CC BY
191
18. RavynM.D., KorenbergE.I., Oeding J.A. Lancet. 1999; 353: 722-3.
19. Rikihisa Y. Clin. Microbiol. Rev. 1991; 4: 286-308.
20. Sashika M., Abe G., Matsumoto K., Inokuma H. // Vector Borne Zoonotic Dis. 2011; 11: 349-54.
21. ShibataS., KawaharaM., Rikihisa Y. et al. J. Clin. Microbiol. 2000; 38: 1331-8.
22. Sumner J.W., Nicholson W.L., Massung R.F. J. Clin. Microbiol. 1997; 35: 2087-92.
23. Wen B, Jian R, Zhang Y, Chen R. J. 2002; 40: 3286-90.
Поступила 17.09.12
GENETIC VARIABILITY OF ANAPLASMATACEAE BACTERIA DETERMINED IN HAEMAPHYSALIS SPP. AND DERMACENTOR SP. TICKS IN THE TERRITORY OF THE RUSSIAN FAR EAST
VA. Rar1*, T.I. Epikhina1, N.M. Pukhovskaya2, N.P. Vysochina2, L.I. Jvanov2
institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, SB RAS, Novosibirsk, 2Khabarovsk Antiplague Station, Khabarovsk
Totally 484 Haemaphysalis japonica, 359 Haemaphysalis concinna and 221 Dermacentor silvarum collected in Amur region and Khabarovsk Territory of the Russian Far East were examined on the presence of Anaplasmataceae bacteria using nested PCR. All positive samples were characterized by analysis of the 16S rRNA gene and/or groESL operone nucleotide sequences. Forty nine H. japonica and three H. concinna were shown to contain DNA of two new Ehrlichia genetic variants. These genetic variants on the basis of the 16S rRNA gene and groESL operone nucleotide sequences analysis were most closely related to Ehrlichia spp. revealed in Haemaphysalis spp. ticks in Japan. Four H. concinna from Amur region were shown to contain DNA of a new Anaplasma bovis genetic variant, which corresponded to A. bovis genetic variant revealed in a red gray-backed vole and a Siberian chipmunk from the Far East. Three H. concinna and nine D. silvarum contained DNA of non-typical bacteria which can't be attributed to any Anaplasma-taceae genera based on the determined sequences of the 16S rRNA gene fragments. The revealed non-typical bacteria on the basis of 16S rRNA gene sequences significantly differed from each other and didn't form a separate genetic group.
K e y w o r d s : Anaplasmataceae family, Ehrlichia, Anaplasma bovis, Ixodid ticks, genetic variants
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
УДК 616.24=004-055.6/.7=06:616.9=022]=078
О.Л. Воронина1, М.Ю. Чернуха1, И.А. Шагинян1, М.С. Кунда1, Л.Р. Аветисян1, А.А. Орлова1, В.Г. Лунин1, Л.В. Авакян2, Н.И. Капранов3, Е.Л. Амелина 4, А.Г. Чучалин 4, А.Л. Гинцбург 1
ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОТИпОВ ШТАММОВ BURKHOLDERIA CEPACIA complex, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ БОЛьНЫХ В СТАЦИОНАРАХ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
1ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития России, Москва; 2ФГБУ РДКБ Минздравсоцразвития России, Москва; 3Медико-генетический научный центр РАМН, Москва; 4НИИ пульмонологии ФМБА России, Москва
88 кулыур микроорганизмов, отнесенных при первоначальной идентификации к Burkholderia cepacia complex (Bcc), проанализировано с помощью мультилокусного секвенирования (Multilocus Sequence Typing, MLST). Выявлено 13 генотипов (sequence type, ST), из них 9 (708, 709, 710, 711, 712, 714, 727, 728, 729) идентифицировано впервые. Обнаружено и зарегистрировано 2 новых аллеля для гена trpB (357, 358), по одному для генов atpD (306) и gltB (352). Установлено, что штаммы 2 генотипов (711, 712) относятся к виду B. multivorans, 1 (ST102) - B. contaminans, 1 (ST51) - B. stabilis, 1 (ST729) - B. vietnamiensis. Большинство штаммов выборки, представляющих 8 генотипов (208, 241, 728, 727, 708, 709, 710, 714), относятся к виду B. cenocepacia. Выявленные генотипы отличаются по глобальности распространения в мире: 4 генотипа (51, 102, 208, 241) имеют межконтинентальное распространение, 1 (712) - внутриконтинентальное. Показано, что штаммы, вызывающие внутрибольничные инфекции, в большинстве случаев относятся к генотипам 728 и 708. Эпидемически значимым в отношении больных муковисцидозом следует признать генотип 709, выявленный у штаммов, изолированных от больных в 7 федеральных округах (ФО) РФ. У больных Дальневосточного ФО выделены штаммы Bcc генотипов 241 (B. cenocepacia) и 729 (B. vietnamiensis), не характерных для других ФО РФ. Показана возможность инфицирования больного муковисцидозом штаммами двух генотипов 709 и 708, т.е. эпидемически значимым и вну-трибольничным. Продемонстрирована длительная персистенция штамма одного генотипа в организме больных муковисцидозом, как для Bcc вида B. cenocepacia (ST 709), так и вида B. multivorans (ST712). Прослежена возможность передачи штамма Bcc, характерного для внутрибольничной среды, больному муковисцидозом при оперативном вмешательстве.
Ключевые слова: муковисцидоз, Burkholderia cepacia complex, MLST
Муковисцидоз - кистозный фиброз (CF, cystic fibrosis), генетическое заболевание, описанное в 1938 г. [8], но упоминавшееся еще в древнем германском
эпосе. Многие события в истории и медицине, связанные с этим заболеванием, носят определение «первый». Первая древнейшая мутация в геноме человека, возникшая 11 000 - 52 000 лет назад, - мутация, которая обусловливает муковисцидоз (DF508 в гене cftr) [33]. Одно из первых применений антибиотика для лечения сопутствующей инфекции Staphylococcus aureus в 1943 г. - использование пенициллина, выделенного из партии, направлявшейся в американскую армию, для терапии детей с кистоз-ным фиброзом [13]. Первый опыт генозамещающей терапии посредством доставки кДНК гена cftr с помощью аденовирусных векторов или липосом был также связан с лечением муковисцидоза [12, 15]. Первый фонд, созданный на общественных началах для поддержки больных, - CF Foundation, образованный в США в 1955 г. В 1964 г. формируется аналогичный фонд в Великобритании - UK Cystic Fibrosis Research Trust. В 1960 г. начала работу Европейская рабочая группа по муковисцидозу - European Working Group on Cystic Fibrosis, в настоящее время именуемая European Cystic Fibrosis Society [47], а в 1965 г. создана международная ассоциация International Cystic Fibrosis (Mucoviscidosis) Association, переименованная в дальнейшем в CF Worldwide [46]. В России Всероссийская ассоциация для больных му-ковисцидозом (Общероссийская общественная организация) создана в 2010 г. [5]. Деятельность фондов позволила проводить исследовательскую работу, организовывать специализированные стационары, фо-
румы по обмену опытом, оплачивать дорогостоящее лечение и регистрацию больных.
