CC BY
44
УДК 612.015.1-324:15
Котюжинская С. Г., Гоженко А. И:, Савицкий И. В, Свирский А. А. ХАРАКТЕРИСТИКА ЛИПИДТРАНСПОРТНОЙ СИСТЕМЫ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ГИПЕРЛИПИДЕМИИ НА ФОНЕ ГИПЕРГЕПАРИНЕМИИ
Одесский национальный медицинский университет ГП «Украинский НИИ медицины транспорта», г. Одесса
Известно, что транспорт липопротеинов осуществляется через межклеточные эндотелиальные каналы и неповрежденные эндотелиальные клетки и зависит от липолитической активности сосудистой стенки. Однако усвоение липопротеинов тканями начинается с действия на них липо-протеинлипазы, которая расщепляет основные энергетически значимые липиды на жирные кислоты и глицерин, при этом основным механизмом управления ее ферментативной активностью является гепарин. Целью нашего исследования было изучение особенностей показателей липид-транспортной системы у животных при экспериментальной гиперлипидемии в условиях гиперге-паринемии. Гиперлипидемию в эксперименте воспроизводили на 25 белых беспородных половозрелых крысах-самцах по методу В. Е. Рыжкова и В. Г. Макарова на фоне одновременного введения водного раствора гепарина в дозе 50 МЕ/кг в течение 21 дня. В ходе исследования оценивали ли-пидный и жирнокислотный спектр крови и активность липопротеинлипазы (по методу Т. Olivecrona в модификации В. Н. Титова). Выявлена выраженная гипохолестеринемия и гипотриг-лицеридемия при увеличении содержания антиатерогенных ХС ЛПВП на фоне снижения уровня насыщенных жирных кислот и увеличения пула ПНЖК, что свидетельствовало о формирование стойкой дислипидемии антиатерогенного генеза. Показано, что при стойкой гипергепаринемии происходит активация липопротеинлипазы, которая обеспечивает адекватный липолиз и не позволяет развиваться атерогенным нарушениям со стороны липидтранспортной системы.
Ключевые слова: липидтранспортная система, липопротеинлипаза, гепарин, экспериментальная гиперлипидемия. Работа выполнялись в рамках плановой НИР Одесского национального медицинского университета МЗ Украины «Роль и механизмы нарушения липидтранспортной системы крови в патогенезе атеросклероза» (№ госрегистрации 0110^06663).
цией является гепарин [7,15].
Цель исследования
Оценить состояние липидтранспортной системы при экспериментальной гиперлипидемии на фоне повышенного уровня гепарина в плазме крови.
Материалы и методы исследования
Экспериментальные исследования проведены в соответствии с положениями Конвенции по биоэтике Совета Европы (1997), Хельсинской декларации Всемирной Медицинской Ассоциации (1996), Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях (Страсбург, 1986), общих этических принципов экспериментов на животных, принятые Первым национальным конгрессом Украины по биоэтике (2001).
Изучение состояния липидтранспортной системы проводили на 25 белых беспородных половозрелых крысах-самцах, массой 200-250 г. Гиперлипидемию в эксперименте воспроизводили по методу В.Е. Рыжкова и В. Г. Макарова атерогенной диетой, содержащей 30 % подсолнечного масла, 2,5% холестерина и 0,12% мети-лурацила, из расчета 1 г жировой нагрузки на
Известно, что в норме липидтранспортная система посредством липопротеинов обеспечивает доставку к клеткам холестерина и обратный его отток к печени, предупреждая избыточное внутриклеточное накопление с развитием цитотоксического эффекта [1,4,12]. При этом следует отметить, что метаболизм липопротеинов - сложный динамический процесс, включающий в себя не только разнообразное перемещение липидов и апопротеинов между отдельными классами липопротеинов, но и целый ряд реакций, катализируемых ферментами [3,9,11]. Эти взаимодействия приводят к рецептор-но-опосредованному поступлению холестерина в клетку или к его удалению из клетки. Другими словами, в организме существует липидтранспортная система, обеспечивающая обмен липидов на должном уровне от потребностей организма [4,14].
