CC BY
4
12. Al-Moraissi E.A., Ellis E. Biodegradable and Titanium Osteosynthesis Provide Similar Stability for Orthognathic Surgery. J. Oral Maxillofac. Surg. 2015; 73: 1795-1808.
13. X-ray morphological aspects of the fusion of the radial bone of animals using spokes with biocomposition coating / D.A. Artemyev, S.V. Kozlov, V.S. Klokov, D.A. Bu-gayenko. Izvestia Orenburg State Agrarian University. 2022; 97(5): 190-196.
Дмитрий Алексеевич Артемьев, кандидат ветеринарных наук, доцент, ahdnvj@mail.ru, https://orcid.org/0000-0003-3968-9979
Сергей Васильевич Козлов, доктор ветеринарных наук, профессор, kozlovsv12@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0003-2164-8140
Владимир Сергеевич Клоков, аспирант, vladimirklokov2017@gmail.com, https://orcid.org/0000-0003-3907-0201
Дмитрий Алексеевич Бугаенко, ветеринарный врач, bugaenko900@bk.ru, https://orcid.org/0000-0002-2328-913X
Dmitry A. Artemyev, Candidate of Veterinary Sciences, Associate Professor, ahdnvj@mail.ru, https://orcid.org/0000-0003-3968-9979
Sergey V. Kozlov, Doctor of Veterinary Sciences, Professor, kozlovsv12@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0003-2164-8140
Vladimir S. Klokov, postgraduate, vladimirklokov2017@gmail.com, https://orcid.org/0000-0003-3907-0201
Dmitry A. Bugayenko, veterinarian, bugaenko900@bk.ru, https://orcid.org/0000-0002-2328-913X
Вклад авторов: все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Contribution of the authors: the authors contributed equally to this article. The authors declare no conflicts of interests.
Статья поступила в редакцию 03.10.2022; одобрена после рецензирования 17.10.2022; принята к публикации 31.10.2022.
The article was submitted 03.10.2022; approved after reviewing 17.10.2022; accepted for publication 31.10.2022. -♦-
Научная статья УДК 579.62
doi: 10.37670/2073-0853-2022-98-6-219-223
Таксономическая структура и биопрофиль микроорганизмов, выделенных из мочи кошек с заболеваниями мочевыделительной системы*
Мария Викторовна Сычёва12, Татьяна Михайловна Пашкова12,
Ольга Александровна Пашинина2, Владимир Ильич Сорокин1,
Наталья Викторовна Морозова2, Ольга Львовна Карташова12
1 Оренбургский государственный аграрный университет, Оренбург, Россия
2 Оренбургский федеральный исследовательский центр УрО РАН, Оренбург, Россия
Аннотация. В работе охарактеризованы таксономическая структура и биопрофиль микроорганизмов, выделенных из мочи 27 кошек с заболеваниями мочевыделительной системы (мочекаменная болезнь и цистит). 35 культур бактерий изолированы общепринятыми методами и идентифицированы с помощью масс-спектрометрии. У штаммов определены наличие и выраженность гемолитической, антилизоцимной активностей, способности к образованию биоплёнок, показателя адгезии. Установлено доминирование Staphylococcus spp. и Escherichia coli в структуре микрофлоры. Данные микроорганизмы, вне зависимости от их видовой принадлежности, обладали выраженным патогенным потенциалом. Определены особенности биопрофилей культур разных видов по выраженности изученных биологических свойств. Патогенный биопрофиль микроорганизмов, выделенных при патологии мочевыделительной системы у кошек, может использоваться в качестве критерия для поиска и идентификации возбудителя, а также для разработки эффективных подходов к терапии.
Ключевые слова: микроорганизмы, антилизоцимная активность, биоплёнкообразование, показатель адгезии, гемолитическая активность, кошки, заболевания мочевыделительной системы.
