CC BY
14туристов заболели гепатитом А и В. Исходя из этого, вакцинация против гепатита А и В обязательна для туристов, отправляющихся в страны, неблагополучные по вирусным гепатитам.
Заключительный доклад, сделанный американским ученым Raymond S Koff, был посвящен возможности применения комбинированой вакцины против гепатита А и В «Twinrix", содержащей 720 EL.U инактивированных частиц HAV и 20 мг рекомбинантного HBsAg. Трехкратное введение вакцины (О, 1 и 6 месяцев) обеспечивает стойкое развитие поствакцинального иммунитета. Спустя 4 года после вакцинации 100% провакцинированных лиц имели антитела к вирусу гепатита А и 95% против HBsAg.
Таким образом, выступления на пленарных и секционных заседаниях симпозиума, а также материалы, опубликованные в сборнике тезисов, подтвердили, что вакцинопрофилактика гепатита В и А - магистральный путь в достижении контроля за этими массовыми заболеваниями человечества.
М.И.Михайлов, Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН.
HCV-ИНФЕКЦИЯ. Проблеме HCV-инфекции было посвящено 60 докладов и 250 стендовых сообщений, в которых рассматривались актуальные вопросы молекулярной биологии вируса, проблемы противовирусного иммунитета, патогенеза инфекции, эпидемиологии и антивирусной терапии. На симпозиуме присутствовали ученые - авторы первых работ по изучению HCV и гепатита С - Houghton M., Prince A.M. и Feinstone S.M. и многие другие известные исследователи.
За истекшие 10 лет после открытия HCV были получены основные сведения о строении вируса, его генома и белков. Но до сих пор не выяснены два актуальных вопроса молекулярной биологии вируса: проникновение в гепатоцит и механизм ускользания от иммунного контроля, от решения которых во многом зависит успех борьбы с инфекцией. Этим проблемам биологии HCV были посвящены доклады Rice С. (США), Miyamura Т, (Япония), Prince A.M. и соавторов (США). Существуют два кандидата на роль рецептора для HCV - CD81 и рецептор для липопротеинов низкой плотности (рЛНП). В модельных экспериментах на культуре клеток показана возможность связывания оболочечных белков с большой внешней петлей CD81, но процесс слияния цитоплазматической мембраны и оболочки вируса, вероятно, рН-зависим. Учитывая, что CD81 встречается в плазматической мембране клеток многих тканей человека, кажется маловероятной его роль как истинного рецептора для HCV. Возможно, он выполняет функцию корецептора. Давно уже было обращено внимание на низкую удельную плотность вирусных частиц в сыворотке крови, что связано с ассоциацией вируса с липопротеинами низкой (ЛНП) и очень низкой плотности. Поверхность гепатоцитов покрыта рЛНП, что связано с функцией клеток печени. Анализ выделенного комплекса HCV- ЛНП показал, что он стабилен и не диссоциирует при обработке антивирусными антителами с высокой авидностью (Prince A.M. и соавторы). Возможно, что комплекс вируса с ЛНП позволяет HCV «избегать» нейтрализующих антител, В модельных экспериментах клетки, содержащие рЛНП, эффективно поглощали комлекс HCV-ЛНП. Поглощение резко снижалось при 0 градусов по Цельсию. Экспериментально показано, что как HCV, так и Е1 и комплекс Е1Е2 ассоциируют с липопротеинами в эквимолярном соотношении и даже с одной липидной эмульсией без апопротеина В.