Регистрация пациентов с муковисцидозом была разработана в 1964 г. W. Warwick из CF Foundation, что позволило отметить рост медианы выживаемости больных с 14 лет в 1968 г. до 20 лет в 1977 г. в США, а в Канаде в период 1985-1989 гг. до 36,7 лет у мужчин и до 27,8 у женщин [11]. В последние годы доля взрослых (18 лет и старше) среди больных муковисцидозом достигла 47% [45].
Коэффициент заболеваемости муковисцидозом находится в пределах от 1:25000 новорожденных в Финляндии, 1:3400 в США до 1:1800 новорожденных в Ирландии [31, 45]. В России по данным скрининга новорожденных он составляет от 1:2500 до 1:17000, в среднем 1:10 000 [3]. Общее количество больных муковисцидозом в мире Cystic Fibrosis Foundation оценивает примерно в 70 000 человек [35], в Европе - в 29 000 человек [16]. В России число людей с этим заболеванием составляет, по приблизительным оценкам Российского центра муковисцидоза, 6-8 000 человек, тогда как в Минздраве РФ зарегистрировано лишь 2186 больных [3].
Таким образом, в настоящее время сформировалось следующее представление о муковисцидозе: это одно из наиболее частых моногенных наследственных заболеваний с полиорганной патологией, требующее комплексного лечения в течение всей жизни больного. Увеличение продолжительности жизни людей с диагнозом муковисцидоз поставило перед врачами много новых задач. Одна из них - преодоление инфицирования микроорганизмами респираторного тракта больных. Эта проблема стоит очень остро, тем более что в 80% случаев смертность при муковисцидозе связана с заболеванием легких [11].
До 1950-х гг. основным микроорганизмом, инфицировавшим легкие больных муковисцидозом, считался Staphylococcus aureus [8]. В 1950-х гг. важнейшим патогенным микроорганизмом при CF признан Pseudomonas aeruginosa [30]. Буркхолдерии, выделенные у больных муковисцидозом в 1970-х гг. и называвшиеся ранее Pseudomonas cepacia, сразу стали ассоциироваться с ухудшением функции легких, бактериемией и более высокой смертностью. За первые 10 лет наблюдений количество выявленных случаев инфицирования буркхолдериями детей, больных му-ковисцидозом, увеличилось с 10 до 18%. Безусловно, эти значения существенно ниже тех, что были получены для Pseudomonas aeruginosa в этот же период (рост с 70 до 80%). Однако у больных, инфицированных буркхолдериями, наблюдалось более выраженное повреждение функции легких, чем у инфицированных Pseudomonas aeruginosa, и процент смертельных исходов также был выше и достигал 62% [24].
Буркхолдерии, открытые в 1950 г. Вальтером Бурк-холдером как патогенные микроорганизмы растений [10], получили свое нынешнее таксономическое положение только в 1993 г. [39]. В настоящее время оно следующее: Proteobacteria, Betaproteobacteria, Burk-holderiales, Burkholderiaceae, Burkholderia. По данным LPSN (List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature), род насчитывает 70 видов [48]. Из них 19 входят в Burkholderia cepacia complex (Bcc). Дифференциация видов внутри комплекса невозможна
на основе биохимических методов. Гетерогенность группы микроорганизмов, ранее называвшейся одним видом Burkholderia cepacia, побудила исследователей к поиску термина для определения геномных групп внутри вида. Таким термином, активно использовавшимся в отношении Bcc, был геномовар [38], заменивший в 1995 г. ранее употреблявшиеся разнообразные названия, как-то: геномовид, геномный вид, геномная группа [40]. Каждый геномовар нумеровали и обязательно определяли типовой штамм, поскольку идентификация геномовара неизвестного штамма могла быть проведена только в сравнительном исследовании.
Дальнейшему решению проблемы идентификации видов Bcc и штаммов способствовало развитие метода мультилокусного секвенирования (MLST, multi locus sequence typing). Первоначально метод был разработан M.C.J. Maiden и соавт. для задач молекулярной эпидемиологии [27]. Применение этого подхода к анализу таксономии Bcc позволило не только различить виды, входящие в комплекс, но и штаммы внутри одного вида. Первая схема, предложенная A. Baldwin и соавт. [9], позволила дифференцировать 17 видов. Ее развитием явилась схема MLST, разработанная T. Spilker и соавт. [36], предоставляющая возможность различать дополнительные виды, вошедшие в Bcc. Пороговым значением для дивергенции видов в составе Bcc является 3% отличий в нуклеотидном составе семи фрагментов генома, используемых в MLST [41].
В России исследование штаммов Burkholderia cepacia complex первоначально было связано с изучением неферментирующих бактерий, вызывающих госпитальные инфекции. На основе анализа 50 штаммов, выделенных в стационарах Москвы в 1999-2001 г. г., был разработан комплексный подход для исследования бактерий Burkholderia cepacia complex, включающий фенотипический и молекулярно-генетический анализ (амплификация фрагментов генов 16S и 23S rDNA, recA и генов ряда эпидемических маркеров) [1]. В выборке были обнаружены штаммы геномоваров I, III, IV и определена их эпидемическая значимость [6]. Разработанный подход был применен в дальнейшем для изучения микроорганизмов, выделенных от больных муковисцидозом. Было показано, что с увеличением возраста у больных формируются постоянные очаги хронической легочной инфекции: в возрастных группах 8-14 лет и старше у 100% пациентов выделяли микроорганизмы при обследовании дыхательных путей. У госпитализированных больных по сравнению с амбулаторными показано увеличение частоты выделения Bcc более чем в 7 раз [7].
Генотипирование штаммов Bcc, выделенных от российских больных муковисцидозом, а также коллекционных госпитальных штаммов, анализ распространения генотипов, их эпидемической значимости и сравнение полученных результатов с международными данными входило в задачу настоящего исследования.
Материалы и методы
Бактериальные штаммы. В анализе использовали 88 культур микроорганизмов из коллекции лаборатории молекулярной эпидемиологии госпитальных инфекции НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи. Внутрибольничные штаммы собирали с 1998 г.