Для цитирования: Таксономическая структура и биопрофиль микроорганизмов, выделенных из мочи кошек с заболеваниями мочевыделительной системы / М.В. Сычёва, Т.М. Пашкова, О.А. Пашинина и др. // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. 2022. № 6 (98). С. 219 - 223. https:// doi.org/10.37670/2073-0853-2022-98-6-219-223.
* Работа выполнена в рамках государственного задания Минсельхоза России на проведение прикладных научных исследований (номер государственного учёта НИР АААА-А19-119101890005-1).
Original article
Taxonomic structure and biological properties microorganisms isolated from the urine of cats with diseases urinary system
Maria V. Sycheva12, Tatyana M. Pashkova12, Olga A. Pashinina2,
Vladimir I. Sorokin1, Natalya V. Morozova2, Olga L. Kartashova12
1 Orenburg State Agrarian University, Orenburg, Russia
2 Orenburg Federal Research Center of the Ural Branch RAS, Orenburg, Russia
Abstract. The paper characterizes the taxonomic structure and bioprofile of microorganisms isolated from the urine of 27 cats with diseases of the urinary system (urolithiasis and cystitis). 35 bacterial cultures were isolated by conventional methods and identified by mass spectrometry. The presence and severity of hemolytic, antilysozyme activity, the ability to form biofilms, and the adhesion index were determined in the strains. The dominance of Staphylococcus spp. and Escherichia coli in the microflora structure. These microorganisms, regardless of their species, had a pronounced pathogenic potential. The features of bioprofiles of cultures of different species were determined according to the severity of the studied biological properties. The pathogenic bioprofile of microorganisms isolated from the pathology of the urinary system in cats can be used as a criterion for the search and identification of the pathogen, as well as for the development of effective approaches to therapy.
Keywords: microorganisms, anti-lysozyme activity, biofilm formation, adhesion index, hemolytic activity, cats, diseases of the urinary system.
For citation: Taxonomic structure and biological properties microorganisms isolated from the urine of cats with diseases urinary system / M.V. Sycheva, T.M. Pashkova, O.A. Pashinina et al. Izvestia Orenburg State Agrarian University. 2022; 98(6): 219-223. (In Russ.). https://doi.org/10.37670/2073-0853-2022-98-6-219-223.
В практике ветеринарных специалистов заболевания органов мочевыделения являются одними из наиболее распространённых патологий у мелких домашних животных. С каждым годом отмечается тенденция к увеличению количества животных, страдающих болезнями мочеполовой системы [1].
Установлена роль микроорганизмов в развитии инфекционно-воспалительных процессов в урогенитальном тракте. Так, показано, что острый бактериальный цистит может быть вызван воздействием условно-патогенной флоры [2]. Как правило, причиной инфекционного процесса в мочевом пузыре служат бактерии кишечной или дистальной урогенитальной микрофлоры [3]. Установлено также, что одной из главных причин мочекаменной болезни, наблюдаемой у 13,5 % кошек разных пород, является бактериальная инфекция, сопровождающая 20 % всех случаев заболевания [4].
Для разработки этиологического подхода к диагностике заболеваний мочевыделительной системы и лечению пациентов необходимо изучение биологических свойств истинных возбудителей. Выделены следующие основные атрибуты уропатогенности бактерий: адгезины, инвазины, токсины, факторы персистенции. В связи с этим актуальным является изучение комплекса фенотипических свойств у бактерий (биопрофиль), вызывающих развитие инфекционно-воспалительных заболеваний мочевыделительной системы у кошек: способности к адгезии, образованию экзотоксинов, формированию биоплёнок и антилизоцимной активности.
Цель исследования - охарактеризовать таксономическую структуру и биопрофиль
микроорганизмов, выделенных из мочи кошек с заболеваниями мочевыделительной системы.
Материал и методы. В исследование были включены 35 штаммов бактерий разных видов, выделенных из мочи 27 кошек с заболеваниями мочевыделительной системы (мочекаменная болезнь (МКБ), цистит). Животные находились на лечении в ветеринарной клинике ООО «НИЦ «Инновационная ветеринария».
