CC BY
3
Научная статья/Research Article УДК 579.62
DOI: 10.36718/1819-4036-2023-3-140-146
Ольга Львовна Карташова1, Ольга Александровна Пашинина2 , Мария Викторовна Сычева3, Елена Евгеньевна Кочкина4, Татьяна Михайловна Пашкова5, Вероника Викторовна Дымова6
^.^Оренбургский государственный аграрный университет, Оренбург, Россия
1235Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, Оренбург, Россия
1labpersist@mail.ru
2olga25mikro@mail.ru
3sycheva_maria@mail.ru
4eekochkina@gmail.com
5pashkova070782@mail.ru
6nika.kuranova@yandex.ru
ХАРАКТЕРИСТИКА ПАТОГЕННОГО ПОТЕНЦИАЛА E. COLI, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ КОШЕК С ЗАБОЛЕВАНИЯМИ МОЧЕВЫДЕЛИТЕЛЬНОЙ СИСТЕМЫ
Цель исследования - фенотипическая и генетическая оценка патогенного потенциала штаммов E. coli, изолированных от кошек с заболеваниями мочевыделительной системы. Исследуемый материал - 12 штаммов E. coli, выделенных из мочи кошек с заболеваниями мочевыделительной системы общепринятыми методами и идентифицированных методом масс-спектрометрии. Патогенные и персистентные свойства бактерий определяли фотометрическим методом. Резистентность к фторхинолонам устанавливали диско-диффузионным методом. Гены, детерминирующие синтез адгезинов, факторы колонизации и персистенции, а также резистентности к антибиотикам обнаруживали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием подобранных праймеров. E. coli характеризовались выраженным патогенным потенциалом. Определены особенности биопрофилей культур по экспрессии изученных биологических свойств: гемолитическая активность у бактерий, выделенных в ассоциациях, была достоверно выше, чем у штаммов, изолированных в монокультуре и, напротив, у монокультур были достоверно выше значения способности E. coli к биопленкообразованию и адгезии. К препаратам из группы фторхинолонов E. coli проявляли чувствительность, умеренную резистентность и резистентность. С помощью ПЦР установлено наличие у всех изолятов генетических детерминант вирулентности (papA, fimH, fyuA, kspMTII, hlyA) и резистентности (gyrA, parC, gnrB, gnrS), а также у подавляющего большинства - генов usp и grnA. Полученные данные о патогенном биопрофиле E. coli, выделенных при патологии мочевыделительной системы у кошек, могут использоваться в качестве критерия для поиска и идентификации возбудителя. Установленная резистентность к фторхинолонам у изолятов E. coli свидетельствует о необходимости контроля за их применением. Для успешной терапии крайне необходимо проведение регионального мониторинга резистентности бактерий к антибактериальным препаратам.
Ключевые слова: E. coli, заболевания мочевыделительной системы, кошки, биопрофиль возбудителей, гены, детерминирующие факторы вирулентности и резистентности к фторхино-лонам
Для цитирования: Характеристика патогенного потенциала E. coli, выделенных от кошек с заболеваниями мочевыделительной системы / О.Л. Карташова [и др.] // Вестник КрасГАУ. 2023. № 3. С. 140-146. DOI: 10.36718/1819-4036-2023-3-140-146.
Благодарности: работа выполнена в рамках государственного задания Минсельхоза России на проведение прикладных научных исследований (номер государственного учета НИР АААА-А19-119101890005-1).
© Карташова О.Л., Пашинина О.А., Сычева М.В., Кочкина Е.Е., Пашкова Т.М., Дымова В.В., 2023 Вестник КрасГАУ. 2023. № 3. С. 140-146. Bulliten KrasSAU. 2023;(3):140-146.
