATION OF SOIL COCCOID GREEN MICROALGAE (TREBOUXIOPHYCEAE, CHLOROPHYTA)

A. D. Temraleeva, S. V. Moskalenko, E. A. Portnaya

Institute of physico-chemical and biological problems in soil science RAS, Russia, 142290, Pushchino, Institutskaya str., 2

* http://orcid.org/0000-0002-3445-0507 e-mail: temraleeva.anna@gmail.com

The article describes the morphological and molecular genetic approaches used to identify the green microalgae of the Trebouxiophyceae class from the ACSSI collection. In the brown semi-desert and chestnut soils, we found Muriella ter-restris. In the buried meadow-chestnut soil we found Edaphochlorella

mirabilis. Three more strains are characterized as new uncharacterized taxa: ACSSI 014 is a new species related to the genus Watanabea isolated from gray forest soil, with a pyrenoid surrounded by several starch grains, in contrast to the type species, and ACSSI 104 and 144 are a Nannochloris-like genus, whose representatives were found in solonetz and chestnut soil and are characterized by poor morphological specificities. It is shown that no single criterion (either morphological or other specificity, calculation of genetic distances, analysis and comparison of the ITS2 secondary structure, search for compensatory changes and molecular signatures) does not allow reliable classification of taxa. Therefore, due to this fact, it is necessary to apply a polyphasic approach in the sys-tematics of algae, especially when identifying taxa with simple cellular morphology, which are often found in soils.

Keywords: distances, molecular signatures, 18S rRNA, ITS2 secondary structure, ACSSI

REFERENCES

1. Andreeva V.M. Terrestrial and aerophilic green algae (Chlorophyta: Tetrasporales, Chlorococcales, Chlorosarcinales), Sankt-Peterburg, Nauka Publ., 1998, 351 p. (in Russian).

2. Gollerbakh M.M., Shtina E.A. Soil algae. Leningrad, Nauka Publ., 1969, 228 p. (in Russian).

3. Darvin Ch. The origin of species by means of natural selection, Leningrad, Nauka Publ., 1991, 539 p. (in Russian).

4. Classification and Diagnostics of Soils of the Soviet Union, Moscow, Kolos Publ., 1977. (in Russian).

5. Shtina E.A., Zenova G.M., Manucharova N.A. Algological monitoring of soils, Pochvovedenie, 1998, No 12, pp. 1449-1461. (In Russian).

6. Barcyte D., Hodac L., Nedbalova L. Lunachloris lukesovae gen. et sp. nov. (Trebouxiophyceae, Chlorophyta), a novel coccoid green alga isolated from soil in South Bohemia, Czech Republic, European J. Phycology, 2017, V. 52, No. 3, pp. 281-291.

7. Buchheim M.A., Keller A., Koetschan C. et al. Internal transcribed spacer 2 (nu ITS2 rRNA) sequence-structure phylogenetics: to-wards an automated reconstruction of the green algal tree of life, PLoS ONE, 2011, V. 6, No. 2, p. e16931.

8. Byun Y., Han K. PseudoViewer3: generating planar draw-ings of large-scale RNA structures with pseudoknots, Bioinformatics, 2009, V. 25, pp. 1435-1437.

9. Caisova L., Marin B., Melkonian M. A Consensus Secondary Structure of ITS2 in the Chlorophyta Identified by Phylogenetic Reconstruction, Protist, 2013, V. 164, pp. 482-496.

10. Coleman A.W. Pan-eukaryote ITS2 homologies revealed by RNA secondary structure, Nucleic Acids Research, 2007, V. 35, pp. 3322-3329.

11. Darienko T., Gustavs L., Mudimu O., Menendez C.R., Schumann R., Karsten U., Friedl T., Proschold T. Chloroidium, a common terrestrial coccoid green alga previously assigned to Chlorella (Trebouxiophyceae, Chlorophyta), European J. Phycology, 2010, V. 45, No. 1, pp. 79-95.

12. Darienko T., Gustavs L., Pröschold T. Species concept and nomenclatural changes within the genera Elliptochloris and Pseudochlorella (Trebouxiophyceae) based on an integrative approach, J. Phycology, 2016, V. 52, pp. 1125-1145, doi: 10.1111/jpy.12481

13. Fucikova K., Lewis P.O., Lewis L.A. Widespread desert affiliation of tre-bouxiophycean algae (Trebouxiophyceae, Chlorophyta) including discovery of three new desert genera, Phycological Research, 2014, V. 62, No. 4, pp. 294305.