Мочу для исследования получали с использованием катетера в асептических условиях, пробы доставляли в бактериологическую лабораторию в течение одного-двух часов.
Микроорганизмы выделяли с использованием классических бактериологических методик. Желточно-солевой агар использовали для выделения стафилококков; Enterococcosel-Agar (CONDA, Испания) и жёлчно-эскулиновый агар с азидом натрия (HiMedia, Индия) - для энтерококков; кровяной агар и среду Эндо - для энтеробактерий и неферментирующих бактерий. Иосевы бактерий инкубировали при 37 °С в течение 18 - 24 час.
Видовую принадлежность микроорганизмов определяли с помощью масс-спектрометра MALDI-TOF серии Microflex (Bruker Daltonics, Германия) с расчётом коэффициента достоверности при использовании программного обеспечения Maldi BioTyper 3,0.
Антилизоцимную активность микроорганизмов (АЛА) определяли фотометрическим методом [5], способность образовывать биоплёнки (БО) -по методике G. O'Toole с соавт. [6], показатель адгезии микробных клеток (ИА) - по методике С.С. Гизатулиной с соавт. [7], гемолитическую активность (ГА) - фотометрическим методом [8].
Статистическую обработку проводили с помощью параметрических методов [9].
Результаты и обсуждение. При бактериологическом исследовании из всех проб мочи было выделено 35 штаммов условно-патогенных микроорганизмов, при этом степень бактериурии варьировала от 1 х 103 до 1 * 108 КОЕ/мл.
В структуре микрофлоры, выделенной из мочи кошек с патологией мочевыделительной системы, установлено численное преобладание Staphylococcus spp. и Escherichia coli (табл. 1).
Реже выделялись виды Enterococcus faecalis, Enterobacter cloacae, Micrococcus luteus и Hafnia alvei, в единичных случаях - E. hormaechei, Klebsiella pneumoniae и Aerococcus viridans.
Кроме того, показано, что в 82,4 % случаев условно-патогенные микроорганизмы выделялись в монокультуре, в 17,6 % случаев были изолированы 2- и 3-компонентные бактериальные ассоциации: E. coli и E. faecalis; E. coli и S. aureus и S. intermedius; E. coli, E. faecalis и S. intermedius.
1. Таксономическая структура микроорганизмов, выделенных из мочи кошек с заболеваниями мочевыделительной системы
Микрофлора мочи Число микроорганизмов, абс / %
Staphylococcus spp. 12 / 34,2
S. aureus 6 / 17,1
S. intermedius 4 / 11,4
S. sciuri 2 / 5,71
E. coli 6 / 17,1
E. faecalis 4 / 11,4
Enterobacter spp. 5 / 14,3
E. cloacae 4 / 11,4
E. hormaechei 1 / 2,9
M. luteus 3 / 8,6
H. alvei 3 / 8,6
K. pneumoniae 1 / 2,9
A. viridans 1 / 2,9
Всего 35 / 100
Так как изоляты Staphylococcus spp. и Е. coli доминировали в структуре микрофлоры, выделенной из мочи животных с патологией мочевыделительной системы, то именно у них был определен комплекс биологических свойств (биопрофиль), включающий вирулентные и пер-систентные характеристики (рис. 1).
Отмечено, что способностью формировать биоплёнки и антилизоцимной активностью обладали все изученные штаммы, за исключением коагулазонегативных стафилококков - S. sciuri.
Для изолятов E. coli показатель БО был равен 1,43 ± 0,31 у.е., у стафилококков разных видов он не отличался и составлял у S. aureus 1,15 ± 0,03 у.е., а у штаммов S. intermedius - 1,16 ± 0,11 у.е. Значения АЛА у кишечной палочки (1,1 ± 0,08 мкг/мл) были достоверно выше этого признака как у культур S. aureus (0,47 ± 0,27 мкг/
мл, P < 0,05), так и у S. intermedius (0,17 ± 0,03 мкг/мл, P < 0,01).