Olga Lvovna Kartashova1, Olga Alexandrovna Pashinina2 , Maria Viktorovna Sycheva3, Elena Evgenievna Kochkina4, Tatyana Mikhailovna Pashkova5, Veronika Viktorovna Dymova6
13,4,56Orenburg State Agrarian University, Orenburg, Russia
1 235Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, Ural Branch of the Russian Academy of Sciences,
Orenburg, Russia
1labpersist@mail.ru
2olga25mikro@mail.ru
3sycheva_maria@mail.ru
4eekochkina@gmail.com
5pashkova070782@mail.ru
6nika.kuranova@yandex.ru
CHARACTERISTICS OF THE PATHOGENIC POTENTIAL OF E. COLI ISOLATED FROM CATS WITH URINARY SYSTEM DISEASES
The purpose of the study is to evaluate the phenotypic and genetic potential of E. coli strains isolated from cats with diseases of the urinary system. The test material was 12 strains of E. coli isolated from the urine of cats with diseases of the urinary system by conventional methods and identified by mass spectrometry. The pathogenic and persistent properties of bacteria were determined by the photometric method. Resistance to fluoroquinolones was determined by the disk diffusion method. Genes that determine the synthesis of adhesins, colonization and persistence factors, and antibiotic resistance were detected using polymerase chain reaction (PCR) using selected primers. E. coli were characterized by a pronounced pathogenic potential. The features of culture bioprofiles were determined by the expression of the studied biological properties: the hemolytic activity in bacteria isolated in associations was significantly higher than in strains isolated in a monoculture and, on the contrary, in monocultures, the values of the ability of E. coli to biofilm formation and adhesion were significantly higher. E. coli showed sensitivity, moderate resistance and resistance to drugs from the group of fluoroquinolones. PCR revealed the presence of genetic determinants of virulence (papA, fimH, fyuA, kspMTII, hlyA) and resistance (gyrA, parC, gnrB, gnrS) in all isolates, as well as the usp and grnA genes in the vast majority. The obtained data on the pathogenic bioprofile of E. coli isolated in the pathology of the urinary system in cats can be used as a criterion for the search and identification of the pathogen. The established resistance to fluoroquinolones in E. coli isolates indicates the need to control their use. Regional monitoring of bacterial resistance to antibacterial drugs is essential for successful therapy.
Keywords: E. coli, diseases of the urinary system, cats, bioprofile of pathogens, genes, determining factors of virulence and resistance to fluoroquinolones
For citation: Characteristics of the pathogenic potential of E. coli isolated from cats with urinary system diseases / O.L. Kartashova [et al.] // Bulliten KrasSAU. 2023;(3): 140-146. (In Russ.). DOI: 10.36718/ 1819-4036-2023-3-140-146.
Acknowledgments: the work has been carried out within the framework of the state assignment of the Ministry of Agriculture of Russia for applied scientific research (state registration number NIR AAAA-A19-119101890005-1).
Введение. Патологии почек и мочевыводя-щих путей играют одну из ведущих ролей в нозологии незаразных заболеваний мелких домашних животных и представляют важную проблему для ветеринарной медицины. В видовом спектре микроорганизмов, выделенных из мочи кошек при циститах и мочекаменной болезни, наряду с бактериями рода Staphylococcus выявлено доминирование E. coli [1]. Известно, что
кишечная палочка может способствовать развитию инфекционно-воспалительных осложнений, а также рецидиву заболевания, это обусловлено спектром биологических свойств микроорганизмов, инициирующих воспалительный процесс [2]. Однако информации, касающейся биопрофиля E.coíi, выделенных от кошек с заболеваниями мочевыводящей системы, не достаточно.
Цель исследования - фенотипическая и генетическая оценка патогенного потенциала штаммов E. coli, изолированных от кошек с заболеваниями мочевыделительной системы.