Следующий интригующий вопрос молекулярной биологии вируса - роль гипервариабельного участка 1 (HVR1) оболочечного белка Е2. С быстрой изменчивостью данного района, приводящей к появлению новых квазивариантов, связывают развитие персистентной инфекции. Одной из первых эту гипотезу выдвинула P. Farci. На симпозиуме были доложены результаты эксперимента сотрудников Национального института здоровья США Bukh J. и соавторов по инфекционности вируса, лишенного HVR1. Авторам удалось получить клоны HCV, где белок Е2 не содержал район HVR1, но имел нативную конформацию. Этим клоном внутрипеченочно заразили шимпанзе, у которой через 37 недель появились вирус-специфические антитела и еще через 3 недели вирусная РНК. Шимпанзе имела также обычный Т-клеточный ответ. Первые 7 недель титр РНК был не более 10 GE/ml, затем на 8-13 неделе
возрос до 10x4 GE/ml. Все последовательности РНК, выделенные из вирионов сыворотки, не имели участка, кодирующего HVR1. Плазмой этой обезьяны внутривенно заразили другую. У второй обезьяны на 2-й неделе появилась РНК в крови, но опять виремия была не более 10 GE/ml. В течение 3-9-ой недели титр РНК увеличился до 10x4-10x5 GE/ml. Специфический Т-клеточный ответ был обычным. Все последовательности РНК опять не имели области HVR1. Кроме того, как у первой, так и у второй шимпанзе были найдены в РНК всего 4 мутации, причем только одна в белке Е2. Итак, без HVR1 вирус остается инфекционным, хотя течение гепатита С несколько меняется, что выражается в низком уровне РНК в начале болезни. Авторы считают, что это свидетельствует о возможности аттенуирования вируса.
Изучение HCV-инфекции и испытание фармакологических веществ с антивирусным эффектом во многом сдерживает отсутствие лабораторных моделей для экспериментов: доступных и дешевых мелких животных и длительно перевиваемых клеточных культур. Исследователи из Израиля Dagan S и соавторы представили на симпозиуме свои результаты по работе с лабораторными мышами, в портальные тракты печени которых были имплантированы фрагменты печени человека, инфицированного HCV. У мышей в имплантатах показана репликация РНК, а через 8 дней после имплантации РНК была обнаружена в сыворотке. Пик виремии наблюдался в 18-25 дни эксперимента. На этой лабораторной модели было испытано действие человеческих моноклональных антител (МАК-Е) против оболочечных белков на течение HCV-инфекции. При введении МАК-Е мышам количество анти-HCV положительных животных снизилось. Был проведен успешный анализ антивирусных агентов, направленых против IRES участка (зона связывания с рибосомами) РНК HCV, на этой мышиной модели. По мнению авторов, они разработали удобную для анализа HCV-инфекции модель. Возможность использования трансгенных SCID мышей и трансгенных клеточных культур анализировали Black P.L. и соавторы (США). Ранее эти модели были успешно использованы для изучения HBV-инфекции. Авторам удалось получить HCV-трансгенную линию человеческих гепатоцитов, в которой они наблюдали в течение 12 месяцев стабильную репликацию РНК HCV. В крови SCID мышей, которым подкожно вводили HepG2 клетки, инфицированные HCV, был обнаружен вирус. На этих моделях авторы показали возможность анализа фармакологических веществ с потенциальным антивирусным эффектом, направленным против полимеразы HCV.
В зоне пристального внимания исследователей находится иммунитет при HCV-инфекции. Интересные данные были представлены Bukh J. и соавторами (США). Шимпанзе-реконвалесцент с выраженным специфическим гуморальным и клеточным иммунитетом была 3 раза последовательно инфицирована гомологичным моноклональным (один инфекционный клон) вирусом. Первое заражение дозой в 3 СШ (сокращенное обозначение одной инфекционной дозы для шимпанзе) привело к виремии продолжительностью в 2 недели. Второе заражение дозой в 32 СШ не привело к появлению РНК, что было расценено как отсутствие инфекции. Третье заражение дозой в 320 СШ привело к появлению вируса, но только с 1-й по 2-ю неделю. При анализе антител к различным эпитопам оболочечных белков в течение всех заражений было найдено увеличение гуморального ответа только к HVR1. Затем животное еще 3 раза инфицировали пулом данного изолята субтипа 1а в последовательности 64, 64, 640 СШ. При этих заражениях у шимпанзе ни разу не был обнаружен вирус. Авторы назвали такой иммунитет стерильным против данного изолята. При заражении этой шимпанзе другим изолятом субтипа 1в дозой в 100 СШ была обнаружена длительная виремия. Итак, иммунитет шимнанзе против консервативных эпитопов вирусных антигенов не защитил животное от заражения другим изолятом HCV.
