CC BY
37
Разведение, селекция, генетика 71
УДК 636.082.11:636.22/.28.082.13
Характеристика генетической структуры стада герефордской породы по STR-локусам
О.М. Шевелёва, М.А. Часовщикова
ФГБОУ ВО «Государственный аграрный университет Северного Зауралья»
Аннотация. В статье представлена характеристика генетической структуры стада герефордской породы по 15 STR-локусам нуклеотидных последовательностей ДНК. Материалом для исследования послужили ткани уха 30 тёлок из ООО «Бизон» Тюменской области. Набор маркеров для анализа включал 15 микросателлитов - BM 1818, BM 1824, BM 2113, CSRM 60, CSSM 66, ETH 3, ETH 10, ETH 225, ILST 006, INRA 023, SPS 115, TGLA 53, TGLA 122, TGLA 126, TGLA 227. Для достижения поставленной цели были определены частоты встречаемости аллелей, уровень поли-морфности, наблюдаемая и ожидаемая гетерозиготность, индекс фиксации Райта. В результате обследования установлено, что 15 микросателлитных локусов включали в себя 104 аллеля, частоты которых колебались в диапазоне от 0,017 до 0,683. Среднее число информативных аллелей на ло-кус составляло 6,93, эффективных аллелей - 4,96 или 71,6 %. Увеличение числа аллелей в локусе сопровождалось повышением уровня полиморфности, что подтверждает положительный коэффициент корреляции, величина которого составляла 0,794 (p<0,001). Наибольшим уровнем поли-морфности характеризовался локус TGLA 53 с числом эффективных аллелей, равным 10,0, а наименьшим -локус TGLA 126 с числом эффективных аллелей 2,3. Анализ генетического разнообразия показал, что наибольшая наблюдаемая гетерозиготность была в локусе TGLA 53 - 0,950, а наибольшая ожидаемая в локусе CSSM 66 - 0,860. Средний уровень наблюдаемой гетерозиготно-сти составлял 0,783, ожидаемой - 0,691, индекс фиксации Райта имел величину, равную минус 0,133, что указывает на высокий уровень генетического разнообразия стада герефордского скота.
Ключевые слова: тёлки, герефордская порода, микросателлиты, полиморфизм, локус, аллель, гетерозиготность.
Введение.
Крупный рогатый скот герефордской породы в Тюменской области разводят с 1996 года, современная популяция животных этой породы формировалась из племенного поголовья, завезённого из племенных заводов Западной Сибири - Новосибирская, Омская области и Алтайский край. В 2012 году с целью обновления генофонда чистопородных стад на территорию области были завезены герефорды из Швеции [1]. На сегодня герефордская порода - самая многочисленная среди всех пород мясного направления продуктивности в области, составляет 55 % или 7789 голов от всего поголовья мясного скота.
Селекционно-племенная работа с породой ведётся посредством отбора и подбора по фено-типическим признакам с учётом родословной. Но как известно, это длительный путь к достижению высоких результатов в селекции. До недавнего времени в практике животноводства области не было доступно использование современных ДНК-технологий, например, таких как геномная оценка. Хотя в практике молочного скотоводства области есть опыт использования результатов ДНК-диагностики генов, ассоциированных с молочной продуктивностью и наследственными заболеваниями [2]. В настоящее время в Тюменской области работает молекулярно-генетическая лаборатория, созданная на базе Государственного аграрного университета Северного Зауралья, которая осуществляет микросателлитный анализ ДНК сельскохозяйственных животных.
Введение в практику высокопроизводительных методов микросателлитного типирования позволит на молекулярном уровне оценить генетическое разнообразие пород, популяций и использовать эту информацию для повышения эффективности геномной селекции, в задачу которой входит использование взаимосвязей между фенотипом и генотипом [3-5]. Микросателлиты являются ДНК-маркерами, которые используют для тестирования отцовства и верификации родословной
72 Разведение, селекция, генетика
скота, а также анализа связи с хозяйственно-полезными признаками и генетическими заболеваниями [6, 7]. Популярность микросателлитных маркеров объясняется их равномерным распределением в геноме, высоким полиморфизмом, кодоминантным наследованием по менделевскому типу, высокой воспроизводимостью результатов [8]. Несмотря на то, что метод микросателлитного анализа общепринят как для индивидуальной, так и для популяционной паспортизации животных, отечественные породы крупного рогатого скота практически не идентифицированы по микроса-теллитным локусам [9, 10], хотя такая работа уже успешно началась и проводится в разных регионах России, в том числе и Тюменской области [8, 11, 12].
