CC BY
142
микробиология
14. Ярилин А.А. Межклеточная кооперация при иммунном ответе. Выбор клеткой формы ответа. Иммунология. 1999; 1: 17-24.
15. DaileyM.O. Expression of T-lymphocyte adhesion molecules regulation during antigen-induced T-cell activation and differentiation. J. Immunol. 1998; 18: 153-84.
16. Kanegane H. Expression of L-selectin (CD62L) discriminates Th1 and Th2 like cytokine-producing memory CD4 T-cell. J. Immunol. 1996; 18: 186-90.
17. Kruse C., VarmingK., Christiansen O.B. Prospective, serial investigations of in vitro lymphocyte cytokine production, CD62L expression and proliferative response to microbial antigens in women with recurrent miscarriase. Human Reproduction. 2003; 18 (11): 2465-72.
18. Van Wely C.A. Expression of L-selectin on Th1-cell is regulated by IL-12. J. Immunol. 1999; 163: 1214-21.
REFERENCES
1. Galaktionov V.G. Immunology: a textbook for students: 3rd ed. Moscow: Akademiya; 2004 (in Russian).
2. Glants S. Biomedical statistics: translation from English. Moscow: Praktika; 1999 (in Russian).
3. MU 3.1.7.1 189-03. Prevention and laboratory diagnosis of brucellosis in humans: approved by Chief state sanitary doctor of the Russian Federation 30.01.03: enacted 1.5.03. Information and legal support for by GarantClient (in Russian).
4. MU 3.1.2007-05. Epidemiological surveillance of tularemia: approved by Chief state sanitary doctor of the Russian Federation 09.09.05: enacted 9.9.05. Information and legal support for by GarantClient (in Russian).
5. Naykhin A.N., Koren'kov D.A., Petuhova G.D. Evaluation of T-cell immunological memory for the expression of CD45 molecules in persons vaccinated with live reassortant influenza vaccine. Meditsin-skaya immunologiya. 2008; 10 (6): 535-42 (in Russian).
6. Government Decree of July 15, 1999 N 825 "On approval of the list of work fulfillment of which is associated with a high risk of infectious disease, and requires mandatory vaccinations": information and legal support for by GarantClient (in Russian).
7. RoytA., Brostoff Dzh., MeylD. Immunology: translation from English: 5th ed. Moscow; 2000 (in Russian).
8. Onishchenko G.G., Cherkasskiy B.L., eds. Sanitary rules and guidance documents: in 2 volumes. Moscow; 2006 (in Russian).
9. Sanitary Rules. Working safely with microorganisms I—II pathogenicity groups (hazard): JV 1.3.1285-03: approved by Chief state sanitary doctor of the Russian Federation 12.03.03: enacted 6.25.03: Information and legal support for by GarantClient (in Russian).
10. Smol'kovaE.A. Influence of bacteria Yersinia pestis, Francisella tular-ensis and their antigens on the expression of Toll-like receptors (TLR2, TLR4) with cells of the innate and adaptive immunity: abstract dis. ... candidate of medical sciences. Saratov; 2012 (in Russian).
11. Toptygina A.P. T-cell memory. Immunologija. 2008; 5: 311-7 (in Russian).
12. Khaydukov S.V. Multicolor flow cytometry analysis for medical and biological researches: Dis. ... doctor boil. science. St. Petersburg; 2008 (in Russian).
13. SchchukovskayaT.N., Smol'kovaE.A., Shmel'kova T.P. Induced production of INF-y and IL-4 as an indicator of the functional activity of Th-1 and Th-2 cells of people vaccinated against plague. Epidemiologija I vakcinoprofilaktika. 2011; 61 (6): 78-83 (in Russian).
14. YarilinA.A. Intercellular cooperation in the immune response. Choosing a cell reply form. Immunologija. 1999; 1: 17-24 (in Russian).
15. Dailey M.O. Expression of T-lymphocyte adhesion molecules regulation during antigen-induced T-cell activation and differentiation. J. Immunol. 1998; 18: 153-84.