14. Guiry M.D., Guiry G.M. AlgaeBase, World-wide electronic publication, National University of Ireland, Galway, 2018. http://www.algaebase.org; searched on 19 March 2018.

15. Henley W.J., Hironaka J.L., Guillou L., Buchheim M.A., Buchheim J.A., Fawley M.W., Fawley K.P. Picochlorum oklahomensis gen. et sp. nov. (Trebouxiophyceae, Chlorophyta), Phycologia, 2004, V. 43, pp. 641-652.

16. Katana A., Kwiatowski J., Spalik K., Zakrys B., Szalacha E., Szymanska H. Phylogenetic position of Koliella (Chlorophyta) as inferred from nuclear and chloroplast small subunit rDNA, J. Phycology, 2001, V. 37, No. 3. pp. 443-451.

17. Keller A., Schleicher T., Förster F., Ruderisch B., Dandekar T., Müller T., Wolf M. ITS2 data corroborate a monophyletic chlorophycean DO-group (Sphaeropleales), BMC Evolutionary Biology, 2008, V. 8, p. 218, doi: 10.1186/1471-2148-8-218.

18. Krienitz L., Bock C., Dadheech P.K., Proschold T. Taxonomic reassessment of the genus Mychonastes (Chlorophyceae, Chlorophyta) including the description of eight new species, Phycologia, 2011, V. 50, No. 1, pp. 89-106.

19. Neustupa J., Nemcova Y., Eliéas M., Skaloud P. Kalinella bambusicola gen. etsp. nov. (Trebouxiophyceae, Chlorophyta), a novel coccoid Chlorella-like subaerial alga from Southeast Asia, Phycological Research, 2009. V. 57, No. 3, pp. 159-169.

20. Neustupa J., Nemcova Y., Vesela J., Steinova J., Skaloud P. Parachloroid-ium gen. nov. (Trebouxiophyceae, Chlorophyta), a novel genus of coccoid green algae from subaerial corticolous biofilms, Phycologia, 2013, V. 52, No. 5, pp. 411-421.

21. Seibel P.N., Muller T., Dandekar T., Schultz J., Wolf M. 4SALE - A tool for synchronous RNA sequence and secondary structure alignment and editing, BMC Bioinformatics, 2006, V. 7, p. 498.

22. Somogyi B., Felfoldi T., Solymosi K., Makk J., Homonnay Z.G., Horvath G., Turcsi E., Boddi B., Marialigeti K., Voros L. Chloroparva pannonicagen. et sp. nov. (Trebouxiophyceae, Chlorophyta) - a new picoplanktonic green alga from a turbid, shallow soda pan, Phycologia, 2011, V. 50, No. 1, pp. 1-10.

23. Song H.Y., Zhang Q., Liu G.X., Hu Z.Y. Polulichloris henanensis gen. et sp. nov. (Trebouxiophyceae, Chlorophyta), a novel subaerial coccoid green alga, Phytotaxa, 2015, V. 218, No. 2, pp. 137-146.

24. Temraleeva A.D., Moskalenko S.V., El'tsov M.V., Vagapov I.M., Ovchin-nikov A.Yu., Gugalinskaya L.A., Alifanov V.M., Pinskii D.L. Stability and morphological and molecular-genetic identification of al-gae in buried soils, Eurasian Soil Science, 2017, V. 50, No. 8, pp. 952-960, doi: 10.1134/S1064229317080129

25. White T.J., Bruns T., Lee S., Taylor J. Amplification and direct sequencing offungal ribosomal RNA genes for phylogenetics, PCR Protocols. San Diego: Acad. Press., 1990, Pt. 3, pp. 315-322.

26. Zhang J., Huss V.A.R., Sun X., Chang K., Pang D. Morphology and phylogenetic position of a trebouxiophycean green alga (Chlorophyta) growing on the rubber tree, Hevea brasiliensis, with the description of a new genus and species, European J. Phycology, 2008, V. 43. No. 2. pp. 185-193.

Ссылки для цитирования

Темралеева А.Д., Москаленко С.В., Портная Е.А. Выбор подхода при идентификации почвенных коккоидных зеленых микроводорослей (Trebouxiophyceae, Chlorophyta) // Бюл. Почв. ин-та им. В.В. Докучаева. 2018. Вып. 93. С. 105-120. doi: 10.19047/0136-1694-2018-93-105-120 Temraleeva A.D., Moskalenko S.V., Portnaya E.A. Choosing an approach for identification of soil coccoid green microalgae (Trebouxiophyceae, Chloro-phyta), Dokuchaev Soil Bulletin, 2018, V. 93, pp. 105-120. doi:10.19047/0136-1694-2018-93-105-120