CC BY
53
УДК 618.177-097
ХАРАКТЕРИСТИКА ГУМОРАЛЬНОГО И КЛЕТОЧНОГО ЗВЕНА ИММУННОЙ СИСТЕМЫ, ПОКАЗАТЕЛЕЙ АПОПТОЗА ЛИМФОЦИТОВ У ПАЦИЕНТОК С БЕСПЛОДИЕМ, ИМЕЮЩИХ ВЫСОКИЕ УРОВНИ СЫВОРОТОЧНЫХ АНТИСПЕРМАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ
М.В. Униговская, С.Н. Теплова, Б.И. Медведев, ЕЛ. Иванов ЧелГМА, г. Челябинск
Обследовано 108 пациенток с бееплодием, из них 74 с высоким уровнем антиспермальных антител в крови, 34 - с низким. Контрольную группу составили 23 здоровых женщины. У пациенток с высоким уровнем антиспермальных антител (АСАТ) выявлено повышение содержания ^А, 1§М, в сыворотке, а также рост абсолютного числа СБ25+, НЬА-1Ж+, С04+ лимфоцитов, что может свидетельствовать о поликлональной активации гуморального и клеточного иммунитета. Для этой группы в сравнении с группой 2 характерен более высокий уровень хГав в сыворотке при отсутствии отличий по другим показателям апоптоза.
Ключевые слова: антиспермалъные антитела, бесплодие, /#А, ^М, СО маркеры лимфоцитов, апоптоз лимфоцитов, зРаз, $Ра$Ь.
Актуальность. Общая частота бесплодного брака колеблется от 10 до 20 %, частота женского бесплодия составляет 47,5-53,5 % [4]. Одной из форм иммунологического бесплодия являются состояния, характеризующиеся наличием высоких уровней антиспермальных антител в сыворотке крови пациентов. Данная форма женского бесплодия встречается у 9-36 % нефертильных пар [6]. Антиспермалъные антитела, взаимодействуя в жидкостях женского репродуктивного тракта со сперматозоидами, вызывают нарушение их подвижности, а также блокируют мембранные молекулы, необходимые для взаимодействия с яйцеклеткой [2]. Возможно также участие антиспермальных антител в запуске иммунологических механизмов, повреждающих оболочку сперматозоидов.
Современные авторы выделяют ряд факторов, способствующих повышенной выработке антиспермальных антител. К ним относят хронические воспалительные заболевания половых органов, инфекции, передающиеся половым путем, генитальный эн-дометриоз, отягощенный аллергологический анамнез [1]. Вместе с тем нет ясного представления о механизмах реализации влияния этих факторов на развитие антиспермального иммунитета. Придается большое значение нарушению процессов иммунологической толерантности - «неотвечаемости» на некоторые антигены, что сопровождается активацией клонов лимфоцитов, продуцирующих ан-тиспермальные антитела. В норме элиминацию подобных клонов лимфоцитов, возможно, осуществляют процессы апоптоза. В то же время существует явный дефицит работ, посвященных оценке состояния гуморального и клеточного звена иммунной системы, а также программированной ги-
бели лимфоцитов у пациенток с повышенными уровнями антиспермальных антител.
Целью исследования является оценка гуморального иммунитета, популяционного и субпопу-ляционного состава лимфоцитов, процессов апоптоза у пациенток с бесплодием, сочетающимся с высокими уровнями антиспермальных антител.
Материалы и методы. Обследовано 108 пациенток с бесплодием (первичным или вторичным). Контрольную группу составили 23 соматически здоровых женщин фертильного возраста, не имеющих патологии репродуктивной системы. Пациентки с бесплодием были разделены на 2 группы: с высоким уровнем антиспермальных антител (> 65,00 Е/мл) - 74 женщины и с низким уровнем (0-35,00 Е/мл) - 34 женщины. Критерием исключения были промежуточные уровни антиспермальных антител (от 36,00 до 65,00 Е/мл) в сыворотке крови пациенток.