Условия, материалы и методы. В работе были изучены 12 штаммов E. coli, выделенных из мочи 54 кошек с патологией мочевыделительной системы (мочекаменная болезнь и цистит) и находящихся на лечении в ветеринарных клиниках г. Оренбурга. Пробы мочи получали от больных животных методом катетеризации и доставляли на исследование в течение 1-2 ч. Выделение бактерий проводили стандартными методами. Видовую идентификацию осуществляли с помощью масс-спектрометра MALDI TOF MS серии Microflex LT (BrukerDaltonics, Германия) и программного обеспечения MaldiBioTyper 3,0. Антилизоцимную активность (АЛА), био-
пленкообразование (БПО), гемолитическую активность (ГА) и показатель адгезии микробных клеток (ПА) определяли стандартными фотометрическими методами. Резистентность к фторхинолонам (энрофлоксацину, ципрофлок-сацину, норфлоксацину, офлоксацину, лево-флоксацину) определяли диско-диффузионным методом [3]. Бактериальную дезоксирибонук-леиновую кислоту экстрагировали с помощью реактивов «ДНК-экспресс» («Литех», Россия). Циклический синтез фрагментов ДНК осуществляли с использованием амплификатора «Терцик МС-2» («ДНК-технология», Россия). Для определения наличия генов вирулентности и резистентности использовали специфические олиго-нуклеотидные праймеры, описанные в научных публикациях [4-6] и синтезированные фирмой «Синтол» (Россия) (табл.).
Праймеры, использованные при мультиплексной ПЦР, и размеры ампликонов
Ген Функция Праймеры Нуклеотидная последовательность Размер, п.н.
1 2 3 4 5
Ад гезины
1 P-пили, ассоциированные с пиелонефритом pap A For ATGGCAGGTGGTGTTTTGGTG 720
pap A Rev CGTCCCACCATACGTGCTCTTC
2 Фимбрии 1-го типа, покрытые белком адгезином fimH F TCGAGAACGGATAAGCCGTGG 508
fimH R GCAGTCACCTGCCCTCCGGTA
3 Афимбриальный фактор адгезии afa For GCTGGGCAGCAAACTGATAACTCTC 750
afa Rev CATCAAGCTGTTTGTTCGTCCGCCG
Система захвата и транспорта железа
4 Ген, отвечающий за синтез сидерофора йерсинеабактина fyuAFor TGATTAACCCCGCGACGGGAA 880
fyuARev CGCAGTAGGCACGATGTTGTA
Белки синтеза полисахаридов капсулы
5 Белок II группы, синтезирующий полисахарид капсулы kpsMTII For GCGCATTTGCTGATACTGTTG 270
kpsMTII Rev CATCCAGACGATAAGCATGAGCA
Нуклеазы
6 Уропатогенный специфический белок usp For ACATTCACGGCAAGCCTCAG 440
usp Rev AGCGAGTTCCTGGTGAAAGC
Токсин
7 Гемолизин hlyA F AACAAGGATAAGCACTGTTCTGGCT 1 177
hlyA R ACCATATAAGCGGTCATTCCCGTCA
Гены резистентности к фторхинолонам (энрофлоксацин, офлоксацин, левофлоксацин)
8 Ген, кодирующий ДНК-гиразу gyrA-P1 gyrA-P3 TGT CCG AGA TGG CCT GAA GC TGC CGT CAT AGT TAT CAA CGA 374
9 Ген, кодирующий топоизомеразуIV parC-3 parC-4 CCG TGC GTT GCC GTT TAT TG AAGTGCCGTCGAAGTTTGGCA 368
Окончание табл.
1 2 3 4 5
10 Плазмид-опосредованные гены устойчивости кхинолонам qnrA-1 qnrA-2 ATTTCTCACGCCAGGATTTG GATCGGCAAAGGTTAGGTCA 516
11 qnrB-1 qnrB-2 GATCGTGAAAGCCAGAAAGG ACGATGCCTGGTAGTTGTCC 469
12 qnrS-1 qnrS-2 ACGACATTCGTCAACTGCAA TAAATTGGCACCCTGTAGGC 417
Статистический анализ результатов осуществлен с применением программ MS Excel 2007.