Различиям Т-клеточного иммунитета при разных фазах HCV-инфекции (острой и хронической) был посвящен доклад Wedemeyer H. и соавторов (США). Обследование 8 длительных реконвалесцентов (до 12 лет после острого гепатита С) и 20 пациентов с ХГС на продукцию интерлейкинов Т-хелперов и Т-киллеров выявило, что в данных группах людей уровень интерлейкинов разный. У реконвалесцентов были более сильно выражены и имели множественную направленность Т-хелперный и Tl-киллерный ответы по данным тестов ELISPOT (чувствительный иммуноферментный анализ на интерлейкины). Интенсивный
цитотоксический ответ у пациентов с ХГС ассоциировался с воспалительными изменениями в печени. Поэтому авторы подчеркивают, что при создании терапевтических вакцин важно учесть лечебный и воспалительный эффект, вызываемый Т-киллерами. В сообщении Prezzi С. и соавт. (Италия), являющемся логическим продолжением темы предыдущего доклада, показано, что при остром гепатите С чаще и выше ответ Т1-киллеров и соотвественно продукция интерферона-гамма, при ХГС выше уровень интерлейкинов Т2-киллеров -интерлейкинов 4 и 10.
Данные по анализу Т-клеточного ответа у шимпанзе были представлены Nascimbeni M, и соавторами (США). Шимпанзе-реконвалесцент, имевшая мультиспецифичный Т1-хелперньш ответ в крови и специфичный к геликазе ответ в печени при острой инфекции, через 9,5 мес. после выздоровления вновь была 3 раза инфицирована гомологичным моноклоном в дозах: 0,32; 3,2; 32 СГО. Хотя при первом заражении РНК не обнаружили ни в крови, ни в печени, выявили изменения клеточного иммунного ответа, что было расценено как показатель инфицирования. В крови были снижены Т-клетки к Е1/Е2, геликазе, NS4, NS5a, NS5b. В печени снизились NKT клетки с 32% до 12%, а в последующие 4 недели до 5%. В это же время содержание NK. клеток увеличилось с 5% до 21% и в течение следующих 4 недель до 58%. Через 1 неделю резко увеличились Т-клетки, специфичные к геликазе, NS4, NS5a. В печени повысилось содержание NKT клеток до 26% в течение 2 недель, a NK клетки снизились до 7% в течение 4 недель. Элиминация вируса у шимпанзе произошла за 4 недели при нормальной активности АлАТ. При последующих заражениях отмечены аналогичные изменения в клеточном ответе и элиминация вируса. Авторы считают, что при всех реинфекциях шимпанзе-реконвалесцента усиление клеточного ответа носило временный характер и не привело к изменению в количестве циркулирующих Т-клеток. Эти данные представляют интерес для специалистов, занимающихся конструированием вакцины против HCV. Роли протективных антител при инфицированиии был посвящен следующий доклад (Yu M.W. и соавторы, США). Из плазмы доноров с антителами к различным белкам HCV был приготовлен препарат иммуноглобулинов (Ig-HCV), специфичных к данному вирусу. После вирусологической инактивации Ig-HCV ввели шимпанзе, контрольное животное получило альбумин. Затем всех обезьян заражали HCV в дозе 64 CID. У контрольной шимпанзе через 1 неделю появилась РНК в крови, а через 9-11 недель повысилась активность сывороточной АлАТ. У шимпанзе, получавшей Ig-HCV, не было выявлено ни РНК, ни аномальных показателей АлАТ в течение 58 недель после заражения. Пассивные, донорские антитела у шимпазне детектировались в течение 23 недель. На 59 неделе это животное было заражено тем же штаммом в дозе 64 СГО. Через неделю появилась РНК и одновременно антитела к HCV. Данный иммунологический препарат готовится к доклиническим испытаниям.
На симпозиуме были представлены данные по созданию новых методов анализа маркеров HCV-инфекции. В ранний период острого гепатита С существует «окно», когда еще не определяются антитела и может не детектироваться РНК. Но в это время вирус уже присутствует в крови, его можно выявлять по наличию нуклеокапсидного белка. Данные по клиническому применению нового иммуноферментного теста (Ortho Clinic Diagnostic) для детекции core-антигена были представлены Bruzzone B.M. и соавторами (Италия). По мнению авторов, данная иммуноферментная система проще еще одного нового теста NAT (nucleic acid technology) и удобна для детекции раннего периода острого гепатита С. Tobler L.H. и соавторы (США) сообщили о своих результатах по применению NAT теста (Chiron/Gen-Probe's) при скрининге сывороток доноров крови. Данный тест позволяет одновременно определять РНК ВИЧ и HCV в серонегативное «окно».