Между тем усвоение липопротеинов тканями начинается с действия на них липопротеинлипазы, которая расщепляет основные энергетически значимые липиды на жирные кислоты и глицерин, последние и усваиваются тканями. Известно, что транспортировка липопротеинов осуществляется через межклеточные эндотелиальные каналы и неповрежденные эндотелиальные клетки и зависит от липолитической активности сосудистой стенки [2,5,13]. Важно подчеркнуть, что основным механизмом управления липопротеинлипазной актива-
100 г массы тела, в течение 21 дня [8], на фоне одновременного введения водного раствора гепарина «Биолек» (Украина) в дозе 50 МЕ/кг.
Контрольные животные (n=10) получали 0,9 % раствор хлорида натрия в объеме доз экспериментальной группы и находились на стандартном рационе вивария, имея свободный доступ к пище и воде.
По истечении срока животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом. Проводили забор крови, которую стабилизировали цитратом натрия.
Активность липопротеинлипазы (ЛПЛ) плазмы крови определяли титрованием по методу Т. Olivecrona в модификации В. Н. Титова [9]. Показателем активности фермента является количество освобожденных жирных кислот из триг-лицеридов в течение 1 часа (ммоль/л/ч). Содержание гепарина определяли по реакции с толуидиновым синим по методу Pieptea в модификации А. П. Чернышовой [10].
Содержание в плазме крови липопротеинов определяли на автоанализаторе «Dixion Torus» (Россия) с помощью ферментативных диагностических наборов фирмы «Бюмарк» (г. Львов). Определение триглицеридов (ТГ) в сыворотке крови энзиматическим колориметрическим методом М. Флетчера [6]. Концентрация общего холестерина (ОХС) определялась стандартным ферментативным методом. Уровень холестерина в липопротеинах высокой плотности (ХС ЛПВП) определяли в супернатанте после осаждения из плазмы липопротеинов низкой (ХС ЛПНП) и очень низкой плотности (ХС ЛПОНП) смесью фосфоровольфрамата натрия с 0,5 М
хлоридом магния тем же методом, что и ОХС. Содержание ХС ЛПНП и ХС ЛПОНП вычисляли по формуле W.T. Friedwald еt al. [6]. Для оценки степени риска атеросклероза рассчитывали коэффициент атерогенности (КА) по формуле А. Н. Климова [6].
Для оценки жирнокислотного спектра плазмы крови определяли концентрацию жирных кислот методом газовой хроматографии по методике F. Marangoni [9] на хромато-масс-спектометре Agilent MS D 1100 ("Hewlett Packard", США).
Статистический анализ результатов исследований проводили по общепринятым в экспериментальной медицине методам с использованием пакета программ "Microsoft Excel-2000". Результаты обрабатывались параметрическими методами вариационной статистики и представлены в виде средних арифметических значений и ошибка средних значений (М±т). Достоверность различий между средними значениями в группах определяли по t-критерию Стъюдента, оценивая вероятность полученных результатов на уровне значимости не менее 95% (р<0,05).
Результаты исследования и их обсуждение
Нами отмечено, что концентрация гепарина в крови у животных опытной группы была достоверно выше контрольных величин на 46,47 %, что позволяет говорить о развитии стойкого ги-пергепаринемического состояния в экспериментальной группе животных (рис. 1). На этом фоне отмечалось достоверное увеличение ферментативной активности ЛПЛ, которое составило 109,77 %, по сравнению с контрольными данными.
20
15
10
0
I 23.18
I т
■ 6,67 11.05 10,24
контроль
атер о генная днета+гепарин
гепарин. ME/мл ЛПЛ. ммоль/л/ч
Рис. 1. Соотношение изменения динамики ЛПЛ и гепарина в исследуемых группах животных.
Состояния липидтранспортной системы в условиях гипергепаринемии характеризовалось снижением содержания в крови опытных животных уровня ОХС на 14,65 % по сравнению с контрольными данными (табл. 1).
Таблица 1.