16. Kanegane H. Expression of L-selectin (CD62L) discriminates Th1 and Th2 like cytokine-producing memory CD4 T cell. J. Immunol. 1996; 18: 186-90.
17. Kruse C., VarmingK., Christiansen O.B. Prospective, serial investigations of in vitro lymphocyte cytokine production, CD 62L expression and proliferative response to microbial antigens in women with recurrent miscarriase. Human Reproduction. 2003; 18 (11): 2465-72.
18. Van Wely C.A. Expression of L-selectin on Th1 cell is regulated by IL-12. J. Immunol. 1999; 163: 1214-21.
Поступила 24.01.13
микробиология
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДк 616.24-004-078
О.Л. Воронина1, м.С. Кунда1, Е.И. Аксенова1, А.А. Орлова1, м.ю. Чернуха1, В.Г. Лунин1, Е.Л. Амелина 2, А.Г. Чучалин2, А.Л. Гинцбург1
экспресс-диагностика микроорганизмов, поражающих дыхательные пути Больных муковисцидозом
1фГБУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.ф. Гамалеи минздрава России, 123098, москва; 2НИИ пульмонологии фмБА России, 105077, москва
Близкородственные бактерии Burkholderia cepacia complex (Bcc) и Achromobacter sp. инфицируют респираторный тракт больных муковисцидозом, вызывая нарушения дыхательной проходимости. Bcc отличает трансмиссивность и высокая летальность пациентов, зараженных буркхолдериями, поэтому дифференциация этих фенотипически сходных микроорганизмов представляется важной задачей. Разработанный экспресс-метод диагностики включает выделение ДНк из мокроты, амплификацию и секвенирование фрагментов генов recA, gltB, gyrB, 16S rDNA. Оценка продуктов амплификации генов recA, gltB позволяет дифференцировать Bcc и Achromobacter sp. При анализе последовательностей генов recA, gltB, gyrB был установлен генотип Bcc на основе базы данных аллельных профилей штаммов Bcc, циркулирующих в Рф. По последовательности гена 16S rDNA можно определить таксономическое положение доминирующего в мокроте микроорганизма, не принадлежащего Bcc или Achromobacter sp. ПЦР в реальном времени в присутствии интеркалирую-щего красителя Sybr Green I, DMSO и D(+)-трегалозы позволяет дифференцировать Bcc от других микроорганизмов, инфицирующих респираторный тракт больных муковисцидозом, дополнительно сократить время диагностики и снизить вероятность контаминации.
Ключевые слова: Burkholderia cepacia complex, Achromobacter sp., экспресс-диагностика
O.L. Voronina, M.S. Kunda, E.I. Aksenova, A.A. Orlova, M.Yu. Tchernukha, KG. Lunin, E.L. Amelina, A.G. Tchutchalin, A.L. Ginzburg
THE EXPRESS DIAGNOSTIC OF MICROORGANISMS AFFECTING RESPIRATORY TRACT OF PATIENTS WITH MUCOVISCIDOSIS
The N.F. Gamaleya research institute of epidemiology and microbiology of Minzdrav of Russia, 123098 Moscow, Russia
The research institute of pulmonology of the Federal medical biological agency of Russia, 105077 Moscow, Russia
The .shared bacteria Burkholderia capacia complex and Achromobacter sp. infect the respiratory tract of patients with mucoviscidosis brining on disorders of respiratory patency. Burkholderia capacia complex is characterized by transmissivity and higher lethality of patients infected by Burkholderia. Hence, the importance of differentiation of these phenotypically similar microorganisms is obvious. The developed express technique of diagnostic includes the separation of DNA from phlegm amplification and sequenation ^a fragments of genes recA, gltB, gyrB, 16S rDNA. The evaluation of products of amplification of genes recA, gltB makes it possible to differentiate Burkholderia capacia complex and Achromobacter sp. The analysis of successions of recA, gltB, gyrB makes it possible to identify genotype of Burkholderia capacia complex on the basis of data of allele profiles of strains of Burkholderia capacia complex circulating in Russia. The succession of gene 16S rDNA makes it possible to determine the taxonomic position of microorganism dominating in phlegm and not belonging to Burkholderia capacia complex or Achromobacter sp. The real time polymerase chain reaction in presence of intercalating dye Sybr Green I, DMSO and D(+)-trehalose makes it possible to differentiate Burkholderia capacia complex from other microorganisms infecting respiratory tract ofpatients with mucoviscidosis. This approach provides additional reduction of diagnostic duration and decrease possibility of contamination.