У пациенток, составляющих 1-ю группу, первичное бесплодие регистрировалось в 51,4 % случаев (38 женщин), вторичное бесплодие в 48,6 % (36 женщин). Во 2-й группе пациенток с первичным бесплодием было 19 (55,9 %), а имеющих вторичное бесплодие - 15 (44,1 %). Следовательно, соотношение первичного и вторичного бесплодия в обследуемых группах практически не отличалось.
По социальному составу пациентки всех трех групп были сопоставимы. Они не имели достоверных отличий по возрасту. Медиана возраста в первой группе составила 28 лет (квартили 26-32), во второй 29 лет (квартили 27-33), в группе контроля -также 29 лет (квартили 26-31).
Для обнаружения антиспермальных антител в сыворотке крови использовали иммуноферментный
Проблемы здравоохранения
14.00
12.00 10,00
8,00
6,00
4.00
2.00 0,00
г/л
"WW
**
гъ
швшш
IgA
IgM
14,00
12,00
10,00
8,00
6,00
4,00
2,00
0,00
;КОНТРОЛЬ
□АСАТ > 65 Е/мл
IACAT < 35 Е/мл
Медианы уровней 1дА, 1дМ, 1дО в сыворотке крови пациенток с бесплодием на фоне высокого и низкого содержания антиспермальных антител в сопоставлении с группой контроля: * - достоверное отличие от группы [АСАТ < 35 Е/мл]; **-достоверное отличие от группы [АСАТ < 35 Е/мл] и от группы контроля
метод (тест-система Sperm-antibody-elisa, Bioserv, Германия). Сывороточные уровни иммуноглобулинов IgA, IgM, IgG определяли иммунофермент-ным методом с помощью тест-системы «Иммуноскрин - G, М, А - ИФА - БЕСТ», производства ЗАО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск).
Популяционный спектр лимфоцитов оценивали путем CD-типирования непрямым иммуноф-люоресцентным методом с использованием мышиных моноклональных антител к соответствующим антигенам человека, а также меченых ФИТЦ Fab-фрагментов кроличьих антител против иммуноглобулинов мыши (НПО «Препарат», Н. Новгород). Определяли общее число лейкоцитов периферической крови, процент и абсолютное число лимфоцитов, Т-лимфоцитов (CD3+), Т-хелперов (CD4+), Т-цитотоксических (CDS4}, В-лимфоцитов (CD22'1}, NK-клеток (CD16+), а также лимфоцитов с маркерами активации CD25, CD71, HLA-DR и готовности к апоптозу - CD95.
Апоптоз лимфоцитов периферической крови изучали морфологически путем подсчета лимфоцитов с фрагментацией ядра при люминесцентной микроскопии мононуклеаров, окрашенных супра-витальным ядерным красителем Hoechst 33342 (Boehringer Mannheim).
Иммуноферментным методом с помощью тест-систем Bender Medsystems (Austria) определяли в сыворотке крови уровень растворимых рецепторов, регулирующих апоптоз клеток: ингибитора апоптоза sFas (растворимого CD95/Fas/Apo-l) и проапоптогенного фактора sFasL (растворимого Fas-лиганда).
Статистическая обработка результатов
Данные были обработаны с использованием пакета программ 81аШюа 6.0. Результаты представлены в виде медианы (Ме) и квартилей - нижнего и верхнего (С>Ь-С)и). Достоверность отличий сопоставляемых групп оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни, позволяющего работать с данными независимо от вида их распределения (значимыми считали отличия при р < 0,05). Корреляционный анализ проводили по Спирмену.
Результаты исследования и их обсуждение.
Увеличение уровня антиспермальных антител в сыворотке крови пациенток с бесплодием может отражать как проявление специфического иммунного ответа против спермальных антигенов, так и общее изменение антителопродукции вследствие нарушения функции гуморального звена иммунной системы. Для общей оценки гуморального иммунного ответа мы провели сопоставление уровней сывороточных иммуноглобулинов классов А, М, О у обследованных женщин (см. рисунок).