Показатели липидного обмена у крыс, содержащиеся на атерогенной диете на фоне введения гепарина, (М±т)
Наряду с этим наблюдали изменения концентрации ХС и во фракции ЛПНП и ЛПОНП -содержание их уменьшалось на 5,02 % и на 13,73 %, соответственно. Что касается концентрации ТГ, то наблюдалось снижение содержания на 8,7 % по сравнению с контрольными данными. Увеличение уровня ХС ЛПВП было умеренным (на 17,81 %) и проявлялось в виде тенденции по сравнению с данными контрольной группы. Такие благоприятные изменения сопровождались отчетливым уменьшением атероген-ного потенциала крови - КА снижался в 2,04 раза.
При исследовании жирнокислотного состава плазмы крови животных отмечалось снижение уровня НЖК при незначительном повышении уровня МНЖК (табл. 2).
Таблица 2.
Жирнокислотный состав крови у крыс с гиперлипидемией
при введении гепарина, (М±т)
Так, титр пальмитиновой кислоты в опытной группе уменьшался на 7,55 %, а стеариновой -на 10,66 % по сравнению с контрольными данных. Со стороны олеиновой кислоты наблюдалась тенденция к росту концентрации, что составило 5,15 % по отношению к интактным животным.
В классе ы- 6 ПНЖК наблюдалось увеличение суммарного количества по сравнению с контрольными величинами до 37,29±1,30 % против 36,32±1,57 %. Следует заметить, что при этом доля каждой из кислот была одинакова, так уро-
вень арахидоновой кислоты увеличивался на 2,01 %, а концентрации линоленовой кислоты возрастала на 2,95 % от показателей животных в контрольной группе.
Определенные особенности наблюдались в группе ы-3 ПНЖК. Не смотря на увеличения суммарного количества кислот, изменение происходили в основном за счет достоверного увеличения ЭПК и ДГК (р<0,05), в то время как уровень а-линоленовой кислоты изменялся недостоверно.
Анализ полученных данных свидетельствовал об антиатерогенном состоянии липидтранс-портной системы в данной группе на фоне повышения концентрации гепарина в плазме крови, что приводило к увеличению ферментативной активности липопротеинлипазы и, в свою очередь, к развитию дислипидемии, проявляющейся гипохолестеринемией и гипотриглицери-демией, повышением уровня антиатерогенных фракций холестерина на фоне снижения уровня НЖК и достоверного увеличения ы-3 ПНЖК.
Выводы
Таким образом, можно констатировать, что повышение уровня гепарина при хроническом его введении на фоне атерогенной диеты приводит к активации липопротеинлипазы, обеспечивая тем самым адекватный липолиз, и не позволяет развиваться атерогенным нарушениям со стороны липидтранспортной системы. Свидетельством того служат гипотриглицеридемия и гипохолестеринемия, которые реализуются также в снижении холестерина в составе атероген-ных фракций ЛПНП и ЛПОНП, тогда как уровень ХС ЛПВП увеличивается относительно контрольных величин. Отмечается и повышение пула ПНЖК на фоне уменьшения титра НЖК.
Полученные результаты позволяют считать, что уровень гепаринемии определяет не только характер изменения активности липопротеинли-пазы, но и особенности перестройки функций липидтранспортной системы в целом.
Литература
1. Бодрова О.В. Атеросклероз / О.В. Бодрова. - М. : Крон-Пресс, 2000. - 408 с.
2. Гоженко А.И. Липопротеинлипаза в патологии липидного обмена / А.И. Гоженко, С.Г. Котюжинская // Актуальные проблемы транспортной медицины. - 2011. - № 2. - С. 8-13.
3. Ким Л.Б. Роль гепарина в регуляции транскапиллярного обмена и перекисного окисления липидов у больных ишемичес-кой болезнью сердца / Л.Б. Ким, В.Ю. Куликов, В.Н. Мельников // Бюллетень СО РАМН. - 2010. - № 1. - С. 72-77.
