CC BY
26
О
тН
О
(N
УДК 579.22 ББК 20.18
О.Ф. Вятчина О.П. Горбачевская Д.И. Стом А.И. Беломестнова
ХАРАКТЕРИСТИКИ ШТАММОВ АЛКАНОТРОФНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ, ПЕРСПЕКТИВНЫХ ДЛЯ УДАЛЕНИЯ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕНИЙ*
Исследована субстратную специфичность штаммов бактерий, выделенных из гексадекана. Установлено, что изоляты обладают способностью к росту на широком круге органических соединений, в том числе на различных нефтепродуктах и жирах.
Ключевые слова: алканотрофные микроорганизмы, нефтепродукты, субстратная специфичность, резистентность.
O.F. Vyatchina O.P. Gorbachevskaya D.I. Stom A.I. Belomestnova
CHARACTERISTICS OF ALKANE-FEEDING STRAINS OF MICROORGANISMS PROSPECTIVE FOR FIGHTING OIL POLLUTION
ssi
2sl Д s =
Ин5|
Н£ї
«Зі
Ен^ І
ОЙ"
°i<s ^ 1
5s І
^ П £
S ¡ґ І
8s! "5 о
ЕнО а
£я§|
ИО | £И4
SfflE
К
н
н
о
н
PQ
со
Н
The authors study substrate specificity of bacterial strains isolated from hexadecane. It is established that isolats have ability to grow on wide range of organic compounds including oil-refinery products and lipids.
Keywords: alkane-feeding microorganisms, oil-refinery products, substrate specificity, resistance.
В настоящее время одной из актуальных проблем является ликвидация последствий загрязнения окружающей среды нефтью и нефтепродуктами. Наиболее перспективным и экологически безопасным способом элиминации подобных загрязнений является использование микроорганизмов — деструкторов углеводородов нефти [1]. Практический интерес представляют штаммы микроорганизмов, способные усваивать широкий спектр углеводородов и обладающие высокой токсикорезистентностью. В связи с этим целью данной работы явилось изучить некоторые свойства алканотрофных штаммов бактерий, выделенных из цетана.
В качестве объектов исследования использовали четыре бактериальных штамма, выделенных из хранившегося длительное время в лаборатории гексадекана: 1-05, 2-05, 1-04, 3-04. Для сравнения использовали культуру Pseudomonas aeruginosa, входящую в состав нефтеразрушающего микробиологического препарата «Деворойл» (препарат разработан в институте Микробиологии РАН и Научно-производственном предприятии «Биотехинвест») [3]. Препарат разработан в институте Микробиологии РАН и Научно-производственном предприятии «Биотехинвест».
* Работа выполнена при поддержке грантов Роснауки ФЦП (ГК 02.740.11.0018 от 15.06.2009 г. и ГК 02.740.11.0335 от 07.07.2009 г.).
© О.Ф. Вятчина, О.П. Горбачевская, Д.И. Стом, А.И. Беломестнова, 2010
©
тН
О
(N
SS1
2нё Яч >
MhSI
HSS
H3i
ЬА
ОЙ"
^ 1
5s s
«Л* ё§! h Е
« Р I
8s! Й§ о
ЕнО а
£м§|
МО I £И4
нее
К
н
н
о
н
PQ
со
Н
Для выделения культур из цетана использовали метод глубинного посева в агаризованную синтетическую среду № 1 следующего состава (%): KNO3 — 0,40; MgSO4 — 0,08; KH2PO4 — 0,06; Na2HPO4 — 0,14; гексадекан — 1; агар-агар — 2; pH среды 7,2. Для определения способности микроорганизмов использовать в качестве источника углерода углеводы и спирты готовили основной фон среды следующего состава (г/л): пептон — 5,0; К2НРО4 — 1,0; рН 6,8. Углеводы или спирты вносили в количестве 1%. Для обнаружения изменения рН в среду добавляли индикатор бромкрезолпурпур — из расчета 2 мл 1,6%-го спиртового раствора на 1 л среды [2].