в следующих стационарах: Москвы (ФГУ ГВКГ Минобороны России, ГКБ им. С.П. Боткина, ГКБ №7, ГКБ №15, ГКБ №61, НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН, ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России, НИИ СП им. Н.В. Склифосовского); Санкт-Петербурга (клиника военно-полевой хирургии Российской Военно-медицинской Академии им. С.М. Кирова); Краснодара (ГБУЗ «Краевая клиническая больница №1 им. профессора С.В. Очаповского» департамента здравоохранения Краснодарского края); Красноярска (ГКБ №7); Екатеринбурга (Областная детская клиническая больница N 1 (перинатальный центр)). Штаммы от больных муковисцидозом поступали из ФГБУ РДКБ Минздравсоцразвития России (отделение медицинской генетики), НИИ пульмонологии ФМБА России (отделение муковисцидоза), НИИ СП им. Н.В. Склифосовского (отделение пересадки почки и поджелудочной железы). Типовой штамм B. cenocepacia LMG 16656 получен из BCCM (Belgian coordinated collections of microorganisms).
Выделение культуры проводили посевом клинического материала (мокроты, мазка из зева и др.) на питательные среды Эндо, МакКонки (HiMedia, Индия), кровяной агар; чистую культуру буркхолдерий выделяли на BCSA (Burkholderia cepacia селективный агар), согласно методикам, описанным в [1, 4].
Выделение ДНК. После рассева культуры до колоний на плотной среде 1 колонию переносили в 20 мкл лизирующего буфера, содержащего 0,25% SDS и 0,05 M NaOH, прогревали 15 мин. при 950С и добавляли 180 мкл бидистиллированной воды. Полученный лизат хранили при 40С [36].
MLST. Для проведения мультилокусного секвенирования использовали модифицированную схему, позволяющую различать 19 видов буркхолдерий, входящих в Bcc [36]. Схема включает следующие мишени для амплификации: atpD - ß цепь ATP синтазы, gltB - большая субъединица глутамат синтазы, gyrB -субъединица B ДНК гиразы, recA - рекомбиназа А, lepA - GTP связывающий белок, phaC - ацетил-КоА редуктаза, trpB - субъединица B триптофан синтазы. Для амплификации ДНК использовали следующие реактивы: Hot rescue DNA pol 5 ед/мкл, ПЦР буфер 10х (лаб. молекулярной диагностики и генно-инженерных конструкций ВНИИ СБ РАСХН), dNTP 5 мМ ("Medigen"), прай-меры (НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи). Модифицированная нами программа амплификации была одинакова для всех мишеней: 950С - 10 мин, (950С - 30 с, 630С - 40 с, 720С - 1 мин) х 35, 720С - 5 мин.
Определение видовой принадлежности культур микроорганизмов других таксономических групп проводили на основе амплификации и секвенирования фрагмента гена 16S рибосо-мальной РНК (16S rDNA) с праймерами [20, 34].
Секвенирование фрагментов ДНК проводили на приборе 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems / Hitachi). Использовали наборы BigDye Terminator v 3.1 Cycle Sequencing. Режим амплификации выбирали согласно рекомендациям к прибору. Электрофорез продуктов реакции осуществляли в капиллярах длиной 50 см с полимером POP-7.
Анализ последовательностей и выравнивание выполняли с помощью программы CLUSTALW2 - Multiple Sequence Alignment [43]. Для определения аллельного профиля штаммов на основе секвенированных последовательностей 7 генов использовали программную базу сайта PubMLST [44]. Идентификацию последовательностей 16S rDNA культур микроорганизмов других таксономических групп проводили с применением геномной и программной базы BLAST.
Анализа данных мультилокусного секвенирования проводили, используя следующие пакеты программ SplitsTree [22], LIAN (Linkage analysis) [21], BURST [17], PHYLIP (the PHYLogeny Inference Package) [44], MEGA 5 [37].
Результаты и обсуждение
Генотипирование штаммов Bcc. Культуры микроорганизмов, предоставленные для анализа, были собраны в 14 стационарах страны с 1998 г. Исследо-
вание было ориентировано на изучение микрофлоры, осложняющей течение муковисцидоза, поэтому штаммы от больных муковисцидозом представлены в большем объеме (58 культур), чем внутрибольничные (30 культур). Собирая выборку культур буркхолдерий, мы постарались охватить максимальное количество регионов России, чтобы понять широту распространения эпидемически значимых штаммов, как госпитальных, так и осложняющих течение муковисцидо-за. Все штаммы, проанализированные в работе, были зарегистрированы в базе данных PubMLST (Burkhold-eris cepacia complex) под номерами (id) 1150-1153, 1155,1189-1268 [44].
Подход MLST позволил выявить следующие особенности выборки российских штаммов: для них характерны ранее не описанные аллели генов trpB (357, 358), atpD (306) и gltB (352) и 9 новых генотипов 708, 709, 710, 711, 712, 714, 727, 728, 729. Большинство штаммов выборки (92%), представляющих 8 генотипов (208, 241, 708, 709, 714, 728, 727, 710), относятся к виду B. cenocepacia, штаммы 2 генотипов (711, 712) - к виду B. multivorans, 1 (ST102) - B. contaminans, 1 (ST51) - B. stabilis, 1 (ST729) - B. vietnamiensis (см. рис.1).
Рассмотрим отдельно внутрибольничные штаммы и штаммы, осложняющие течение муковисцидоза.
Исследование группы внутрибольничных штаммов показало, что группа представлена 3 видами (B. cenocepacia, B. contaminans, B. stabilis) и 6 генотипами (708, 728, 727, 714, 102, 51), из которых 4 первых относятся к виду B. cenocepacia. Штаммы генотипов 728 и 708 преобладали среди Bcc, вызывавших госпитальные инфекции, тогда как штаммы генотипов 727, 714, 102 и 51 были представлены единичными случаями. С начала наблюдений в 1998 г. можно отметить чередование штаммов генотипов 728 и 708 в стационарах РФ. ST 728 определен у штаммов Bcc, выделенных в 1998 г. в больнице Красноярска, в 2004 г. - в стационарах Москвы и Екатеринбурга, в 2012 г. вновь в Москве. Внутрибольничные штаммы 1999-2001 гг. московского региона относились преимущественно к генотипу 708, который также выявлен в 2012 г., но уже у штамма B. cenocepacia, выделенного от больного муковисцидозом.