Key words: Burkholderia capacia complex, Achromobacter sp., express diagnostic
Введение. Муковисцидоз - кистозный фиброз (CF - cystic fibrosis) - органное генетическое заболевание. Благодаря комплексному подходу к его лечению, продолжительность жизни больных неуклонно возрастает. В последние годы доля взрослых (18 лет и старше) среди больных муковисцидо-зом достигла 47% в странах Евросоюза [1], но пока еще ниже в России. Однако микроорганизмы, инфицирующие респираторный тракт пациента, осложняют течение CF. В 80% случаев смертность при муковисцидозе связана с заболеванием легких [2]. Важнейшими патогенным микроорганизмами при CF признаны Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus [3]. Буркхолдерии видов, входящих в Burkholderia cepacia complex (Bcc), выявляют реже [3]. У больных, инфицированных Bcc, наблюдается более выраженное повреждение функции легких, чем у инфицированных Pseudomonas aeruginosa, и процент смертельных исходов также выше и достигает 62% по данным A. Isles и соавт. [4]. Особенно показательно сравнение пятилетней выживаемости: 85,3% у больных, инфицированных Pseudomonas aeruginosa, и только 66,6% у пациентов с B. cenocepacia ET-12 [5]. Другая особенность Bcc - трансмиссивность. Убедительные доказательства перекрестной инфекции среди больных муковисцидозом получены в 1990-е годы с развитием методов амплификации ДНК, позволивших доказать идентичность штаммов, выделенных от разных пациентов [6]. Бактерии рода Achromobacter, в основном Achromobacter xylosoxydans, встречаются чаще, но менее опасны для больных CF. Поскольку A. xylosoxydans относятся к неферментирующим бактериям, способным расти на селективной среде для буркхолдерий, отличить их от Bcc по фенотипическим признакам очень сложно [7]. Таксономическая близость A. xylosoxydans и Bcc (бактерии относятся к одному порядку Burkholderiales) затрудняет выбор мишени для молекулярно-генетического анализа. Работа, проведенная ранее по идентификации штаммов Bcc, циркулирующих на территории РФ [8], позволила создать базу аллельных профилей штаммов и предложить стратегию дифференциации Bcc и A. xylosoxydans. Настоящее исследование посвящено разработке метода экспресс-диагностики микроорганизмов, инфицирующих респираторный тракт больных муковисци-дозом.
Для корреспонденции:
Воронина Ольга Львовна, канд. биол. наук, доц., вед. науч. сотр., зав. лаб.
Адрес: 123098, Москва, ул. Гамалеи, 18 E-mail: kirolg3@newmail.ru
Материалы и методы. Использовали 12 образцов мокроты больных муковисцидозом; 6 культур микроорганизмов, выросших при рассеве мокроты на селективной среде для буркхолдерий: BCSA (Burkholderia cepacia селективный агар): GIMC4951:Ach4, GIMC4952:Ach8, GIMC4953:Ach188, GIMC4954:Ach219, GIMC4955:Ach239, GIMC4956:Ach248; ДНК штаммов B. vietnamiensis GIMC4583:Bvt155, B. stabilis GIMC4542:Bst908, B. multivorans GIMC4523:Bmv138, B. contaminons GIMC4509:Bct370, B. cenocepacia GIMC4546:Bcn5, Pseudomonas aeroginosa GIMC5001:PAT-23.
Выделение ДНК. Из микроорганизмов ДНК выделяли следующим образом: 1 колонию микроорганизма переносили в 20 мкл лизирующего буфера, содержащего 0,25% SDS и 0,05 M NaOH, прогревали 15 мин. при 950С и добавляли 180 мкл бидистиллированной воды. Полученный лизат хранили при 400С.