Исследование возможности роста культур на средах с индивидуальными углеводородами, формалином, карболовой кислотой, нефтепродуктами и жирами проводили при помощи метода «лунок».
В качестве фоновой среды использовали синтетическую среду следующего состава (%): KNO3 — 0,40; MgSO4 — 0,08; KH2PO4 — 0,06; Na2HPO4 — 0,14; агар-агар — 2,0; рН 7,2 [2].Особенности роста каждого штамма изучали по шкале, разработанной Д.В. Хомяковой [4]. Также оценивали способность изолятов к росту в жидкой синтетической среде с нефтепродуктами. В колбы со 100 мл среды после стерилизации добавляли 1% соответствующего нефтепродукта. Для посева использовали суспензии односуточной культуры (1 мл на 100 мл среды). Инкубирование проводили на круговой качалке (180 об/мин.) при температуре 25 оС в течение 24 часов. Количественный контроль роста бактерий осуществляли при помощи метода серийных разведений с последующим высевом на чашки Петри с плотной синтетической средой с 1 % гексадекана.
Определение чувствительности к антибиотикам проводили с использованием диско-диффузионного метода [2]. Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета программ Excel 2000 и общепринятых методов. Рассчитывали средние арифметические величины (М) и доверительные интервалы. Выводы сделаны при вероятности безошибочного прогноза Р > 0,95.
Выделенные из гексадекана штаммы росли как на синтетической среде с гексадеканом, так и на белковых средах (рыбо-пептонный агар, мясо-пептонный бульон).
Культуры 1-05, 2-05, 1-04 могли развиваться за счет арабинозы, рам-нозы, инозита, но не использовали сахарозу и сорбит. На глюкозе росли штаммы 1-05 и 2-05, лактозе 2-05, мальтозе — 2-05, дульците — 2-05. Эти три изолята обладали способностью к росту и на средах со следующими индивидуальными углеводородами: гексаном, октаном, изооктаном, деканом, декалином, ундеканом, додеканом, гексадеканом, ксилолом, изопропилбензолом, бензолом и нитробензолом. Штамм 3-04 не развивался ни на одном из используемых субстратов.
Выделенные из цетана штаммы представлены подвижными, неспорообразующими, грамотрицательными палочками, одиночными или попарно соединенными.
Все штаммы, изолированные из цетана, не использовали сахарозу и сорбит. Арабинозу, рамнозу, инозит использовали культуры 1-05, 2-05, 1-04, лактозу — 2-05, мальтозу — 1-05, дульцит — 2-05. Глюкозу аэробно окисляли два штамма 1-05 и 2-05. Исследуемые микроорганизмы оказались каталаза- и оксидаза-положительными. Все штаммы не обладали протеолитической активностью (не продуцировали коллагеназу и казе-
%
Ю иназу), не гидролизовали крахмал и не продуцировали лецитиназу. При
росте в МПБ культуры не образовывали сероводород и аммиак. У трех штаммов (1-05; 2-05; 1-04) обнаружена способность к росту на безазо-© тистой среде Эшби, что может свидетельствовать о том, что культуры
способны фиксировать молекулярный азот или являются олигонитро-5^ филами. Также эти три культуры хорошо развивались на синтетической
среде, т.е. были способны усваивать азот минеральных солей. Нитраты восстанавливали штаммы 2-05, 1-04 и 3-04.
Штаммы не развивались при температуре +42 оС, при температуре +5 оС способность к росту была обнаружена только у штамма 3-04. Все изоляты хорошо росли в МПБ с 2,5% ^С1. Наиболее солетолерантным оказался штамм 3-04, у которого зафиксирован рост в присутствии 6,5% ^С1. При более высоких концентрациях ^С1 (15; 20%) у всех культур рост отсутствовал.