Группу штаммов от больных муковисцидозом, можно, в свою очередь, разделить на 2 подгруппы: штаммы, изолированные от детей, и культуры от взрослых. В выборке представлено только 8 штаммов от взрослых, причем 2 из них - от больных, у которых изолировали штаммы буркхолдерий и в детском возрасте. Таким образом, в этих парах мы могли проследить, происходит ли смена микроорганизма одного вида в развитии заболевания. Штаммов от детей преобладающее количество - 50. Штаммы были получены от больных в 2008 и 2012 гг.
В группе штаммов от больных муковисцидозом мы определили 4 вида: B. cenocepacia, B. multivorans, B. contaminans, B. vietnamiensis и 8 генотипов. Большинство штаммов - 41 (38 от детей и 3 от взрослых) относится к ST709 вида B. cenocepacia, 3 - к ST208, 3 - к ST241, 2 - к ST710, 1 - к ST708 того же вида; 2 -к ST712, 1 - к ST711 вида B. multivorans, 1 - к ST102 (B. contaminans), 1 - к ST729 (B. vietnamiensis). В этой группе выборки штаммы B. cenocepacia преобладали
Рис. 1. Филогенетическая сеть штаммов выборки культур бурк-холдерий, построенная на основе данных MLST с помощью пакета программ SplitsTree.
и составили 91%, на втором месте по частоте встречаемости - B. multivorans (5%). Преобладание B. cenocepacia среди штаммов Bcc, инфицирующих больных муковисцидозом, отмечают исследователи разных стран. При анализе выборки штаммов от больных муковисцидозом из европейских стран A. McDowell и соавт. показали, что штаммы B. cenocepacia составляли 79% [29]. По данным P. Drevinek и соавт., в США (1997-2004 гг.) и Франции (1995-2000 гг.) примерно в
равной степени среди больных муковисцидозом были распространены бактерии видов B. cenocepacia и B. multivorans. В Португалии (1995-2002 гг.) помимо двух названных видов значим вклад в патогенез заболевания B. stabilis [14].
Анализ распространения генотипов и их эпидемической значимости. Учитывая географическую протяженность нашей страны и различные природные условия в регионах, в выборку больных муковисцидо-зом включали пациентов, по возможности, представляющих различные федеральные округа (ФО) России. Взрослые пациенты в основном были из московского региона, лишь двое из Владимирской области и Татарстана. Дети представляли все ФО России, но не равномерно: преобладали пациенты из Центрального, Северо-Западного и Приволжского округов. С учетом неравномерности выборки отметим, что штаммы генотипа 709 были выделены у пациентов всех округов, кроме Дальневосточного (рис. 2). Штаммы генотипа 208 изолировали у больных из географически близких округов: Приволжского и Южного. Генотипы 241 и 729 определены только у штаммов от больных из Дальневосточного округа. Генотип 102 в этой части выборки -только у больного из Северо-Западного округа (см. рис. 2). Штамм 708 генотипа, ранее отмеченный как внутри-больничный, идентифицирован у больного муковис-цидозом из Татарстана наряду со штаммом эпидемически значимого генотипа 709. Причем штамм ST709 (GIMC4580:Bcn61Sm; id1229) характеризовался мелкими колониями, а штамм ST708 (GIMC4581:Bcn61L; id1245) - крупными. Известно, что длительно циркулирующие в организме человека Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa образуют малые колонии (small colony variants, SCV), кардинально меняющие метаболизм и иммуногенные свойства [28, 42]. Возможно, мы наблюдаем переход к SCV у B. cenocepacia. Таким образом, при инфицировании больного новым
Рис. 2. Распространение выявленных генотипов штаммов буркхолдерий по федеральным округам России.
микроорганизмом мы можем констатировать не замещение одного штамма другим, а одновременную пер-систенцию обоих. В случае длительного наблюдения за больными, сопровождавшегося мониторингом микроорганизмов в мокроте, мы также не наблюдали смены вида или генотипа микроорганизма, отягчающего течение муковисцидоза. В двух случаях пациенты наблюдались с детского возраста, и во взрослом состоянии у них были определены те же Bcc. В одном случае B. multivorans ST712 (GIMC4520:Bmv7554; id1153 - 2008 г., GIMC4523:Bmv138; id1189 - 2011 г.), в другом - B. cenocepacia ST709 (GIMC4521:Bcn7162; id1150 - 2008 г., GIMC4522:Bcn112; id1191 - 2011 г.).
Сопоставление генотипов Bcc внутрибольничных штаммов и штаммов, выделенных от больных муко-висцидозом, показывает, что B. contaminans ST102 может инфицировать обе группы больных: штамм GIMC4509:Bct370-id1264 вызвал госпитальную инфекцию в 2000 г., а штамм GIMC4543:Bct77-id1265 осложнил течение муковисцидоза у ребенка в 2012 г.
Для штамма генотипа 728, длительное время вызывавшего госпитальные инфекции в стационарах разного профиля, в 2012 г. была доказана возможность инфицирования как больного с идиопатическим легочным фиброзом, перенесшим двустороннюю трансплантацию легких (штамм GIMC4584:Bcn10761; id1256), так и пациента с муковисцидозом, которому была сделана аналогичная операция в том же стационаре по истечении 5 мес (штамм GIMC4586:Bcn4-6; id1257). Эти данные подтверждают возможность длительной циркуляции штаммов Bcc в стационаре.
Таким образом, по материалам, собранным в настоящее время, только о штаммах генотипа 709 мы можем говорить как об эпидемически значимых только для больных муковисцидозом.
Уточнение таксономического положения штаммов, не принадлежащих Bcc. Следует отметить, что возможности MLST позволяют дифференцировать Bcc и близкородственные бактерии, способные расти на селективной среде BCSA и практически не отличающиеся от Bcc по фенотипическим свойствам. Например, неферментирующие условно-патогенные микроорганизмы Achromobacter sp., относящиеся к порядку Bur-kholderiales, как и Bcc, но к иному семейству Alcaligen-aceae. Ранее эти микроорганизмы относились к группе pseudomonas-achromobacter и при идентификации могут быть перепутаны с видами Pseudomonas [23]. В эту же таксономическую группу прежде входили и буркхолде-рии. В нашей выборке 2 штамма, выделенные от больных муковисцидозом детей, были идентифицированы как Achromobacter sp. на основании анализа последовательности фрагментов генов 16S rDNA и gltB (локус в схеме MLST). Подчеркнем, что по данным F.A. Millar и соавт., Achromobacter sp. выделяют от больных муковисцидозом даже чаще, чем Bcc [32].
Сравнение полученных результатов с международными данными. Для более подробной молекулярно-генетической и эпидемической характеристики выборки штаммов Bcc мы сопоставили полученные данные с данными базы PubMLST.