Цель исследования.
Охарактеризовать генетическую структуру стада герефордской породы по STR-локусам нуклеотидных последовательностей ДНК.
Материалы и методы исследования.
Объект исследования. Тёлки герефордской породы.
Обслуживание животных и экспериментальные исследования были выполнены в соответствии с инструкциями Russian Regulations, 1987 (Order No. 755 on 12.08.1997 the USSR Ministry of Health) and «The Guide for Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press Washington, D. C. 1996)». При выполнении исследований были предприняты усилия, чтобы свести к минимуму страдания животных и уменьшения количества используемых образцов.
Схема эксперимента. Исследования микросателлитных STR-локусов проведены в 2017 году в ООО «Бизон» Тюменской области. Материалом для исследования являлись пробы ткани уха животных (n=30).
Проводились выделения геномной ДНК с помощью набора реагентов для выделения ДНК, анализ ДНК и постановка ПЦР согласно «Методических рекомендаций по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве» [13]. Идентификация фрагментов проводилась методом ПЦР-анализа микросателлитных локусов с последующей детекцией флюоресцентно меченых фрагментов методом капиллярного электрофореза с помощью генетического анализатора. Набор маркеров для анализа включал 15 микросателлитов - BM 1818, BM 1824, BM 2113, CSRM 60, CSSM 66, ETH 3, ETH 10, ETH 225, ILST 006, INRA 023, SPS 115, TGLA 53, TGLA 122, TGLA 126, TGLA 227.
В ходе проведения исследований рассчитаны следующие показатели: частота встречаемости аллелей (р) [14], число эффективных аллелей или уровень полиморфности (Ае) [14], наблюдаемая гетерозиготоность (Но) [15], ожидаемая гетерозиготность (Не) [15], индекс фиксации Райта (Fis) [15].
Оборудование и технические средства. Выделение геномной ДНК проводилось с помощью набора реагентов для выделения ДНК DIAtomTM DNA Prep100 (ООО «Лаборатория Изоген», Россия). Для амплификации использован амплификатор ProFlex™96-Well PCR System («ThermoFisher Scientific», США). Идентификация фрагментов проводилась методом ПЦР-анализа микросателлитных локусов с последующей детекцией флюоресцентно меченых фрагментов методом капиллярного электрофореза с помощью генетического анализатора Applied Biosystems 3500 Thermo Fisher («Applied Biosystems», США) в молекулярно-генетической лаборатории Государственного аграрного университета Северного Зауралья (г. Тюмень).
Статистическая обработка. Полученный цифровой материал обработан методами вариационной статистики с помощью офисного программного комплекса «Microsoft Office» с применением программы «Excel» («Microsoft», США).
Разведение, селекция, генетика 73
Результаты исследований.
Исследования показали, что в 15 микросателлитных локусах у тёлок герефордской породы суммарно обнаружено 104 аллеля, диапазон размеров которых варьировал от 79 до 300 bp. При этом в изучаемых STR-локусах идентифицировано от 4,0 до 11,0 аллелей. Среднее число аллелей на локус составляло 6,93. Наиболее информативными из 15 микросателлитных локусов для исследуемого стада являлись локусы с наибольшим числом аллелей от 9 до 11 - это TGLA 122, TGLA 227, TGLA 53, CSSM 66 и наименее информативными, с минимальным от 4 до 6 - это ВМ 1824, INRA 023, TGLA 126, BM 1818, CSRM 60, ETH 3, ETH 225 локусы. Анализ частот встречаемости аллелей показал варьирование в диапазоне от 0,017 до 0,683 (табл. 1).