Культуры, выделенные из гексадекана, проявили различную чувствительность к антибиотикам. Из антибиотиков группы пенициллинов наибольший эффект по отношению к исследуемым штаммам показал пиперациллин. Культура 3-04 характеризовалась высокой степенью чувствительности к оксациллину Исследуемые штаммы проявили чувствительность к карбапенемам: имипенему и меропенему, при этом культура 3-04 оказалась высоко чувствительной. Цефалоспорины оказали различное воздействие на рост исследуемых микроорганизмов. Штаммы 1-04 и 1-05 проявили резистентность к цефалотину, цефазо-лину, при этом культура 1-05 также оказалась устойчивой к цефипиму, цефамандолу и цефуроксиму. Наиболее чувствительным к цефалоспо-ринам оказался штамм 3-04. Зоны подавления роста культуры от 28,5 до 30 мм были зарегистрированы в опытах с такими антибиотиками, как цефалотин, цефалексин, цефтриаксон, цефуроксим, цефазолин и цефаклором. К ванкомицину из четырех исследуемых изолятов слабую чувствительность проявил штамм 1-04. Полимиксин оказал бак; терицидное действие на штаммы 1-04, 1-05, 2-05, в то время как 3-04
проявил резистентность к этому антибиотику. При действии аминог-ой § ликозидов (гентамицина, канамицина, тобрамицина) на тест-культуры
^1 отмечались бактерицидный и бактериостатический эффект. Наиболее
р?® | чувствительным к аминогликозидам оказался штамм 3-04.
1 Для характеристики штаммов, выделяемых из природных источен ^ | ников, важным является изучение их субстратной специфичности.
§к§ В связи с этим было исследована способность бактериальных штам-
Во I мов, выделенных из гексадекана, использовать в качестве источников
К
иоэ углерода индивидуальные углеводороды. Культуры 1-05, 2-05, 1-04
к®3 активно использовали гексан, октан, изоактан, декан, ундекан, доде-
кан. На среде с углеродом четыреххлористым отмечался скудный рост у штаммов 1-05, 2-05, 1-04.
23 Что касается ароматических углеводородов, наиболее токсичными
для штаммов являлись бензол, нитробензол и толуол. На средах с этими углеводородами изоляты из гексадекана давали слабый или скудный рост. Штамм 1-05 не развивался на средах с бензолом и толуолом. 1^ Культуры хорошо развивались на среде с изопропилбензолом и ксило-
лом. Однако на среде с изопропилбензолом рост наблюдался только до середины штриха, что свидетельствует о токсичности углеводорода,
Н степень которой уменьшалась по мере снижения концентрации, делая
возможным развитие штаммов.
н
о
О
тН
О
(N
SS1
2нё Яч >
MhSI
HS5
H3i
ЬА
ОЙ"
^ 1
5s s
«Л* ё§! h Е
« Р I
8s!
"Jo
ЕнО а
£м§|
МО I £И4
нее
К
н
н
о
н
PQ
со
Н
Проведенные исследования показали, что углеводородокисляющая активность трех изолятов из гексадекана в целом сходна с таковой эталонного штамма P. aeruginosü, входящего в состав «Деворойла».
Штаммы 1-05, 2-05, 1-04 хорошо развивались на средах с такими спиртами, как этанол, октанол, глицерин.
На среде с бутанолом отмечался умеренный или хороший рост изолятов. Более слабо культуры использовали пентанол. На среде с изопропиловым спиртом у исследуемых бактерий отмечался скудный рост, в отличие от производственного штамма P. aeruginosа. Штамм 3-04 из всех взятых для эксперимента спиртов использовал только октанол. Ионол не использовала ни одна культура, в том числе P. aeruginosа.
Изоляты из гексадекана, в отличие от штамма P. aeruginosа, входящего в состав препарата «Деворойл», окисляли формалин, при этом наибольшую активность проявила культура 2-05 .
Также у исследуемых штаммов обнаружена способность развиваться на среде, содержащей карболовую кислоту в качестве единственного источника углерода. Более активно культуры росли на среде с 10%-й карболовой кислотой. Культуры 1-04, 1-05 и 2-05 хорошо развивались на таких субстратах, как маргарин, сливочное масло, растительное масло, внутренний говяжий жир, пчелиный воск. Штамм 3-04 проявил меньшую активность по отношению к этим источникам углерода.