В настоящее время в базе данных PubMLST находится 1268 штаммов Burkholderia cepacia complex (Bcc). Они собраны в 46 регионах мира. Наибольшим количеством штаммов представлены США, Италия,
Канада, Новая Зеландия. После регистрации проанализированных в настоящей работе штаммов Россия занимает 5 место в упомянутом списке. Источники выделения штаммов Bcc принято характеризовать следующим образом: больные муковисцидозом (cystic fibrosis, CF), больные не муковисцидозом (NON), больные хроническим гранулематозом (chronic granulomatous disease, CGD), промышленные предприятия (industrial, IND), окружающая среда (environment, ENV), внутрибольничная среда (environment of hospital, ENVH). Большинство штаммов базы данных PubMLST (52,9%) выделено от больных муковисцидозом, 27,7% - из окружающей среды, l3,4% - от больных c иным диагнозом. В небольшом количестве представлены штаммы индустриальные, из вну-трибольничной среды и от больных хроническим гранулематозом. Для зарегистрированных штаммов определено 729 генотипов (ST). Из них только для 44 ST известны штаммы, выделенные из источников разного характера. 26 ST представлены штаммами, изолированными как у больных муковисцидозом, так и больных с иными заболеваниями. 1S ST показывают связь больничных штаммов и выделенных из окружающей среды. У штаммов, собранных в базе данных, идентифицировано 19 видов Bcc: B. ambifaria, B. an-thina, B. arboris, B. cenocepacia, B. cepacia, B. contami-nans, B. diffusa, B. dolosa, B. lata, B. latens, B. mallei, B. metallica, B. multivorans, B. pseudomallei, B. pyrro-cinia, B. seminalis, B. stabilis, B. ubonensis, B. vietnam-iensis. Часть штаммов (7,0%) обозначена как Bcc без уточнения вида, часть (4,0%) как виды не Bcc. Среди идентифицированных видов лидирует B. cenocepacia (33,3%), на втором месте B. multivorans (1S,6%); B. vietnamiensis, B. contaminans, B. stabilis представлены 5,0-4,0% штаммов.
292 ST, т.е. 40,0% всех генотипов, характерны для штаммов, полученных от больных муковисци-дозом. Среди штаммов, осложняющих течение му-ковисцидоза, также лидируют представители вида B. cenocepacia (45,3%), на втором месте B. multivorans (27,4%), далее B. contaminans (5,S%), B. vietnamiensis (2,9%), B. stabilis (2,S%).
При анализе близкородственности генотипов, представленных в базе данных, с помощью программы BURST мы показали, что 729 ST образуют 94 группы разного размера. 51,4% генотипов не входят ни в одну из них, т.е. являются синглетонами. Самая большая по количеству генотипов группа ST234 включает 72 ST, т.е. 10% всех генотипов (рис. 3). Все они представляют штаммы вида B. cenocepacia. Группа ST319 включает 31 генотип (4%) штаммов B. vietnamiensis. Еще одна группа ST125 из 22 ST (3%) представлена штаммами B. cenocepacia. Группу ST63S образуют S ST штаммов B. anthina. Остальные группы малы по численности и представлены 2-6 генотипами. Проведенный анализ показывает, что наибольшее родство прослеживается среди генотипов штаммов B. cenocepacia, т.е. того вида, который чаще всего идентифицируют у буркхолде-рий, как осложняющих течение муковисцидоза, так и вызывающих внутрибольничные инфекции.
По данным базы PubMLST и нашим последним исследованиям штаммы 36 генотипов, относящихся к видам B. multivorans (15 ST), B. cenoceapacia (12 ST), B. stabilis (3 ST), B. vietnamiensis (2 ST), B. contaminans (2
Рис. 3. Диаграмма клонального комплекса 8Т234, построенная на основе eBURST анализа. Стрелками отмечены выявленные в данной работе генотипы.
ST), B. ambifaria (1 ST), B. diffusa (1 ST), имеют глобальное (31 ST) или внутриконтинентальное (5 ST) распространение. Наиболее известны из них ST28 и ST32 B. cenoceapacia, представляющие эпидемические линии.
Из 13 ST, идентифицированных в выборке российских штаммов, 4 генотипа (51, 102, 208, 241) имеют межконтинентальное распространение, 1 (712) - внутриконтинентальное (см. таблицу). Генотип 712 был зарегистрирован нами в мае 2012 г. для штамма B. mul-tivorans, изолированного от больного муковисцидозом, как в детском возрасте, так и через несколько лет, когда пациент стал взрослым. В августе штамм с ST 712 был обнаружен в Испании у больного с тем же диагнозом. Следует отметить, что штаммы впервые идентифици-
рованных генотипов 708, 709, 714, 728 по данным BURST анализа, относятся к группе ST234, т. е. являются генетически близкими эпидемическим линиям ST28 и ST32 и штаммам ST 208, 241, имеющим глобальное распространение (см. рис.3).
Нами был также охарактеризован штамм B. cenocepacia LMG 16656, полученный из BCCM (GIMC4526:Bcn3A; id1268). Штамм выделен в 1989 г. от больного муко-висцидозом и является референсным для эпидемической линии ET12. Идентифицированный нами генотип штамма - 28. Следует отметить, что при анализе в MLST эпидемическая линия ET12, однородная по данным RAPD (random amplification of polymorphic DNA), была разделена на 5 ST, из них только ST28 представляет клон, ответственный за межконтинентальное распространение (Канада, США, Великобритания и Новая Зеландия) [14].
Таким образом, из 13 охарактеризованных генотипов российских штаммов 6, относящихся к виду B. cenocepacia, входят в группу штаммов ST234 (см. рис. 3), которая, в свою очередь, состоит из 6 подгрупп. В подгруппе ST234 наиболее близкородственен клонообразующему генотипу ST241, он отличается только по одной мишени аллельного профиля (SLV, single locus variation). По двум локусам отличается генотип 708, располагающийся во внешней окружности (double locus variation, DLV), и также по двум локусам, но другим отличается ST728 (DLV). К подгруппе ST32 относятся генотипы 714 (SLV) и 208 (DLV). К подгруппе ST248 отнесен один генотип - 709 (SLV). Чтобы понять, как реализуется такое разнообразие генотипов при трансляции, мы проанализировали последовательности локусов, входящих в схему MLST, с помощью MEGA 5. Суммарный размер семи сцепленных последовательностей составил 2773 п.н. При трансляции каждый ло-кус анализировали независимо, учитывая рамку считывания. По сравнению с последовательностью наиболее распространенного генотипа 32 у упомянутых генотипов группы ST234 выявлено от 1 (ST208) до 3 (ST708) несинонимичных замен, причем все они на основании оценки физико-химической дистанции по R. Grantham [19] приводят к консервативным мутациям в белковых последовательностях. Таким образом, в группе из 72 разнообразных ST в генах, используемых для анализа, не накоплено радикальных мутаций, однако штаммы столь сходных генотипов могут существенно различаться по вирулентности. Например, у пациентов с муко-висцидозом, инфицированных штаммом Czech (ST32),
процент выживших через 5 лет составил 91,4%, а у инфицированных B. cenocepacia ET-12 (ST28) - только 66,6%, даже меньше, чем для пациентов с Pseudomonas aeruginosa (85,3%) [25].