Показатель адгезии убывал в ряду: S. aureus (23,4 ± 19,2 %), E. coli (13,1 ± 2,89 %), S. intermedius (7,1 ± 1,34 %). Способности к адгезии у изолятов S. sciuri не обнаружено.
Высокий уровень гемолитической активности был характерен для стафилококков всех изученных видов: у S. aureus он составлял 35,5 ± 6,86 %, у S. intermedius 47,6 ± 16,9 %, у S. sciuri 32,2 ± 1,94 %, тогда как выраженность данного признака у кишечной палочки была значимо меньше (6,8 ± 1,5 %, P < 0,05).
Анализ биопрофилей стафилококков и кишечной палочки показал, что данные микроорганизмы вне зависимости от их видовой принадлежности характеризуются выраженным патогенным потенциалом, который определяется наличием у них комплекса вирулентных и персистентных свойств, включая адгезивную способность, гемолитическую активность, антилизоцимную активность и способность к биоплёнкообразованию.
Исследование особенностей биопрофилей уропатогенов позволило установить, что микроорганизмы не отличались по наличию изученных биологических свойств, однако выраженность АЛА кишечной палочки в 2,3 - 6,5 раза превышала таковую у S. aureus и S. intermedius. Напротив, у стафилококков разных видов достоверно выше уровень гемолитической активности по сравнению с уровнем ГА кишечной палочки. Полученные нами результаты о высоком показателе адгезии у S. aureus косвенно подтверждают данные о том, что механизмы адгезии и адге-зины золотистого стафилококка отличаются от механизмов адгезии и адгезинов других микроорганизмов [10].
Экспрессия бактериями указанных патогенных признаков, очевидно, способствует развитию инфекционно-воспалительного заболевания, а длительному переживанию возбудителя в организме хозяина за счёт супрессии (нейтрализации) компонентов антимикробной защиты макроорганизма способствуют факторы персистенции микроорганизмов [11].
Развитие биоплёночных сообществ также является одной из основных стратегий выживания бактерий в организме инфицированных хозяев. Достоверно доказано, что биоплёнкообразующие штаммы микроорганизмов играют ведущую роль в возникновении заболеваний мочевыде-лительной системы, которые трудно поддаются лечению и характеризуются высокой частотой рецидивов [12]. Это связано с тем, что бактерии в биоплёнках могут обмениваться плазмидами резистентности [13]; не поддаются воздействию эффекторов иммунной системы [14]; обладают низкой чувствительностью к антимикробным агентам [15].
У-е- 6 5 4 3 2 1 0
E. coli
S. aureus ^ БО ЕЗ АЛА
S. sciuri 3 ГА □ ПА
S. intermedius
Примечание: * P < 0,05; **P < 0,01 - достоверность различий показателей у Staphylococcus spp. и E. coli
Рис. 1 - Биопрофили микроорганизмов, выделенных из мочи кошек при цистите и МКБ:
БО - биоплёнкообразование, у.е; АЛА - антилизоцимная активность, мкг/мл х ОП; ГА - гемолитическая активность, х 10 %; ПА - показатель адгезии, х 10 %
Патогенный биопрофиль микроорганизмов, выделенных при патологии мочевыделитель-ной системы у кошек, может использоваться, с одной стороны, в качестве критерия для поиска и идентификации возбудителя, а с другой - для разработки эффективных подходов к терапии.
Выводы
1. Установлено доминирование изолятов Staphylococcus spp. и вида E. coli в таксономической структуре микрофлоры, выделенной из мочи животных с заболеваниями мочевыделительной системы (мочекаменная болезнь, цистит).
2. Высокая частота встречаемости изученных факторов персистенции и патогенности у клинических изолятов свидетельствует об их потенциальной патогенности.
3. Определены особенности биопрофилей доминирующих микроорганизмов по наличию изученных биологических свойств: выраженность АЛА кишечной палочки в 2,3 - 6,5 раза превышала таковую у S. aureus и S. intermedius, а у стафилококков разных видов достоверно выше уровень гемолитической активности по сравнению с уровнем ГА кишечной палочки.