Таким образом, исследования показали, что три культуры, выделенные из гексадекана, отличались способностью использовать широкий круг органических соединений. Важной характеристикой штаммов является их активность по отношению к различным углеводородам, а также жирам, и возможности их использовать в качестве единственного источника углерода. Все это позволяет говорить о перспективности использования выделенных культур микроорганизмов для устранения нефтезагрязнений1.
Список использованной литературы
1. Жуков Д.В. Механизмы деградации углеводородов нефти микроорганизмами / Д.В. Жуков, В.П. Мурыгина, С.В. Калюжный //Успехи современной биологии. — 2006. — Т. 126, № 3. С. 285-296.
2. Нетрусов А.И. Практикум по микробиологии / А.И. Нетрусов, М.А. Егорова, Л.М. Захарчук; под ред. А.И. Нетрусова. — М.: Академия, 2005. — 604 с.
3. Сидоров Д.Г. Полевой эксперимент по очистке почв от нефтяного загрязнения с использованием углеводородокисляющих микроорганизмов / Д.Г. Сидоров, И.А. Борзенков, Р.Р. Ибатулин и др. // Прикладная биохимия и микробиология. — 1997. — Т. 33, № 5. — С. 497-502.
4. Хомякова Д.В. Состав углеводородокисляющих микроорганизмов нефте-загрязненных почв Усинского района Республики Коми: автореф. дис. ... канд. биол. наук / Д.В. Хомякова. — М., 2003.
Bibliography (transliterated)
1. Zhukov D.V. Mekhanizmy degradatsii uglevodorodov nefti mikroorganiz-mami / D.V. Zhukov, V.P. Murygina, S.V. Kalyuzhnyi //Uspekhi sovremennoi biologii. — 2006. — T. 126, № 3. S. 285-296.
2. Netrusov A.I. Praktikum po mikrobiologii / A.I. Netrusov, M.A. Egorova, L.M. Zakharchuk; pod red. A.I. Netrusova. — M.: Akademiya, 2005. — 604 s.
1 Авторы признательны И.А. Борзенкову за предоставление культуры Pseudomonus aeruginosa.
О
тН
О
(N
3. Sidorov D.G. Polevoi eksperiment po ochistke pochv ot neftyanogo zagryazneniya s ispol’zovaniem uglevodorodokislyayushchikh mikroorganiz-mov / D.G. Sidorov, I.A. Borzenkov, R.R. Ibatulin i dr. // Prikladnaya biokhi-miya i mikrobiologiya. — 1997. — T. 33, № 5. — S. 497-502.
4. Khomyakova D.V. Sostav uglevodorodokislyayushchikh mikroorganizmov neftezagryaznennykh pochv Usinskogo raiona Respubliki Komi: avtoref. dis. ... kand. biol. nauk / D.V. Khomyakova. — M., 2003.
Информация об авторах
Вятчина Ольга Федоровна — кандидат биологических наук, доцент Иркутского государственного университета, г. Иркутск.
Горбачевская Ольга Петровна — аспирант Восточно-Сибирской государственной академии образования, г. Иркутск.
Стом Дэвард Иосифович — доктор биологических наук, профессор Иркутского государственного университета, г. Иркутск, e-mail: [email protected].
Беломестнова Анна Игоревна — студент Иркутского государственного университета, г. Иркутск.
Authors
Vyatchina Olga Fyodorovna — PhD in Biological Sciences, Associate Professor, Irkutsk State University, Irkutsk.
Gorbachevskaya Olga Petrovna — post-graduate student, East Siberian State Academy of Education, Irkutsk.
Stom Daevard Iosifovich — Doctor of Biological Sciences, Professor, Irkutsk State University, Irkutsk, e-mail: [email protected].
Belomestnova Anna Igorevna — student, Irkutsk State University, Irkutsk.
SS?
2s!
«5!
ОЙ"
°i<s ^ I
Ps і
Ла іE
i
« ¡ґ І 8s! Е-Ю* ^0|
H
H О H P3
co
H