Два других генотипа, принадлежащих виду B. ceno-cepacia, ST710 и ST727, существенно отличаются от шести ST того же вида, описанных выше. Например, в проанализированной последовательности в 2773 п.н. ST710 имеет 55-60 замен по сравнению с генотипами группы ST234, из которых 12 несинонимичных, но только 1 из них приводит к радикальной мутации в белке. Как видно из рис. 1, ST710 и ST727 образуют обособленные ветви на древе, построенном в программе SplitsTree. Между собой они сходны только по одному локусу аллельного профиля (recA). ST727 входит в группу ST125, а ST710 является синглетоном.
Остальные генотипы относятся к иным видам Bcc. Генотипы этих видов имеют 100-180 замен в проанализированной последовательности по срав-
нению с генотипами группы ST234. Из них несинонимичными являются 12 для ST102 B. contaminans, 31 для ST729 B. vietnamiensis, 29 для ST51 B. stabilis, по 31 для ST711 и 712 B. multivorans. Наибольшее эволюционное отличие от генотипов B. cenocepacia наблюдается у ST B. multivorans, поскольку 10 мутаций из упомянутых являются радикальными. У генотипа 102 B. contaminans все замены приводят к консервативным мутациям, а у ST729 B. vietnamiensis и ST51 B. stabilis 8 и 7 замен, соответственно, реализуются в радикальные мутации в белках. Причем, если в генотипах B. multivorans наибольшее количество неконсервативных мутаций сосредоточено в субъединице B ДНК гиразы, то у ST51 B. stabilis - в GTP-связывающем белке, что подчеркивает видовые особенности генотипов.
Таким образом, к генотипам, наиболее часто встречающимся в России у госпитальных штаммов буркхолдерий, а также штаммов, отягчающих те-
Таблица
Характеристика и распространение штаммов выявленных генотипов
ST BURST Источник Год выделения Страна или континент Штаммы в PubMLST
группа подгруппа
709 234 248 МВ 2008, 2011, 2012 РФ 41
208 234 32 МВ 1997, 2001 США 2
МВ 2012 РФ 3
241 234 234 МВ 1995, 2000 Канада (1), США (2) 3
МВ 2012 РФ 2
ХГМ Не позднее 2007 США 1
ИД 1999 США 1
ИНД 2003 Северная Америка 1
710 Синглетон МВ 2012 РФ 2
711 Синглетон МВ 2012 РФ 1
712 Синглетон МВ 2008, 2012 РФ 2
МВ 2012 Испания 1
102 Синглетон МВ 1999, 2000, 2008, 2010, не позднее 2007 Чешская Республика (3), Бельгия, Австрия, Италия, США (4) 10
МВ 2012 РФ 1
ИД 1999 РФ 1
ИД Не позднее 2007, 2004 Бразилия, США 2
ОС 2004, не позднее 2007 Саргассово море (1), Испания (1) 2
708 234 234 ИД 1999-2001 РФ 15
МВ 2012 РФ 1
728 234 234 МВ 2012 РФ 1
ИД 1998, 2004, 2012 РФ 9
714 234 32 ИД 2003 РФ 1
51 51 МВ 1993, 2006 Бельгия, Чешская Республика 2
ИД 1993, не позднее 2007 Швеция, Новая Зеландия (2) 3
ИД 1998 РФ 1
ВБС 1980, не позднее 2007 США 2
727 729
125 59
125
ИНД ИД МВ
Не позднее 2007 2002, 2003 2012
США РФ РФ
Примечание. МВ - муковисцидоз, ИД - иной диагноз, ОС - окружающая среда, ВБС - внутрибольничная среда, ИНД - индустриальный, ХГМ - хронический гранулематоз.
чение муковисцидоза, следует отнести ST 708, 728, 709, т.е. генотипы, генетически близкие основным эпидемическим линиям: ST28 и ST32. Однако в силу географического и этнического разнообразия в РФ выделяются районы, отличающиеся и по эпидемическим характеристикам. Например, в упомянутом выше Дальневосточном ФО не только иные генотипы буркхолдерий определены у штаммов, осложнявших течение муковисцидоза у детей (ST241 и ST729), но и частота встречаемости этого заболевания выше, чем в среднем по России и составляет 1:6816 человек [2].
В заключении следует отметить, что, несмотря на то что в настоящем исследовании выявлено 9 новых генотипов Bcc (708, 709, 710, 711, 712, 714, 727, 728, 729), для большинства из них установлено клональное сходство с известными ST. Так ST708, 709, 714, 728 входят в группу ST234, включающую 72 генотипа, в том числе эпидемически значимые. ST727 имеет SLV в гене lepA по сравнению с ST414, входящим в группу ST125 и выявленным в Новой Зеландии. ST729 отличается лишь по алле-лю гена gltB от генотипа 59, идентифицированного в Канаде. Только ST710 не имеет аналогов в базе данных PubMLST. Обнаружение в выборке Bcc, выделенных от российских больных, штаммов с ST 208, 241, 102, 51 (см. таблицу) подтверждает возможность межконтинентального распространения буркхолдерий.
Трансмиссивность - одна из особенностей бактерий Bcc. Сведения о перекрестной инфекции среди пациентов стали поступать с момента идентификации буркхолдерий у больных муковисцидозом, но убедительные доказательства были получены в 1990-е гг. с развитием методов амплификации ДНК, позволивших доказать идентичность штаммов, выделенных от разных пациентов [26]. Способность к внутрибольнично-му распространению была показана, прежде всего, для штаммов B. cenocepacia группы ST234. A. Graindorge и соавт. подтвердили таким образом эпидемическую значимость штаммов ST 32 [18]. Применение MLST позволило доказать трансмиссивность штаммов генотипа 709, входящего в эту же клональную группу, среди больных муковисцидозом в России. Штаммы этого ST только в последние годы выделяли от детей с 5 лет и старше и от взрослых, в том числе от одного пациента с летальным исходом. Дальнейший полногеномный анализ может дать объяснение повышенной вирулентности штаммов этого генотипа.