4. Коваленко В.Н. Холестерин и атеросклероз: традиционные взгляды и современные представления / В.Н. Коваленко, Т.В. Талаева, В.В. Братусь // Укра'шський кардюлопчний журнал. -2010. - № 3. - С. 3-12.
5. Максименко А.В. Функции и состояние эндотелиального гли-кокаликса в норме и патологии / А.В. Максименко, А.Д. Тура-шев // Атеросклероз и дислипидемии. - 2011. - № 2. - С. 417.
6. Методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен) / Под ред. М.И. Прохоровой. - Л. : Изд.-во Ленинградского ун-та, 1982. - 272 с.
7. Зайцева Н.С. Роль активности липопротеидлипазы, гиперин-сулинемии и уровня неэстерифицированных жирных кислот в развитии дислипопротеидемий / Н.С. Зайцева, Т.В. Виноградова, И.А. Олейник [и др.] // Медицинский академический журнал - 2005. - Т 5, № 4. - С. 43-49.
Показатели, ммоль/л Контрольная группа (п=10) Атерогенная диета + гепарин (п=25)
ОХС 1,57±0,31 1,34±0,54
ТГ 1,15±0,02 1,05±0,03
ХС-ЛПВП 0,73±0,04 0,86±0,10
ХС-ЛПНП 0,69±0,03 0,60±0,04*
ХС-ЛПОНП 0,58±0,02 0,51±0,03*
КА, ед. 1,14±0,14 0,56±0,08
Примечание. * - р < 0,05 - достоверность различий по сравнению с контрольной группой.
Жирные кислоты, % Контрольная группа (п=10) Атерогенная диета + гепарин (п=25)
Пальмитиновая 15,11±1,16 13,97±1,24
Стеариновая 18,39±2,03 16,43±1,75
Олеиновая 15,33±0,27 16,12±0,68
Арахидоновая 10,94±0,73 11,16±0,63
Линолевая 25,38±0,84 26,13±0,67
а-линоленовая 9,35±0,44 9,84±0,32
Эйкозапентаеновая 0,13±0,01 0,17±0,02*
Докозагексаеновая 5,46±0,26 6,18±0,17*
Примечание. * - р □ 0,05 - достоверность различий с контрольной группой.
Dontas, K.A. Marinou, D. Iliopoulos [et al.] // Lipids Health Dis. -2011. - Vol. 10. - P. 139-144.
12. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis / A.V. Khera, M. Cuchel, M. de la Llera-Moya [et al.] // N. Engl. J. Med. - 2011. - Vol. 364, N 2. - P. 127-135.
13. Tall A.R. HDL, ABC transporters, and cholesterol efflux: implications for the treatment of atherosclerosis / A.R. Tall, L. Yvan-Charvet, N. Terasaka [et al.] // Cell Metab. - 2008. - Vol. 7, N 5. -P. 365-375.
14. Tsutsumi K. Lipoprotein Lipase and Atherosclerosis // Current Vascular Pharmacology. - 2003. - № 1. - Р. 11-17.
15. Yasuda T. Update on the role of endothelial lipase in high-density lipoprotein metabolism, reverse cholesterol transport, and atherosclerosis / T. Yasuda, T. Ishida, D. J. Rader // Circ. J. - 2010. -Vol. 74. - P. 2263-2270.
Реферат
ХАРАКТЕРИСТИКА Л1П1ДТРАНСПОРТНО1 СИСТЕМИ ПРИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬН1Й ППЕРЛ1ПЩЕМИ НА ТЛ1 ППЕРГЕПАРИНЕМИ
Котюжинська С. Г., Гоженко А. I., Савицький I. В., CBipcbKi^ О. О.
Ключовi слова: липидтранспортная система, липопротеинлипаза, гепарин, експериментальна ппер™глде1мя.