Из мокроты ДНК выделяли двумя способами: с помощью набора DNA-Extra-Sorb (лаб. анализа геномов) и наборов QuickGene DNA tissue kit S, QuickGene DNA whole blood kit S (FUJIFILM Corporation, Life Science Products Division, Japan) на установке QuickGene-Mini80 (Nucleic Acid Isolation Device).
Амплификация фрагментов генов. ПЦР проводили для 4 мишеней: recA, gltB, gyrB, 16S rDNA, используя праймеры, представленные в табл. 1. ДНК разводили в 2-16 раз и вносили по 2 мкл в пробу. Для амплификации ДНК использовали следующие реактивы: Hot rescue DNA pol 5 ед/мкл, ПЦР-буфер 10х, праймеры (НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи), dNTP 5 мМ (Medigen). Модифицированная нами программа амплификации одинакова для мишеней recA, gltB, gyrB: 950С - 10 мин, (950С - 30 с, 630С - 40 с, 720С - 1 мин) 35 раз, 720С - 5 мин. Для мишени 16S rDNA использовали программу: 950С
- 10 мин, (950 С - 20 с , 56 0С - 30 с, 720С - 60 с) 35 раз, 720С
- 5 мин.
Выявление продуктов ПЦР. Анализ продуктов амплификации проводили посредством электрофореза фрагментов ДНК в агарозном геле по стандартной методике.
Секвенирование продуктов амплификации проводили на приборе 3130 Genetic Analyzer («Applied Bio-systems»/«Hitachi»). Использовали праймеры, указанные в табл. 1, наборы BigDye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing. Режим амплификации выбирали согласно рекомендациям к прибору. Электрофорез продуктов реакции осуществляли в капиллярах длиной 50 см с полимером POP-7.
Секвенированные последовательности идентифицировали с применением геномной и программной базы BLAST и сервера PubMLST (Multilocus Sequence Typing) [12].
мИКРОБИОЛОГИЯ
Таблица 1
Праймеры для амплификации ДНК бактерий
Ген Размер ампликона, п.н. Последовательность праймера (5'-3') Источник литературы
recA 704 AGGACGATTCATGGAAGAWAGC GACGCACYGAYGMRTAGAACTT [9]
gltB 652 CTGCATCATGATGCGCAAGTG CTTGCCGCGGAARTCGTTGG [9]
gyrB 738 ACCGGTCTGCAYCACCTCGT YTCGTTGWARCTGTCGTTCCACTGC [9]
16S rDNA GTGCCTAATACATGCAAGTCG [10]
789 (для лактобацилл)
GCRTGGACTACCAGGGTATC [11]
Таблица 2
Идентификация микроорганизмов в образцах мокроты
№ образца мокроты Результаты идентификации последовательности фрагментов генов
recA gltB gyrB ST 16S rDNA
188 - Achromobacter xylosoxidans - - Achromobacter sp.
216 - То же - - То же
187 - и и - - " "
192 - и и - - " "
248 - и и - - " "
200 14 11 230 709 Burkholderia sp.
206 14 11 230 709 То же
213 14 11 230 709 " "
238 14 11 230 709 " "
239 - Achromobacter xylosoxidans - - Achromobacter sp.
217 - - - - Staphylococcus aureus
214 - - - - Streptococcus sp.
ПЦР в реальном времени (ПЦР РВ) проводили на приборах LightCycler(R) Nano («Roche») и АНК-32 (Институт аналитического приборостроения РАН). В реакционную смесь добавляли Sybr Green I («Sigma»), DMSO (Dimethyl sulfoxide) («Sigma»), 0(+)-трегалозы дигидрат (Диа М). Программа амплификации: 950С - 10 мин, (950 С - 10 с , 570С/630С - 40 с, 720С - 60 с, 810С - 10 с) 45 раз. Флюоресценцию измеряли при 810С, чтобы исключить сигнал, привносимый неспецифическими низкомолекулярными продуктами. Плавление 63-950С с шагом 0,50С по 15 с. При работе с программным обеспечением LightCycler(R) Nano, помимо построения производной dF/dT, в анализе использовали опцию High Resolution Melting (плавление высокого разрешения).