Результаты и обсуждение. При бактериологическом исследовании мочи E. coli были выделены в 22,2 % случаев, в 33,3 % микроорганизмы были в виде монокультуры, в 66,7 % - в ассоциациях с другими микроорганизмами (S. aureus, S. intermedius, E. faecalis, K. pneumonia). У выделенных E. coli определен комплекс биологических свойств (биопрофиль), включающий их вирулентные и персистентные характеристики, а также антибиотикорезистентность. Частота обнаружения ГА, БПО и АЛА составляла 100 %, способностью к адгезии характеризовались 66,7 % E. coli. Среднее значение ГА у исследованных штаммов E. coli было равно 6,8 ± 0,85 %, выраженность АЛА составила 1,1 ± 0,05 мкг/мл, а способность образовывать биопленки - 1,43 ± 0,42 у. е.
Далее была определена чувствительность E. coli к фторхинолонам, которые являются оптимальными препаратами для эмпирической терапии неосложненных инфекций как верхних, так и нижних мочевых путей. Выявлено, что по отношению к ципрофлоксацину половина изу-
ченных штаммов проявляла чувствительность, а вторая половина - умеренную резистентность; к энрофлоксацину чувствительных штаммов не было, при этом 16,7 % культур характеризовались резистентностью и 83,3 % - умеренной резистентностью. К норфлоксацину все исследованные E. coli проявляли чувствительность, к офлоксацину и левофлоксацину по 16,7 % культур были умеренно резистентными, остальные чувствительными.
Сравнительный анализ распространенности изученных свойств у E. coli, выделенных в монокультуре и ассоциациях, выявил их отличие по способности к биопленкообразованию (50 % штаммов, выделенных в ассоциациях и 100 % изолятов в монокультуре) и адгезии (75 и 50 % соответственно). Установлено, что ГА изолятов E. coli в ассоциациях составила 7,7 ± 0,09 %, тогда как у монокультур - 5,1 ± 0,36 % (p < 0,01), и, напротив, значения БПО и ПА были выше у монокультур (1,7 ± 0,07 и 1,1 ± 0,13 у. е., р < 0,05; 17,0 ± 0,03 и 11,9 ± 0,89 %, р < 0,05). По уровню АЛА выделенные штаммы не отличались (рис.).
Уе.
20 16 12 8 4 0
ассоциация монокультура
□ БП ■ ПА □ ГА ■ АЛА
Биопрофили E. coli, выделенных в монокультуре и ассоциациях при цистите и МКБ: БП - биопленкообразование, у. е.; АЛА - антилизоцимная активность, мкг/(млОП); ГА - гемолитическая активность, %; ПА - показатель адгезии, %; (*) - р < 0,05; (**) - р < 0,01
*
Затем был охарактеризован вирулентный потенциал штаммов E. coli на уровне генотипа. Установлено, что у всех выделенных культур регистрировались следующие гены, ответственные за адгезию: fim H и pap A и отсутствовали гены afa B и afa C. Это связано с тем, что у грамотрицательных микроорганизмов функцию распознавания и прикрепления осуществляют пили, или фимбрии, а у грамположительных бактерий в адгезии участвуют афимбриальные структуры. Встречаемость данного фактора среди уропатогенных штаммов достаточно сильно варьирует, так, в исследованиях [7] у 45 изолятов эшерихий, выделенных от собак и кошек с инфекциями мочевыводящих путей, не обнаружен ген afa, что согласуется с полученными нами данными. Установлено наличие у всех изолированных нами E. coli гена kps M, детерминирующего синтез капсульного полисахарида, защищающего от иммунной системы хозяина, а также гена hly A, относящегося к поро-образующим токсинам, лизирующим эритроциты и ядросодержащие клетки. Ген usp, кодирующий уропатогенный специфичный протеин, выявлен нами у 83,3 % E. coli. Известно, что выработка сидерофоров, определяющих способность бактериальных клеток к захвату железа, повышает жизнеспособность микроорганизмов внутри уретрального тракта и активируется во время инфекции. Показано, что экспрессия сидерофоров повышена в уропатогенах по сравнению с комменсальными штаммами E. coli [8], что демонстрируют проведенные нами исследования, установившие присутствие гена fyu A у всех выделенных изолятов. У всех изученных штаммов также выявлены гены gyr A и par С, ответственные за формирование устойчивости к фторхинолонам, гены qnr B и qnr S, кодирующие белки, уменьшающие связывание хино-лона с ДНК и последующее образование комплекса хинолон-гираза; при этом только 66,7 % культур характеризовались наличием гена qrn A.