Как следует из рисунка, у женщин с бесплодием, имеющих высокие уровни антиспермальных антител, достоверно увеличено содержание всех анализируемых классов иммуноглобулинов в сыворотке крови, что может свидетельствовать о поликлональной активации В-лимфоцитов.
Были обнаружены отличия в популяционном составе лимфоцитов (табл. 1).
Как следует из табл. 1, у пациенток с бесплодием, сочетающимся с гиперпродукцией антиспермальных антител, в сопоставлении с пациентками,
Униговская М.В., Теплоеа С.Н.,
Медведев Б.И., Иванов Е.А.______________________
имеющими низкие их уровни, увеличено абсолютное число лимфоцитов периферической крови и число СБ4+ клеток (Т-хелперов). Кроме того, у них наблюдается увеличение абсолютного числа лимфоцитов с маркерами ранней и поздней активации -СР25 и НЬА-БК., что в целом свидетельствует об активации клеточного звена иммунитета.
Апоптоз лимфоцитов - один из важных меха-
Характеристика гуморального и клеточного звена _______иммунной системы, показателей апоптоза...
низмов поддержания иммунного гомеостаза. Как следует из табл. 2, наиболее выраженные изменения программированной гибели лимфоцитов выявлены у пациенток 1-й группы, которая достоверно отличалась от контрольной группы здоровых женщин более высокой численностью клеток с готовностью к апоптозу (СВ95+), повышенным числом лимфоцитов с морфологическими призна-
Таблица 1
Характеристика популяционного спектра лимфоцитов обследуемых пациенток
Показатели Группа 1 Группа 2 Группа 3 Достоверность отличий между группами (р) согласно тесту Манна-Уитни
Высокий уровень АСАТ+ бесплодие Низкий уровень АСАТ+ бееплодие Здоровые (контроль)
Ме дь-ди Ме дь-ди Ме дь-ди 1-2 1-3 2-3
АСАТ 79,42 70,70-96,00 10,14 6,90-20,25 - < 0,001 - -
Лейкоциты 5,45 4,50-6,40 5,00 4,20-5,80 4,80 3,80-5,80 0,086 0,028 0,361
Лимфоциты, х109/л 1,55 1,17-2,08 1,41 1,05-1,56 1,54 0,91-2,18 0,037 0,406 0,402
CD3, х109/л 1,08 0,84-1,47 0,94 0,73-1,14 0,97 0,62-1,43 0,235 0,297 1,000
CD4, х109/л 0,65 0,49-0,85 0,53 0,39-0,65 0,55 0,35-0,84 0,046 0,235 0,641
CD8, х109/л 0,40 0,32-0,54 0,35 0,29-0,41 0,35 0,21-0,53 0,109 0,183 0,776
CD22, х109/л 0,37 0,27-0,52 0,31 0,26-0,38 0,27 0,19-0,43 0,163 0,056 0,649
CD 16, х109/л 0,31 0,21-0,41 0,25 0,22-0,31 0,23 0,17-0,36 0,124 0,094 0,562
CD25, х109/л 0,18 0,15-0,28 0,16 0,13-0,22 0,15 0,09-0,24 0,015 0,027 0,478
CD71, х109/л 0,21 0,15-0,33 0,20 0,17-0,29 0,18 0,12-0,29 0,971 0,261 0,366
HLA-DR, х109/л 0,33 0,21-0,49 0,25 0,21-0,34 0,29 0,19-0,43 0,028 0,275 0,406
Таблица 2
Данные показателей, характеризующие процессы апоптоза
Показатели Группа 1 Группа 2 Группа 3 Достоверность отличий между группами (р) согласно тесту Манна-Уитни
Высокий уровень АСАТ+ бесплодие Низкий уровень АСАТ+ бесплодие Здоровые (контроль)
Ме дь-ди Ме дь-ди Ме дь-ди 1-2 1-3 2-3
СБ95, х109/л 0,16 0,12-0,21 0,14 0,12-0,18 0,12 0,07-0,17 0,436 0,003 0,028
Лимфоциты с признаками апоптоза - фрагментацией ядер, х109/л 0,10 0,07-0,15 0,10 0,05-0,12 0,07 0,04-0,12 0,158 0,016 0,215