Результаты и обсуждение. Для определения возможности идентификации доминирующего микроорганизма непосредственно в мокроте больного проводили выделение тотальной ДНК из 50 мкл мокроты предоставленных образцов. 2 набора, использованные в работе, отличались сорбентом ДНК и принципом депротеинизации нуклеиновой кислоты. Результаты выделения показали, что при одинаково высоком качестве ДНК метод сорбции на силикагеле требует меньших временных затрат.
Мишени, выбранные для дифференциального анализа ДНК, обусловлены ранее полученными результатами [8]. Поскольку фрагмент гена recA с праймерами, включенными в схему MLST для Bcc, можно амплифицировать только для ДНК буркхолдерий, он стал ключевым в дифференциации Bcc и Achromobacter sp. Из 7 мишеней, входящих в MLST для Bcc, только ген gltB был настолько консервативен в порядке Burkholderiales, что предложенные праймеры позволяли амплифицировать и ДНК Achromobacter sp. [8]. С большой долей вероятности в мокроте больных муковисцидозом могут присутствовать такие микроорганизмы, как Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus sp. Как видно
из табл. 2, продукт амплификации гена gltB в таких пробах ДНК отсутствовал. Для идентификации микроорганизмов в образцах, отрицательных по двум мишеням, использовали универсальные праймеры для гена 16S rDNA. Результаты анализа представлены в табл. 2. В пробах 217 и 214 доминирующими микроорганизмами были S. aureus и Streptococcus sp. соответственно.
Секвенирование фрагментов генов recA и gltB показало, что получаемые в ПЦР ампликоны однородны, и качество сиквенсов позволяет установить номер аллеля в соответствии с классификацией PubMLST для Bcc [12]. Как видно из табл. 2, аллели recA и gltB у всех образцов с буркхолдериями были одинаковыми. Как следует из данных табл. 3, такие аллели могут соответствовать одному из 5 близкородственных генотипов. Для их дифференциации мы амплифицировали дополнительную, наиболее вариабельную у этой группы генотипов мишень - gyrB. И в этом случае амплификация и секвенирование ДНК, выделенной непосредственно из мокроты, позволили определить аллель по фрагменту последовательности гена gyrB. Аллель был одинаковым у всех образцов с буркхолдериями и свидетельствовал о присутствии в мокроте больных ДНК B. cenocepacia генотипа 709, наиболее эпидемически значимого для российских больных му-ковисцидозом [8]. Наличие базы данных по генотипам Bcc, встречающихся у больных в РФ, позволяет сократить время анализа генотипа Bcc в образце мокроты, ограничив амплификацию и секвенирование тремя из 7 мишеней.
Анализ образцов мокроты, в которых выявлен Achromobacter xylosoxidans, дополнен проверкой штаммов, выросших при высеве мокроты на BCSA. Идентификация секвенированных последовательностей фрагмента гена gltB подтвердила принадлежность штаммов к A. xylosoxidans. Сравнение всех полученных последовательностей фрагмента гена gltB A. xylosoxidans показало, что они распре-
Аллельные профили, выявленные у штаммов Bcc. от больных в РФ
Таблица 3 выделенных
atpD gltB gyrB recA lepA phaC trpB ST
Burkholderia cenocepacia
15 352 184 14 11 6 147 708
15 11 181 14 11 6 147 241
131 11 85 14 11 6 147 728
131 11 230 14 11 6 358 709
16 11 179 14 11 120 79 208
16 11 317 14 11 6 79 714
23 16 352 15 69 6 14 727
17 134 57 15 94 8 144 710
B. multivorans
9 60 4 141 37 35 66 711
306 50 4 81 37 35 357 712
B. stabilis
26 18 42 21 70 10 16 51
B. contaminans
64 80 76 89 105 97 70 102
B. vietnamiensis
27 103 15 96 36 56 17 729
делились по двум группам, идентичность внутри которых составила 100%.