Таблица 1. Частоты аллелей 15 микросателлитов, р
Локус Аллель Частота Локус Аллель Частота
BM 2113 260 0,083 ILST 006 286 0,017
262 0,233 288 0,383
264 0,050 292 0,217
266 0,583 294 0,250
268 0,033 296 0,083
270 0,017 298 0,033
178 0,167 300 0,017
CSRM 60 180 0,067 INRA 023 206 0,117
182 0,667 208 0,150
188 0,100 214 0,683
125 0,067 216 0,050
CSSM 66 127 0,017 SPS 115 246 0,017
131 0,100 248 0,350
133 0,117 252 0,083
135 0,100 254 0,050
137 0,050 256 0,183
139 0,417 258 0,017
141 0,133 260 0,300
92 0,033 TGLA 53 154 0,033
96 0,083 160 0,200
98 0,117 162 0,233
100 0,067 164 0,067
102 0,667 168 0,067
104 0,033 170 0,133
179 0,017 172 0,200
181 0,033 176 0,033
183 0,067 184 0,017
185 0,217 186 0,017
187 0,167 TGLA 122 141 0,167
189 0,167 143 0,383
191 0,033 147 0,017
193 0,150 151 0,250
195 0,050 153 0,017
197 0,067 159 0,017
199 0,033 161 0,033
74 Разведение, селекция, генетика
Продолжение 1 таблицы
1 2 3 4 5 6
ETH 3 115 0,017 167 0,017
117 0,517 183 0,100
119 0,350 TGLA 227 79 0,017
121 0,017 81 0,083
125 0,033 83 0,067
127 0,067 87 0,050
ETH 10 211 0,017 89 0,267
213 0,017 91 0,283
215 0,083 93 0,150
217 0,233 97 0,067
219 0,200 103 0,017
221 0,433 ETH 225 140 0,267
225 0,017 144 0,117
TGLA 126 115 0,433 146 0,167
117 0,417 148 0,217
121 0,033 150 0,217
123 0,117 152 0,017
Наибольшая частота встречаемости от 0,517 до 0,683 была характерна для пяти аллелей из пяти разных локусов - 117 (ETH 3), 266 (BM 1818), 182 (BM 1824), 102 (CSRM 60), 214 (INRA 023), а наименьшая - 0,017 для 21 аллеля из 11 локусов - 270 (BM 1818), 127 (BM 2113), 179 (CSSM 66), 115, 121 (ETH 3), 211, 213 и 225 (ETH 10), 152 (ETH 225), 286 и 300 (ILST 006), 246, 258 (SPS 115), 184 и 186 (TGLA 53), 147, 153, 159 и 167 (TGLA 122) и 79, 103 (TGLA 227).
Для оценки уровня полиморфности рассчитали число эффективных аллелей. Известно, что чем меньше число эффективных или активно действующих аллелей, тем ниже генетическое разнообразие популяции. Расчёты показали, что число активно действующих аллелей колебалось от 2,3 в ло-кусе TGLA 126 до 10,0 в локусе TGLA 53. Средний показатель уровня полиморфности анализируемых STR-локусов составил 4,96 (табл. 2). У анализируемых нами подконтрольных животных из 15 идентифицированных STR-локусов пять имели количество аллелей больше среднего уровня полиморфности и оставшиеся 10 - меньше, от 2,3 до 4,7 аллелей. В целом между общим числом аллелей в локусе и числом эффективных аллелей была установлена высокая положительная корреляционная зависимость с коэффициентом корреляции, равным 0,794 (р<0,001), из чего следует, что чем больше аллелей в локусе, тем выше уровень полиморфности и генетическое разнообразие стада.
Таблица 2. Характеристика полиморфизма STR-локусных микросателлитов
Локус Аллели Число аллелей на локус Число эффективных аллелей на локус (Ае)
BM 1818 260-270 6,0 4,5
BM 1824 178-188 4,0 3,0
BM 2113 127-141 8,0 3,6
CSRM 60 92-104 6,0 4,5
CSSM 66 179-199 11,0 6,3
ETH 3 115-127 6,0 4,5
ETH 10 211-225 7,0 5,0
ETH 225 140-152 6,0 4,7
ILST 006 286-300 7,0 4,3
INRA 023 206-216 4,0 3,5
SPS 115 246-260 7,0 3,5
TGLA 53 154-186 10,0 10,0
TGLA 122 141-183 9,0 8,0
TGLA 126 115-123 4,0 2,3
TGLA 227 79-103 9,0 6,7
X - 6,93 4,96
- 0,52 0,49
Разведение, селекция, генетика 75
Степень наблюдаемой гетерозиготности является показателем генетической изменчивости в популяции, это связано с тем, что гетерозиготы несут разные аллели. Наравне с наблюдаемой гетерозиготностью оценивается показатель ожидаемой гетерозиготности, который точнее характеризует разнообразие исследуемой популяции. Наблюдаемая и ожидаемая гетерозиготность локус-ных микросателлитов у тёлок герефордской породы представлены в таблице 3.