Список источников
1. Штагер И.В. Частота встречаемости и клиническое проявление уролитиаза у домашних животных Республики Хакасия // Международный научно-исследовательский журнал. 2017. № 12 (66). С. 87 - 91.
2. Жуков В.М. Органопатология мочеполовой системы котов // Вестник Алтайского государственного аграрного университета. 2019. № 8 (178). С. 157 - 159.
3. Feline bacterial urinary tract infections: an update on an evolving clinical problem / A. Litster, M. Thompson, S. Moss et al. Vet. Journal. 2011; 187: 18-22.
4. Самородова И.М. Диагностика и фармакокоррекция уролитиаза плотоядных животных. СПб.: Лань, 2009. 320 с.
5. Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. М.: Медицина, 1999. 365 с.
6. O'Toole G., Kaplan N.V., Kolter R. Biofilm formation as microbial development. Annual Review of Microbiology. 2000; 54: 49-79.
7. Гизатулина С.С., Биргер М.О., Кулинич Л.И. Способ оценки состояния микрофлоры кишечника человека по количеству адгезивно-активных колоний и типу адгезинов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и мммунобиологии. 1991. № 4. С. 21 - 23.
8. Ханина Е.А. Определение гемолитической активности микроорганизмов фотометрическим методом с использованием сапонина // Сб. матер. регион. науч.-практич. конф. молодых учёных и специалистов. Оренбург, 2003. С. 174 - 175.
9. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Ленинград: Гос. изд-во мед. лит., 1962. 180 с.
10. Зубарева И.В., Беренштейн Т.Ф., Федянин С.Д. Об адгезии грамположительных кокков // Вестник Витебского государственного медицинского университета. 2010. Т. 9. № 1. С. 6 - 16.
11. Гриценко В.А., Иванов Ю.Б. Роль персистентных свойств микроорганизмов в патогенезе эндогенных бактериальных инфекций // Вестник Уральской медицинской академической науки. 2009. № 2. С. 35 - 39.
12. Zamani H., Salehzadeh A. Biofilm formation in uropathogenic Escherichia coli: association with adhesion factor genes. Turk J. Med. Sci. 2018; 23-48(1): 162-167.
13. Chan C., Hardin T.C., Smart J.I. A review of telavancin activity in in vitro biofilms and animal models of biofilm-associated infections. Future Microbiol. 2015; 10(8): 1325-1338.
14. Staphylococcus epidermidis polysaccharide einter cellular adhesion activates complement / E.G. Fredhem, H.N. Grano, T. Flaegtad et al. FEMSImmunology & Medical Microbiology. 2011; 63(2): 269-280.
15. Evolution of antibiotic resistance in biofilm and planktonic P. aeruginosa populations exposed to subinhibitory levels of ciprofloxacin / M.N. Ahmed, A. Porse, M.O.A. Sommer et al. Antimicrob. Agents Chemother. 2018; 14. https://doi.org/10.1128/AAC.00320-18.
a A
A A
A A
References
1. Shtager I.V. Frequency of occurrence and clinical manifestation of urolithiasis in domestic animals of the Republic of Khakassia. International research journal. 2017; 66(12): 87-91.
2. Zhukov V.M. Organopathology of the genitourinary system of cats. Bulletin of Altai State Agricultural University. 2019; 178(8): 157-159.
3. Feline bacterial urinary tract infections: an update on an evolving clinical problem / A. Litster, M. Thompson, S. Moss et al. Vet. Journal. 2011; 187: 18-22.
4. Samorodova I.M. Diagnosis and pharmacocorrection of urolithiasis in carnivores. St. Petersburg: Lan, 2009. 320 p.
5. Bukharin O.V. Persistence of pathogenic bacteria. M.: Medicine, 1999. 365 p.
6. O'Toole G., Kaplan N.V., Kolter R. Biofilm formation as microbial development. Annual Review of Microbiology. 2000; 54: 49-79.