Группа из 6 последовательностей, идентифицированных у пациентов из Московского региона и Мурманска (GenBank Accession Number KC817500-KC817502), отличалась от группы, включавшей последовательности штаммов, выделенных от пациентов из Махачкалы и Уфы (GenBank Accession Number KC817498, KC817499). Отличие составили синонимичные замены в 2 нуклеотидах.
Дальнейшее сокращение времени дифференциальной диагностики Bcc и A. xylosoxydans возможно с применением ПЦР РВ. Поскольку последовательности фрагментов генов, выбранных для MLST Bcc, вариабельны и подбор единого зонда для всех генотипов затруднителен, мы остановились на варианте ПЦР РВ с использованием интеркалирующего красителя Sybr Green I. Основная трудность такого варианта анализа - ингибирование красителем ПЦР, особенно для GC-богатых последовательностей [13], к которым относятся ДНК Bcc и A. xylosoxydans. К уменьшению ингибирования прежде всего приводит снижение концентрации Sybr Green I до 1/40 000. В случае GC-богатых последовательностей дальнейший шаг - применение компонентов реакционной смеси, снижающих температуры плавления. На основе предварительных экспериментов и данных литературы [14] мы выбрали смесь DMSO (5%) и D(+)-трегалозы (0,3 М). В таких условиях проходила амплификация специфического фрагмента gltB гена Bcc, но невозможна амплификация более GC-богатого фрагмента gltB A. xylosoxydans. Введение дополнительного этапа в программу амплификации для детекции флюоресценции при температуре 810С, позволяющей минимизировать вклад флюоресценции неспецифических низкомолекулярных продуктов, а также этапа плавления, увеличили специфичность анализа.
Результаты амплификации и плавления продуктов реакции представлены на рисунке. В описанных условиях проходит амплификация ДНК 5 видов Bcc. Кривая плавления подтверждает образование специфического продукта реакции с Tm около 900С. В пробах, содержащих ДНК S. aureus, Strep-
tococcus sp., A. xylosoxidans, P. aeruginosa, специфические продукты реакции отсутствуют. ПЦР РВ в условиях Sybr Green I 1/40 000, 5% DMSO, 0,3 М D(+)-треraлозы позволяет выявить ДНК Bcc в образце мокроты.
На рисунке а приведены показания АНК-32, на рис. б - прибора LightCycler(R) Nano. Как видно из рисунка, кривые плавления имеют одинаковые максимумы, т.е. данные воспроизводятся независимо от марки амплификатора. К преимуществам LightCycler(R) Nano следует отнести возможность объединить амплификацию и плавление в единой программе, тогда как для АНК-32 это отдельные последовательные этапы, требующие дополнительного участия оператора. Общее время работы на LightCycler(R) Nano (2 ч) почти в 2 раза меньше, чем на АНК-32 (3 ч 40 мин). Дополнительное удобство связано с возможностями анализа данных на LightCycler(R) Nano - использование опции High Resolution Melt (плавление высокого разрешения) (рис., в), позволяющей более четко различить положительные и отрицательные образцы, как разные генотипы.
Заключение. Согласно стандарту специализированной медицинской помощи при кистозном фиброзе (муковисцидозе)
Кривые плавления продуктов амплификации фрагмента гена gltB в ПЦР РВ.
а - прибор АНК-32; б - прибор LightCycler(R) Nano; в - High Resolution Melt (плавление высокого разрешения). По оси абсцисс - температура плавления (i°C).
микробиология
Минздрава России от 20.02.2013, как при диагностике, так и при лечении заболевания в отношении всех пациентов проводится бактериологическое исследование мокроты на аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы. При массовом обследовании, а также при экстренном исследовании мокроты, необходимом для определения возможности оперативного вмешательства при легочной недостаточности, возможно применение экспресс-метода диагностики. Разработанная методика позволяет в короткое время выделить ДНК непосредственно из образца мокроты и по результатам ПЦР РВ определить те пробы, которые содержат Всс, как наиболее опасные для больных CF.