Сведения об авторах:
ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздравсоц-развития России, Москва
Воронина Ольга Львовна - канд. биол. наук, доц, вед. науч. сотр., зав. лаб., e-mail: kirolg3@newmail.ru
Чернуха Марина Юрьевна - д-р мед. наук, вед. науч. сотр.
Шагинян Игорь Андроникович - д-р мед. наук, вед. науч. сотр., зав. лаб.
Кунда Марина Сергеевна - канд. биол. наук, ст. науч. сотр.
Аветисян Лусине Руальдовна - канд. мед. наук, ст. науч. сотр.
Орлова Анна Александровна - студент, лаб.-исслед.
Лунин Владимир Глебович - д-р биол. наук, вед. науч. сотр., зав. лаб.
Гинцбург Александр Леонидович - д-р биол. наук, проф., академик РАМН, директор ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития России
ФГБУ РДКБ Минздравсоцразвития России
Авакян Лусине Вааговна - врач-педиатр
Медико-генетический научный центр РАМН, Москва
Капранов Николай Иванович - д-р мед. наук, проф., засл. деят. науки, рук. научно-клинического отдела муковисцидоза
НИИ пульмонологии ФМБА России, Москва
Амелина Елена Львовна - канд. мед. наук, зав. лаб. муковисцидоза
Чучалин Александр Григорьевич - д-р мед. наук, проф., академик РАМН, директор НИИ пульмонологии ФМБА России
ЛИТЕРАТУРА
1. Алексеева Г.В., Чернуха М.В., Шагинян И.А. В кн.: Гинцбург А.Л., Романова Ю.М., ред. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ее применение в бактериологии. Учебно-методическое пособие для врачей-бактериологов. М., 2006: 117-126. 2 Васильева Т.Г., Шишацкая С.Н., Павлова Я.Е. В кн.: Муковис-цидоз в России (20 лет Российскому центру муковисцидоза): По материалам X национального конгресса «Муковисцидоз у детей и взрослых». 1-2 июня 2011; г. Ярославль: 94-97.
3. Капранов Н.И. В кн.: Муковисцидоз в России (20 лет Российскому центру муковисцидоза). По материалам X национального конгресса «Муковисцидоз у детей и взрослых». 1-2 июня 2011; г. Ярославль:12-15.
4. Методические указания по применению унифицированных микробиологических (бактериологических) методов исследования в клинико-диагностических лабораториях. Приложение №1 к приказу Министерства здравоохранения СССР №535 от 22.04.1985
5. Официальный сайт Всероссийской ассоциации для больных муковисцидозом (Общероссийской общественной организации) URL: http://mukoviscidoz.org/08.10.2012)
6. ЧернухаМ.Ю., Алексеева Г.В., Шагинян И.А. и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии 2005;6:46-51.
7. ШагинянИ.А., КапрановН.И., ЧернухаМ.Ю. и др. В кн.: Муковисцидоз в России (20 лет Российскому центру муковисцидоза). По материалам X национального конгресса «Муковисцидоз у детей и взрослых». 1-2 июня 2011, г. Ярославль:64-71.
8. AndersenD.H. Am. J. Dis. Child. 1938;56: 344-399.
9. Baldwin A., Mahenthiralingam E., Thickett K.M. et al. J. Clin. Microbiol. 2005;43: 4665-4673.
10. Burkholder W. Phytopathology. 1950; 64:468-475.
11. Corey M, Farewell V. Am. J. Epidemiol. 1996; 143 (10): 10071017.
12. Davies J.C., Geddes D.M., Alton E.W. J. Gene Med. 2001; 3: 409417.
13. Di Sant'Agnese P.E.A., Andersen D.H. Am. J. Dis. Child. 1946; 72: 17-61.
14. DrevinekP., MahenthiralingamE. Clin. Microbiol. Infect. 2010; 16: 821-830.
15. Drumm M.L., Pope H.A., Cliff W.H. et al. Cell. 1990; 62: 12271233.
16. FarrellP.M. J. Cyst. Fibros. 2008; 7 (5): 450-453.
17. FeilE.J., HolmesE.C., BessenD.E. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001; 98: 182-187.
18. Graindorge A., Menard A., Neto M. et al. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2010; 66: 29-40.
19. GranthamR. Science. 1974; 185 (4154): 862-864.
20. Guan L. L., Hagen K. E., Tannock G. W. et al. Appl. Environ. Microbiol. 2003; 69: 6750-6757.
21. HauboldB, Hudson R.R. Bioinformatics. 2000; 16 (9): 847-8.
22. Huson D.H. Bioinformatics. 1998; 14 (1): 68-73.
23. Igra-Siegman Y., ChmelH., Cobbs C. J Clin Microbiol. 1980; 11(2):
141-145.
24. Isles A., Maclusky I., Corey M. J. Pediatr. 1984;104 (2):206-210.
25. Jones A.M., DoddM.E., Govan J.R. et al. Thorax. 2004;59: 948951.
26. Li Puma J.J., Dasen S.E., Nielson D.W. et al. Lancet. 1990; 336 (8723): 1094-1096.
27. Maiden M.C.J., Bygraves J.A., Feil E. et al. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 1998; 95 (6): 3140-3145.
28. McAdam P.R., Holmes A., Templeton K.E. et al. PLoS One. 2011; 6 (9): e24301.
29. McDowell A., Mahenthiralingam E., Dunbar K. E. // J. Med. Microbiol. - 2004. - Vol. 53. - P. 663-668.
30. MearnsM.B., Hunt G.H., Rushworth R. // Arch. Dis. Child. - 1972.
- Vol. 47. - P. 902-907.
31. Mehta G, MacekM Jr, MehtaA; European Registry Working Group et al. // J. Cyst. Fibros. - 2010. - Vol. 9, Suppl 2 - :P. S5-S21.
32. MillarF.A., SimmondsN.J., HodsonM.E. // J.Cyst.Fibros. - 2009. -Vol. 8. - P. 286-391.
33. Morral N, Bertranpetit J., EstivillX. et al. // Nat. Genet. - 1994. -Vol. 7. - P. 169-175.
34. Naser S. M., Hagen K. E., Vancanneyt M. et al. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. - 2006. - Vol. 56. - P. 355-360.
35. Patient registry: 2008 annual data report to the Center directors. Bethesda, MD: Cystic Fibrosis Foundation; 2009
36. Spilker T., Baldwin A., Bumford A. et al. // J. Clin. Microbiol. - 2009.
- Vol. 47, N 8. - P. 2607-2610.
37. Tamura K., Peterson D., Peterson N. et al. // Mol. Biol. Evol. - 2011.
- Vol. 28. - P. 2731-2739.