7. Gizatulina S.S., Birger M.O., Kulinich L.I. A method for assessing the state of human intestinal microflora by the number of adhesive-active colonies and the type of adhesions. Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology. 1991; 4: 21-23.
8. Khanina E.A. Determination of the hemolytic activity of microorganisms by photometric method using saponin. Collection of materials of the regional scientific-practical conference of young scientists and specialists. Orenburg. 2003. P. 174-175.
9. Ashmarin I.P., Vorobyov A.A. Statistical methods in microbiological research. Leningrad: State. publishing house med. lit., 1962. 180 p.
10. Zubareva I.V., Berenstein T.F., Fedyanin S.D. On the adhesion of gram-positive cocci. Vestnik of Vitebsk State Medical University. 2010; 9(1): 6-16. Bulletin of the Voronezh State Medical University.
11. Gritsenko V.A., Ivanov Yu.B. The role of persistent properties of microorganisms in the pathogenesis of endogenous bacterial infections. Bulletin of the Ural Medical Academic Science. 2009; 2: 35-39
12. Zamani H., Salehzadeh A. Biofilm formation in uropathogenic Escherichia coli: association with adhesion factor genes. Turk J. Med. Sci. 2018; 23-48(1): 162-167.
13. Chan C., Hardin T.C., Smart J.I. A review of telavancin activity in in vitro biofilms and animal models of biofilm-associated infections. Future Microbiol. 2015; 10(8): 1325-1338.
14. Staphylococcus epidermidis polysaccharide einter cellular adhesion activates complement / E.G. Fredhem, H.N. Grano, T. Flaegtad et al. FEMS Immunology & Medical Microbiology. 2011; 63(2): 269-280.
15. Evolution of antibiotic resistance in biofilm and planktonic P. aeruginosa populations exposed to sub-inhibitory levels of ciprofloxacin / M.N. Ahmed, A. Porse, M.O.A. Sommer et al. Antimicrob. Agents Chemother. 2018; 14. https://doi.org/10.1128/AAC.00320-18.
Мария Викторовна Сычёва, доктор биологических наук, профессор, sycheva_maria@mail.ru, https://orcid.org/0000-0003-1455-1631
Татьяна Михайловна Пашкова, доктор биологических наук, pashkova070782@mail.ru, https://orcid.org/0000-0001-8075-8249
Ольга Александровна Пашинина, кандидат биологических наук, olga25mikro@mail.ru, https://orcid.org/0000-0001-9944-3095
Владимир Ильич Сорокин, кандидат биологических наук, доцент, vis5256@yandex.ru Наталья Викторовна Морозова, кандидат биологических наук, natascha210994@mail.ru, https://orcid.org/0000-0003-1628-7010
Ольга Львовна Карташова, доктор биологических наук, профессор, labpersist@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-1487-7546
Maria V. Sycheva, Doctor of Biology, Professor, sycheva_maria@mail.ru, https://orcid.org/0000-0003-1455-1631 Tatyana M. Pashkova, Doctor of Biology, pashkova070782@mail.ru, https://orcid.org/0000-0001-8075-8249 Olga A. Pashinina, Candidate of Biology, olga25mikro@mail.ru, https://orcid.org// 0000-0001-9944-3095 Vladimir I. Sorokin, Candidate of Biology, Associate Professor, vis5256@yandex.ru
Natalya V. Morozova, Candidate of Biologу, natascha210994@mail.ru, https://orcid.org/0000-0003-1628-7010 Olga L. Kartashova, Doctor of Biology, Professor, labpersist@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-1487-7546
Вклад авторов: все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Contribution of the authors: the authors contributed equally to this article. The authors declare no conflicts of interests. Статья поступила в редакцию 29.10.2022; одобрена после рецензирования 14.11.2022; принята к публикации 14.11.2022.
The article was submitted 29.10.2022; approved after reviewing 14.11.2022; accepted for publication 14.11.2022. -♦-