Многие сообщения были посвящены количественному определению РНК HCV ввиду важности данного анализа при контроле эффективности специфической терапии и для выяснения роли вирусной нагрузки на течение гепатита С. Yeo A.T. и соавторы пытались установить зависимость между тяжестью поражения печени и уровнем РНК (тест Quantiplex, Chiron). Ими обнаружено, что: 1) большинство пациентов (98,4%) имеют нестабильный уровень РНК, меняющийся от измерения к измерению более, чем на 1 логарифм, 2) не существует связи между гистологическим повреждением печени и уровнем РНК, генотипом, полом, расой и
возрастом, но 3) есть зависимость между повышенной активностью сывороточной АлАТ и гистологическим повреждением печени. Анализ титров РНК у пациентов с острым гепатитом С позволил Williams IT. и соавторам (США) сделать выводы о том, что низкий не детектируемый уровень РНК в острый период не может быть предиктором элиминации вируса. Контролю эффективности лечения при моно- и комбинированной терапии было посвящено сообщение Pawlotsky J.M. и соавторов (Франция, США). Монотерапия рибавирином имела минимальный, но статистически значимый антивирусный эффект. Комбинированная терапия - интерферон и рибавирин - приводила к двухэтапному снижению вирусной нагрузки. Ежедневный прием интерферона как при моно-, так при комбинированной с рибавирином терапии приводил к двухэтапному снижению РНК. Предиктором успешного лечения авторы считают снижение уровня РНК в 1-2 дни лечения; повторное снижение в период со 2 по 14 дни предсказывало исчезновение РНК на 24 неделе лечения. Авторы не обнаружили статистической значимости при добавлении рибавирина к ежедневному приему интерферона.
Много неясного еще в естественном течении гепатита С. Инфицирование вирусом гепатита С может привести к 3 исходам: к реконвалесценции, к ХГС и к терминальному поражению печени (ТПП). Анализ 1667 пациентов с HCV-инфекцией в течение 1989-1998 гг., выполненный Thomas D. и соавторами (США), показал, что риск развития ТПП выше у пациентов, инфицированных после 38 лет, и тех, кто принимает более 100 г алкоголя в неделю. ТПП было обнаружено у 40 пациентов из 1667. У 210 пациентов без ТПП при биопсии был обнаружен цирроз печени. Анализу факторов, ассоциированных с прогрессированием цирроза, было посвящено сообщение Ghany M.G. и соавторов (США). Учитывались следующие факторы: пол, возраст, активность сывороточных АлАТ и АсАТ, содержание билирубина, альбумина, тромбоцитов, протромбиновое время и индекс гистологической активности. Обследовали 123 пациента без применения терапии в течение 1981-1999 гг. Установлено, что факторами, способствующими развитию цирроза, являются: возраст, перипортальный некроз и воспаление, повышенная активность сывороточной АлАТ и исходный фиброз. Скорость прогрессирования фиброза составляла около 0,015 фиброзных единиц в месяц. Естественное течение ХГС анализировали Peignoux-Martinot M. и соавторы (Франция) при наблюдении за 135 пациентами в течение 1992-1999 гг. Пациенты, у которых не детектировалась РНК, составили группу А (31%), с РНК - группу Б (69%).0бе группы имели сходные данные по возрасту, полу, способу инфицирования, уровню ГГТ, различались по уровню сывороточных АлАТ и АсАТ, анти-HCV, фиброзу и гистологическим изменениям. За время наблюдения уровень РНК не изменился в группе А, в групе Б титр РНК увеличился у 17% пациентов, причем при этом возросли и значения АлАТ. Пациенты с нормальными сывороточными активностями АлАТ редко имели гистологическое ухудшение в биоптатах.