Проведенный анализ биопрофиля E. coli, выделенных от кошек с заболеваниями моче-выделительной системы, показал, что данные микроорганизмы, как в монокультуре, так и ассоциациях, характеризуются выраженным патогенным потенциалом, который определяется наличием у них комплекса вирулентных и пер-
систентных свойств, включая ГА, АЛА, БПО, адгезию, антибиотикорезистентность. Таким образом, вирулентный биопрофиль E. coli можно применять как критерий скрининга у больных животных возможных возбудителей заболеваний для последующей селективной элиминации. С другой стороны, настораживает факт значительного распространения генов резистентности к антибиотикам из группы фторхинолонов, которые являются препаратами выбора. Полученные результаты свидетельствуют о том, что фторхинолоны должны использоваться для терапии заболеваний мочевыделительной системы только после определения чувствительности E. coli к антибиотикам данной группы.
Заключение
1. Штаммы, выделенные из мочи кошек с заболеваниями мочевыделительной системы, характеризуются определенным биопрофилем и выраженным патогенным потенциалом.
2. Молекулярно-генетическим методом у уроизолятов с высокой частотой определено наличие генов, кодирующих адгезины, факторы колонизации и персистенции, а также резистентность к фторхинолонам.
Список источников
1. Видовой состав и резистентность к антибиотикам микроорганизмов, выделенных при патологии мочевыделительной системы у плотоядных / Н.В. Морозова [и др.] // Вестник Бурятской государственной сельскохозяйственной академии им. В.Р. Филиппова. 2020. № 1 (58). С. 66-72.
2. Характеристика патогенного потенциала Escherichia coli, выделенных у пациентов с калькулезным пиелонефритом / Т.М. Пашкова [и др.] // Урология. 2021. № 4. С. 19-24.
3. МУК 4.2.1890-04. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. М.: Минздрав России, 2005. 62 c.
4. Johnson J.R., Stella A.L. Extended virulence genotypes of Escherichia coli strains from patients with urosepsis in relation to phylogeny
and host compromise // J. Infect. Dis. 2000. Vol. 181. P. 261-272.
5. Detection of urovirulence factors in Escherichia coli by multiplex polymerase chain reaction / S. Yamamoto [et al.] // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1995. Vol.12. P. 85-90.
6. The genetic background of antibiotic resistance among clinical uropathogenic Escherichia coli strains / W. Adamus-Biafek [et al.] // Mol. Biol. Rep. 2018. Vol. 45 (5). P. 1055-1065.
7. Babacan O., Izgür M. Detection of virulence factors of Escherichia coli strains isolated from urogenital system infections in dogs and cats // Vet. Hekim. Der. Derg. 2021. Vol. 92(2). P. 132-142.
8. Urinary tract infections: epidemiology, mechanisms of infection and treatment options / A.L. Flores-Mireles [et al.] // J. Nat. Rev. Microbiol. 2015. Vol. 13(5). P. 269-284.
References
1. Vidovoj sostav i rezistentnost' k antibiotikam mikroorganizmov, vydelennyh pri patologii mo-chevydelitel'noj sistemy u plotoyadnyh / N.V. Mo-rozova [i dr.] // Vestnik Buryatskoj gosudar-stvennoj sel'skohozyajstvennoj akademii im. V.R. Filippova. 2020. № 1 (58). S. 66-72.