38. Ursing J.B., Rossello-Mora R.A., Garcia-Valdes E. et al. // Int. J. Syst. Bacteriol. - 1995. - Vol. 45. - P. 604.
39. Validation list N° 45. // Int. J. Syst. Bacteriol. - 1993. - Vol. 43. - P. 398-399.
40. Vandamme P., Holmes B., VancanneytM. et al. // Int. J. Syst. Bacteriol. - 1997. -Vol. 47. - P. 1188-1200.
41. Vandamme P., Dawyndt P. // Syst. Appl. Microbiol. - 2011. - Vol. 34. - P. 87-95.
42. Wei Q., Tarighi S., Dötsch A. et al. // PLoS One. - 2011. - Vol. 6, N 12. - P. e29276.
43. The Main Site EMBL-EBI, European Bioinformatics Institute (URL:http://www.ebi.ac.uk 08-10-2012)
44. The Main Site PubMLST of the Faculty of Zoology, Oxford University, Great Britain (URL:http://pubmlst.org 08.10.2012)
45. The Main Site Cystic Fibrosis Foundation (CFF) (URL:http://www. cff.org/ 08.10.2012)
46. The Main Site Cystic Fibrosis Worldwide (CFW) (URL:http://www. cfww.org/ 08.10.2012
47. The Main Site European Cystic Fibrosis Society (URL: http://www. ecfs.eu/08.10.2012)
48. Web site of the Society for Systematic and Veterinary Bacteriology: (URL:http://www.bacterio.cict.fr 08.10.2012)
characterization of genotypes for
BURKHOLDERIA CEPACIA CoMPLEx strains
isolated from patients in hospitals of Russian federation
O.L. Voronina', M.Yu. Chernukha', I.A. Shaginyan', M.S. Kunda',
L.R. Avetisyan', AA. Orlova', V.G. Lunin', L.V. Avakyan2, N.I. Kapranov3, E.L. Amelina4, A.G. Chuchalin 4, A.L. Gintsburg '
1 Gamaleya Scientifc Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Ministry of Health and Social Development of the Russian Federation, Moscow, Russia; 2 Russian Children's Clinical Hospital Ministry of Health and Social Development of the Russian Federation, Moscow, Russia; 3 Research Centre of Medical Genetics RAMS, Moscow, Russia; 4 Research Institute of Pulmonology FMBA of Russia, Moscow, Russia
88 cultures of microorganisms referred to the Burkholderia cepacia complex (Bcc) during initial identification were analyzed by multilocus sequencing (Multilocus Sequence Typing, MLST). 13 genotypes (sequence type, ST) were detected, 9 of them (708, 709, 710, 711, 712, 714, 727, 728, 729) were identified for the first time. Two new alleles for the gene trpB (357, 358), one of the genes atpD (306) and gltB (352) were detected and registered. It was found that strains of 2 genotypes (711, 712) belong to the species B. multivorans, 1 (ST102)
- B. contaminans, 1 (ST51) - B. stabilis, 1 (ST729) - B. vietnamiensis. Most strains of the sample, representing 8 genotypes (208, 241, 728, 727, 708, 709, 710, 714), belong to the species B. cenocepacia. Identified genotypes differ in the global spread of the world: 4 genotype (51, 102, 208, 241) have intercontinental distribution, 1 (712) - intra. It is shown that strains causing nosocomial infections, in most cases refer to genotypes 728 and 708. Epidemiologically significant in respect of patients with cystic fibrosis should recognize genotype 709, detected in strains isolated from patients in seven federal districts (FD) of Russia. The Bcc strains of genotypes 241 (B. cenocepacia) and 729 (B. vietnamiensis) were isolated from the patients of the Far Eastern FD. They are not typical for other FD Russia. The possibility of concomitant infection in cystic fibrosis patient with two genotypes 709
- epidemiologically significant and 708 - nosocomial, was indicated. The long-term persistence of a single genotype strain in the organism of patients with cystic fibrosis was demonstrated as for Bcc species B. cenocepacia (ST 709), so for B. multivorans (ST712). The possibility of transferring the strain Bcc, typical for nosocomial environment to patient with cystic fibrosis at surgery was observed.
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
Aylin DOGEN1, Engin Kaplan1, Mehmet Sami Serin1, Zehra Oksuz1, Seda Tezcan2, Gonul Asian2,
Orhan Sezgin3, Engin Altintas3, Gurol Emekdas2
detection of hepatitis B virus x GENE AND pREC promoter MUTATioNs from chronic hepatitis b patients in the south of turkey
1Mersin University, Faculty of Pharmacy, Dept. Pharmaceutical Microbiology, Mersin, TURKIYE; 2Mersin University, Faculty of Medicine, Dept. Medical Microbiology, Mersin, TURKIYE; 3Mersin University, Faculty of Medicine, Dept. Gastroenterology,
Mersin, TURKIYE
Hepatitis B virus (HBV) infection is a global health problem with more than 2 billion infected individuals. HBV infection leads to diverse outcomes ranging from acute to chronic hepatitis, which may result in severe complications as liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). HBV is one of the most important human DNA viruses having strong oncogenic potential. Recently, many studies have reported on HBV X gene and PreC promoter mutations associated with HCC.
In order to detect the prevalence of HBx gene and PreC promoter mutations possibly related to HCC, we have analyzed sera samples collected from 61 patients with chronic hepatitis B. We have detected T1653 mutation in 1 of 61 (1,63%), A1896 mutation in 10 of 61 (16,39%), and T1762 - A1764 dual mutation in 4 of 61 (6,55%). T1653 and T1762 - A1764 dual mutations were suggested significantly related to HCC in earlier reported studies. Our findings demonstrate that HBx gene and PreC promoter mutations related to HCC are present in our region and prospective clinical chord studies would be useful for better patient management and of early diagnosis of possible HCC cases.
Key words: Hepatitis B virus, Chronic Hepatitis B, X gene mutations, PreC promoter mutations, Hepatocellular Carcinoma
Hepatitis B virus (HBV) infection is a health problem threatening people living all over the world. HBV infection leads to a wide spectrum of liver disease ranging from acute to chronic hepatitis, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma [1]. More than two billion people are infected with HBV around the world. Of these 350 million people are chronically infected with HBV and one million deaths occur each year due to active hepatitis, cirrhosis or primary liver cancer [2]. HBV, liver cirrhosis, exposure to aflatoxin Bl, alcohol consumption, and diabetes have etiological roles in development of hepatocellular carcinoma (HCC) [3]. Among these, HBV is the major risk factor for HCC and associated with more than 50% of cases of HCC [4].
HBV genome contains overlapping open reading frames