Ряд докладов был посвящен проблеме гепатита С у детей. В США риск передачи HCV-инфекции новорожденным детям от матерей с антителами к данному вирусу составляет 3,8 % (данные Mast E. и соавторов). Основными факторами, способствующими инфицированию, являются использование приборов при мониторинге плода и длительный (более 6 час.) разрыв плодных оболочек. В Германии риск вертикальной передачи HCV-инфекции составляет 4,7% (данные Polywka S. и соавт.). При длительном наблюдении за инфицированными детьми авторы обнаружили, что ХГС у таких детей прогрессирует очень медленно, что позволяет не применять специфическую терапию (к такому же выводу приходят и Zuccotti G.V. с соавт., Италия). В Египте риск инфицирования новорожденных вирусом гепатита С составляет 28,6% (данные Abdel Ghaffar Y. и соавт.). Грудное вскармливание большинство авторов не рассматривает как фактор риска инфицирования малыша ввиду отсутствия РНК в молоке по данным ПЦР-анализа.
Факторы риска инфицирования взрослого населения США рассматривали Williams I.T. и соавт. (США). Проанализированы 364 случая острого гепатита С, обнаруженные в течение 1991-1998 гг. Около 44% пациентов заразились при внутивенном применении наркотиков, 17% при сексуальных контактах с HCV-инфицированными партнерами, 3% при переливаниях крови, 3% при бытовых контактах с инфицированными, у 9% не установлено каких-либо факторов риска, у 20% потенциальный риск был, но пациенты его отрицали. В ряде работ
отмечено более частое выявление антител к HCV среди пациентов венерологических клиник (в 2-4 раза выше, чем в целом по стране).
Огромное внимание на симпозиуме было уделено работам по анализу новых фармакологических веществ с антивирусной активностью, среди которых реально перспективными считаются рибозимы и гистамингидрохлорид (максамин). Сообщение по рибозимам было сделано Blatt L.M. и соавторами (США). Рибозимы расщепляют РНК HCV в консервативной 5'-концевой нетранслируемой области. Этот район формирует участок связывания с рибосомами и очень важен для биологии вируса. Начата 1 фаза клинических испытаний этого препарата. Максамин ингибирует продукцию и освобождение свободных радикалов из фагоцитирующих клеток печени, защищая тем самым NK- и Т-клетки. Возможно его использование при комбинированой с интерфероном терапии, где наблюдается эффект усиления действия последнего. Lurie E. и соавторы представили результаты по 2-й фазе клинических испытаний комплексной терапии у 129 пациентов. У 59% больных была высокая вирусная нагрузка, а у 50% генотип 1. Терапия включала интерферон (3 раза в неделю по 3 МЩ) и максамин в разной дозе - 3, 5, 6, 10 мг/неделю. Пациентов обследовали на 12-й и 24-й неделе лечения. На 12-й неделе биохимическое улучшение было обнаружено у 74%, вирусологическое (исчезновение РНК) - у 72% пациентов. Среди пациентов с генотипом 1 вирусологическое улучшение было выявлено у 53-83 % пациентов, среди пациентов с генотипом 2, 3 - у 70-86% пациентов, среди пациентов с высокой вирусной нагрузкой - у 4877%. К 24 неделе исчезновение РНК было обнаружено у 66% пациентов. При приеме максамина возможены неприятные побочные эффекты в виде сыпи, головной боли, гипотензии и тахикардии.
Л.И. Николаева, НИИ биомедиципской химии РАМН, Москва.
Календарь мероприятий
November 25-30, 2000, Brussels, Belgium
"8th United European Gastroenterology Week"
Contact: BS&ECCO, Rue de L'Abbaye 27a Abdijstraat,
B-1050 Brussels, Belgium
Phone: (+32.2) 647.87.80 Fax: (+32) 640.66.97
E-mail: [email protected]
December 1-2, 2000, Barcelona, Spain
"VI International Symposium on Viral Hepatitis"
Contact: Travessera de Gratia, 56, atico 2a, 08006 Barcelona, Spain
Phone: 00 34 93 414 46 25; Fax: 00 34 93 41447 11;
E-mail: [email protected]
December 3-7, 2000, Queensland, Australia
"7th International Meeting on Hepatitis and Related Viruses (Molecular
Virology and Pathogenesis)" Web: www.icms.com.au/hepcv
April 18-22, 2001, Prague, Czech Republic "EASL 36th Annual Meeting"
Contact: EuroAgentur Praha, K Horkam 56,102 00 Praha 10, Czech Republic
Phone: +420 2 71 751 045 / 619; Fax: +420 2 71 750 274 / 367; E-mail: [email protected]