ББав, пг/мл 74,51 66,01-79,10 54,37 32,56-72,75 79,03 77,24-84,21 0,041 0,197 0,042
БраБЬ, нг/мл 0,50 0,42-0,54 0,42 0,34-0,55 0,17 0,14-0,35 0,580 0,003 0,062
Проблемы здравоохранения
ками апоптоза и более высоким уровнем sFasL в сыворотке, что отражает усиление процессов программированной клеточной гибели. Известно, что рост растворимых регуляторных белков при апоп-тозе может быть связан с протеолитическим отщеплением мембранных рецепторов (Fas, FasL); в ряде случаев образование sFas, sFasL может осуществляться за счет механизма альтернативного сплайсинга [3]. Растворимый sFasL может индуцировать апоптоз путем взаимодействия с мембранным Fas-рецептором [5].
При сопоставлении показателей апоптоза в группах пациенток с высокими и низкими уровнями антиспермальных антител единственным достоверным отличием является более высокое содержание сывороточного sFas в 1-й группе (см. табл. 2).
Таким образом, у пациенток с бесплодием с повышенными уровнями антиспермальных антител в сравнении с пациентками, страдающими бесплодием с низкими уровнями этих антител, выявлен рост количества лимфоцитов в крови, признаки их поликлональной активации, увеличение содержания sFas в сыворотке.
Выводы
1. У пациенток с высокими уровнями антиспермальных антител наблюдается усиление общей антителопродукции, что может отражать активацию гуморального иммунного ответа.
2. Наибольшие изменения популяционного состава лимфоцитов характерны для группы пациенток с повышенным уровнем антиспермальных антител. Установлено увеличение абсолютного
числа лимфоцитов с маркерами ранней и поздней активации (CD25, HLA-DR), количества CD4 лимфоцитов.
3. При бесплодии у пациенток с высокими уровнями антиспермальных антител в сопоставлении с пациентками, имеющими низкие уровни этих антител, отмечается более высокое содержание sFas в сыворотке, при отсутствии отличий по другим показателям апоптоза.
Литература
1. Кулаков, В.И. Бесплодный брак / В.И. Кулаков. -М.: ГЭОТАР-Медиа, 2005. - 616 с.
2. Основы клинической иммунологии: пер. с англ. / Э. Чепелъ, М. Хейни, С. Мисбах, Н. Сновден. -5-е изд. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. - 416 с.
3. Теплова, С.Н. Первичные иммунодефицит-ные состояния / С.Н. Теплова, А.Ю. Пищаль ников. -Екатеринбург: УрО РАН, 2005. - 232 с.
4. Узлова, Т.В. Этиология, иммунологические аспекты патогенеза, диагностика и лечение трубно-перитонеального бесплодия / Т.В. Узлова. - Челябинск, 2000. - С. 12.
5. Mouawad, R. Plasma Fas ligand, an inducer of apoptosis, and plasma soluble Fas, an inhibitor of apoptosis, in advanced melanoma / R. Mouawad, D. Khayat, C. Soubrane // Melanoma Res. - 2000. -V. 10 (5). - P. 461-467.
6. Rajesh, K. Naz. Modalities for treatment of antisperm antibody mediated infertility: novel perspectives / K. Naz Rajesh // American Journal of Reproductive Immunology. — 2004. - P. 390—397.
Поступила в редакцию 21 февраля 2010 г.