Harakteristika patogennogo potenciala Escherichia coli, vydelennyh u pacientov s kal'kulez-nym pielonefritom / T.M. Pashkova [i dr.] // Urologiya. 2021. № 4. S. 19-24. MUK 4.2.1890-04. Opredelenie chuvstvitel'-nosti mikroorganizmov k antibakterial'nym preparatam. M.: Minzdrav Rossii, 2005. 62 c. Johnson J.R., Stella A.L. Extended virulence genotypes of Escherichia coli strains from patients with urosepsis in relation to phylogeny and host compromise // J. Infect. Dis. 2000. Vol. 181. P. 261-272.
Detection of urovirulence factors in Escherichia coli by multiplex polymerase chain reaction / S. Yamamoto [et al.] // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1995. Vol.12. P. 85-90. The genetic background of antibiotic resistance among clinical uropathogenic Escherichia coli strains / W. Adamus-Biafek [et al.] // Mol. Biol. Rep. 2018. Vol. 45 (5). P. 1055-1065. Babacan O., Izgür M. Detection of virulence factors of Escherichia coli strains isolated from urogenital system infections in dogs and cats // Vet. Hekim. Der. Derg. 2021. Vol. 92(2). P. 132-142.
Urinary tract infections: epidemiology, mechanisms of infection and treatment options / A.L. Flores-Mireles [et al.] // J. Nat. Rev. Microbiol. 2015. Vol. 13(5). P. 269-284.
Статья принята к публикации 13.03.2023 / The article accepted for publication 13.03.2023. Информация об авторах:
Ольга Львовна Карташова1, профессор кафедры микробиологии и заразных болезней; ведущий научный сотрудник лаборатории персистенции и симбиоза микроорганизмов; доктор биологических наук, доцент
Ольга Александровна Пашинина2, старший научный сотрудник лаборатории персистенции и симбиоза микроорганизмов, кандидат биологических наук
Мария Викторовна Сычева3, заведующая кафедрой микробиологии и заразных болезней, профессор; старший научный сотрудник лаборатории персистенции и симбиоза микроорганизмов; доктор биологических наук, доцент
Елена Евгеньевна Кочкина4, старший преподаватель кафедры микробиологии и заразных болезней, кандидат биологических наук
Татьяна Михайловна Пашкова5, профессор кафедры микробиологии и заразных болезней; ведущий научный сотрудник лаборатории персистенции и симбиоза микроорганизмов; доктор биологических наук
Вероника Викторовна Дымова6, доцент кафедры микробиологии и заразных болезней, кандидат биологических наук
Information about the authors:
Olga Lvovna Kartashova1, Professor at the Department of Microbiology and Infectious Diseases; Leading Researcher, Laboratory of Persistence and Symbiosis of Microorganisms; Doctor of Biological Sciences, Associate Professor
Olga Alexandrovna Pashinina2, Senior Researcher, Laboratory of Persistence and Symbiosis of Microorganisms, Candidate of Biological Sciences
Maria Viktorovna Sycheva3, Head of the Department of Microbiology and Infectious Diseases, Professor; Senior Researcher, Laboratory of Persistence and Symbiosis of Microorganisms; Doctor of Biological Sciences, Associate Professor
Elena Evgenievna Kochkina4, Senior Lecturer, Department of Microbiology and Infectious Diseases, Candidate of Biological Sciences
Tatyana Mikhailovna Pashkova5, Professor at the Department of Microbiology and Infectious Diseases; Leading Researcher, Laboratory of Persistence and Symbiosis of Microorganisms; Doctor of Biological Sciences
Veronika Viktorovna Dymova6, Associate Professor at the Department of Microbiology and Infectious Diseases, Candidate of Biological Sciences