Последующий анализ, предполагающий амплификацию и секвенирование фрагментов генов recA, gltB и gyrB, позволяет охарактеризовать генотип в случае Всс и аллельный вариант гена gltB для A. \ylosoxydans. Полученные характеристики имеют эпидемиологическое значение, так как помогают установить возможные пути распространения Всс и A. \ylosoxydans среди больных муковисцидозом.
Поскольку и Всс, и A. \ylosoxydans могут быть причиной вспышек внутрибольничных инфекций [15], предложенный метод дифференциальной диагностики микроорганизмов может быть полезен при выявлении возбудителя при таких диагнозах как бактериемия, менингит, пневмония, перитонит, остеомиелит, инфекции мочевыводящих путей, эндоф-тальмиты, а также при идентификации микроорганизмов, контаминировавших дезинфицирующие растворы, диализные жидкости, физиологический раствор, деионизирован-ную воду.
Разработанный подход может служить дополнением золотому стандарту лабораторной диагностики - микробиологическому анализу.
ЛИТЕРАТУРА
1. The Main Site European Cystic Fibrosis Society (URL: http://www. ecfs.eu/22.03.2013).
2. CoreyM., Farewell V. Determinants of mortality from cystic fibrosis in Canada, 1970-1989. Am. J. Epidemiol. 1996; 143 (10): 1007-17.
3. Hauser A.R. Jain M., Bar-Meir M., McColley S.A. Clinical significance of microbial infection and adaptation in cystic fibrosis. Clin. Microbiol. Rev. 2011; 24 (1): 29-70.
4. Isles A., Maclusky I., Corey M. Pseudomonas cepacia infection in cystic fibrosis: an emerging problem. J. Pediatr. 1984; 104 (2): 206-10.
5. JonesA.M., DoddM.E., Govan J.R. et al. Burkholderia cenocepacia and Burkholderia multivorans: influence on survival in cysticfibrosis. Thorax. 2004; 59: 948-51.
6. LiPuma J.J., DasenS.E., NielsonD.W., SternR.C., StullT.L. Person-to-person transmission of Pseudomonas cepacia between patients with cystic fibrosis. Lancet. 1990, 336 (8723): 1094-6.
7. Igra-Siegman Y., ChmelH., Cobbs C. Clinical and laboratory characteristics of Achromobacter xylosoxidans infection. J. Clin. Microbiol., 1980, 11 (2):141-5.
8. Воронина О.Л., ЧернухаМ.Ю., Шагинян И.А., кундаМ.С., Аветисян Л.Р., ОрловаА.А., ЛунинВ.Г., Авакян Л.В., капрановН.И., АмелинаЕ.Л., Чучалин А.Г., Гинцбург А.Л. Характеристика генотипов штаммов Burkholderia cepacia complex, выделенных от больных в стационарах Российской Федерации. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2013; 2: 20-8.
9. Spilker T., Baldwin A., Bumford A. et al. Expanded multilocus sequence typing for Burkholderia specie. J. Clin. Microbiol. 2009. 47 (8): 2607-10.
10. Guan L.L., Hagen K.E., Tannock G.W. et al. Detection and identification of Lactobacillus species in crops of broilers of different ages by using PCR-denaturing gradient gel electrophoresis and amplified ribosomal DNA restriction analysis. Appl. Environ. Microbiol. 2003; 69: 6750-7.
11. NaserS.M., HagenK.E., VancanneytM. et al. Lactobacillussuntory-eus Cachat and Priest 2005 is a later synonym of Lactobacillus hel-veticus (Orla-Jensen1919) Bergey et al. 1925 (Approved Lists 1980). Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006; 56: 355-60.
12. The Main Site PubMLST of the Faculty of Zoology, Oxford University, Great Britain (URL: http://pubmlst.org 20.03.2013).
13. Eischeid A.C. SYTO dyes and EvaGreen outperform SYBR Green in real-time PCR. BMC Res Notes. 2011, 4:263-267, doi: 10.1186/17560500-4-263.