Вщомо, що транспортування лтопроте'Гыв здшснюеться через м1жкп1тинн1 ендотел1альн1 канали i неушкоджен ендотелiальнi кл^ини й залежить вщ лтол^ично''' активносп судинно' стшки. Проте за-своення лтопроте'шв тканинами починаеться з дм на них лтопротешлтази, яка розщеплюе основы енергетично значущi лiпiди на жирн кислоти i глiцерин, при цьому основним мехашзмом управлiння и ферментативно' активнiстю е гепарин. Метою нашого дослiдження було вивчення особливостей пока-зникiв лiпiдтранспортноТ системи у тварин при експериментальнш гiперлiпiдемiТ в умовах ппергепари-немiТ. Гiперлiпiдемiю в експеримент вiдтворювали на 25 бiлих безпородних статевозртих щурах-самцях за методом В. G. Рижкова та В. Г. Макарова на ™i одночасного введення водного розчину гепарину в дозi 50 МО/кг протягом 21 дня. В ходi дослщження оцшювали лiпiдний i жирнокислотний спектр кровi i активнiсть лiпопротеТнлiпази (за методом Т. Olivecrona в модифкацп В. Н. Титова). Ви-явлено виражен гiпохолестеринемiя i гiпотриглiцеридемiя при збтьшены вмiсту антиатерогенних ХС ЛПВЩ на тлi зниження рiвня насичених жирних кислот i збтьшення пулу ПНЖК, що свщчило про фо-рмування стiйкоТ дислiпiдемiТ антиатерогенного генезу. Показано, що при стшкш ппергепаринеми вщ-буваеться активацiя лiпопротеТнлiпази, яка забезпечуе адекватний лiполiз i не дозволяе розвиватися атерогенним порушенням з боку лтщтранспортно''' системи.
Summary
CHARACTERISTIC OF LIPID-TRANSPORT SYSTEM IN MODELED HYPERLIPIDEMIA AGAINST THE BACKGROUND OF HYPERHEPARINEMIA
Kotyuzhinska S.G., Gozhenko A.I., Sawitskiy I.V., Svirsksy A. A.
Keywords: lipid-transport system, lipoprotein lipase, heparin, experimental hyperlipidemia.
Lipoprotein transport is known to be performed through the endothelial intercellular channels and intact endothelial cells and depends on the lipolytic activity of the vascular wall. However, uptake of lipoproteins by tissues begins with under the lipoprotein lipase impact, which breaks down the main energetically important lipids into fatty acids and glycerol, while the major control mechanism of its enzymatic activity is heparin. The aim of our study was to investigate the characteristic of indicators of lipid-transport system in animals exposed modelled hyperlipidemia against the background of hyperheparinemia. Hyperlipidemia is simulated in the experiment on 25 albino adult male rats by the method of V.Ye. Ryzhkov and V.G. Makarov against the background of the simultaneous administration of heparin water solution in a dose of 50 IU / kg for 21 days. The study evaluated the lipid and fatty acid spectrum of the blood and the activity of lipoprotein lipase (by the method of T. Olivecron modified by V. N. Titov). There was a substantial hypocholesterolemia and triglyc-eridemia under increased anti-atherogenic HDL cholesterol due to lower levels of saturated fatty acids and increased pool of PUFA, indicating the formation of anti-atherogenic dyslipidemia resistant genesis. It was shown that when the resistant hyperheparinemia was associated with the activation of lipoprotein lipase, which provides adequate lipolysis and does not allow the development of atherogenic affections by the lipid-transport system.
8. Рыжов В.Е. Методические указания по изучению гиполипиде-мического и антиатеросклеротического действия фармакологических веществ / В.Е. Рыжов, В.Г. Макаров // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению фармакологических веществ: под ред. Р. У. Хабриева. - М. : Медицина, 2005. - С. 455-456.
9. Титов В.Н. Атеросклероз как патология полиеновых жирных кислот. Биологические основы теории атеросклероза / В.Н. Титов. - Москва, 2002. - 495 с.
10. Чернышова А.П. Основные ферментативные процессы в патологии и клинике ревматизма / А.П.Чернышева // Труды НГМИ. - Новосибирск, 1960. - C. 430-437.
11. Dontas I.A. Changes of blood biochemistry in the rabbit animal model in atherosclerosis research; a time or stress-effect / I.A.