14. SpiessA.N., MuellerN., IvellR. Trehalose is a potent PCR enhancer: lowering of DNA melting temperature and thermal stabilization of taq polymerase by the disaccharide trehalose. Clin. Chem. 2004; 50 (7):1256-9.
15. Lipuma J.J. The changing microbial epidemiology in cystic fibrosis. Clin. Microbiol. Rev. 2010; 23 (2):299-323. doi: 10.1128/ CMR.00068-09.
REFERENCES
1. The Main Site European Cystic Fibrosis Society (URL: http://www. ecfs.eu/22.03.2013).
2. Corey M., Farewell V. Determinants of mortality from cystic fibrosis in Canada, 1970-1989. Am. J. Epidemiol. 1996; 143 (10): 1007-17.
3. Hauser A.R. Jain M., Bar-Meir M., McColley S.A. Clinical significance of microbial infection and adaptation in cystic fibrosis. Clin. Microbiol. Rev. 2011; 24 (1): 29-70.
4. Isles A., Maclusky I., Corey M. Pseudomonas cepacia infection in cystic fibrosis: an emerging problem. J. Pediatr. 1984; 104 (2): 206-10.
5. Jones A.M., DoddM.E., Govan J.R. et al. Burkholderia cenocepacia and Burkholderia multivorans: influence on survival in cysticfibrosis. Thorax. 2004; 59: 948-51.
6. LiPuma J.J., Dasen S.E., Nielson D.W., Stern R.C., Stull T.L. Person-to-person transmission of Pseudomonas cepacia between patients with cystic fibrosis. Lancet. 1990, 336 (8723): 1094-6.
7. Igra-Siegman Y., Chmel H., Cobbs C. Clinical and laboratory characteristics of Achromobacter xylosoxidans infection. J. Clin. Micro-biol., 1980, 11 (2):141-5.
8. VoroninaO.L., ChernukhaM.Yu., ShaginyanI.A., Kunda M.S., Aveti-syan L.R, Orlova A.A., Lunin V.G., Avakyan L.V., Kapranov N.I., Amelina E.L., Chuchalin A.G., Gintsburg A.L. Characterization of genotypes for Burkholderia cepacia complex strains isolated from patients in hospitals of Russian Federation. Molekuliarnaia Genetika, Mikrobiologiia i Virusologii. 2013; 2: 20-8 (in Russian).
9. Spilker T., Baldwin A., Bumford A. et al. Expanded multilocus sequence typing for Burkholderia specie. J. Clin. Microbiol. 2009. 47 (8): 2607-10.
10. Guan L.L., Hagen K.E., Tannock G.W. et al. Detection and identification of Lactobacillus species in crops of broilers of different ages by using PCR-denaturing gradient gel electrophoresis and amplified ribosomal DNA restriction analysis. Appl. Environ. Micro-biol. 2003; 69: 6750-7.
11. NaserS.M., HagenK.E., VancanneytM. et al. Lactobacillussuntory-eus Cachat and Priest 2005 is a later synonym of Lactobacillus hel-veticus (Orla-Jensen1919) Bergey et al. 1925 (Approved Lists 1980). Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006; 56: 355-60.
12. The Main Site PubMLST of the Faculty of Zoology, Oxford University, Great Britain (URL: http://pubmlst.org 20.03.2013).
13. Eischeid A.C. SYTO dyes and EvaGreen outperform SYBR Green in real-time PCR. BMC Res Notes. 2011, 4:263-267, doi: 10.1186/17560500-4-263.
14. Spiess A.N., Mueller N., Ivell R. Trehalose is a potent PCR enhancer: lowering of DNA melting temperature and thermal stabilization of taq polymerase by the disaccharide trehalose. Clin. Chem. 2004; 50 (7):1256-9.
15. Lipuma J.J. The changing microbial epidemiology in cystic fibrosis. Clin. Microbiol. Rev. 2010; 23 (2):299-323. doi: 10.1128/ CMR.00068-09.
Поступила 10.04.13