Таблица 3. Гетерозиготность локусных микросателлитов
Локус Наблюдаемая гетерозиготность (Но) Ожидаемая гетерозиготность (Не) Индекс фиксации (Fis)
BM 1818 0,750 0,595 -0,261
BM 1824 0,667 0,513 -0,301
BM 2113 0,688 0,767 0,104
CSRM 60 0,778 0,528 -0,474
CSSM 66 0,864 0,860 -0,051
ETH 3 0,778 0,604 -0,288
ETH 10 0,800 0,710 -0,126
ETH 225 0,909 0,793 -0,147
ILST 006 0,750 0,735 -0,020
INRA 023 0,714 0,495 -0,443
SPS 115 0,769 0,744 -0,034
TGLA 53 0,950 0,836 -0,136
TGLA 122 0,923 0,751 -0,230
TGLA 126 0,571 0,624 0,085
TGLA 227 0,833 0,807 -0,032
X 0,783 0,691 -0,133
0,026 0,031 -
Наибольшим уровнем наблюдаемой гетерозиготности характеризовались локусы TGLA 53 -0,950, TGLA 122 - 0,923 и ЕТН 225 - 0,909, наименьшим локус TGLA 126 - 0,571. В свою очередь наибольшей ожидаемой гетерозиготностью обладали локусы CSSM 66 - 0,860, TGLA 53 - 0,836 и TGLA 227 - 0,807, а наименьшей локус ШЕЛ 023 - 0,495. Средний показатель наблюдаемой гетерозиготности составлял 0,783, а ожидаемой был меньше и составлял 0,691.
Для установления отклонения гетерозиготных генотипов от теоретически ожидаемой использовали значение индекса фиксации Райта, который имел как положительные, так и отрицательные значения, в первом случае он показывал нехватку гетерозигот, во втором указывал на их избыток. Анализируя индекс фиксации, выяснили, что нехватка гетерозигот наблюдалась по локу-сам ВМ 2113 и TGLA 126, при этом величины индексов были не значительными по величине и составляли 0,104 и 0,085 соответственно. Избыток гетерозигот наблюдали по остальным тринадцати локусам, где индекс фиксации колебался в диапазоне от минус 0,474 по локусу CSRM 60 до минус 0,020 по локусу ILST 006. В среднем по 15 STR-локусам индекс фиксации составлял минус 0,133, что свидетельствовало об избытке гетерозигот.
Обсуждение полученных результатов.
Исследования микросателлитных локусов или STR-локусов - коротких тандемных повторов показывают, что для животных одной породы в разных стадах ДНК-профиль индивидуален. Так, например, по сведениям С.Д. Нурбаева [3], А.Т. Tyngoziyeva [16], в популяциях герефордов Республики Казахстан среднее количество аллелей в 11 локусах, которые анализировались и в нашей работе, составляло 11,8-12,2, при этом в одной из популяций только локус TGLA 122 содержал 24 аллеля, а локус TGLA 227 - 15 аллелей. В исследуемом нами стаде герефордов эти ло-
76 Разведение, селекция, генетика
кусы также были наиболее информативными, но содержали по 9 аллелей. А вот герефорды, завезённые в Республику Башкортостан из Австралии, по среднему числу информативных аллелей, а также по количеству аллелей в указанных выше локусах оказались более сходны с нашим поголовьем. Как указывают Т.А. Седых и соавторы [4], количество аллелей в локусах TGLA 122 и TGLA 227 у австралийских герефордов составляло 7,0 и 8,0 соответственно, а среднее число информативных аллелей на локус оказалось равным 6,0. В свою очередь по количеству аллелей в локусах ETH 10 и ETH 225 значительных различий между исследуемыми популяциями герефордов, в том числе и нашей, не наблюдали [3, 4, 16].
Средний уровень полиморфности анализируемых STR-локусов, являющийся показателем эффективно действующих аллелей в исследуемом нами стаде, составлял 4,96 аллелей, что согласуется с данными Е.А. Гладырь и других авторов [10], которые указывают на существование в популяции сибирских герефордов в среднем 4,66 эффективных аллелей.
Генетическое или аллельное разнообразие стада характеризуется уровнем ожидаемой гете-розиготности. Гетерозиготность играет значительную роль в адаптации животных, с ней связывают явление гетерозиса. Расчёт этого показателя в подконтрольном нам стаде указал на высокую гетерозиготность - более 0,691, по 9 из 15 локусов. При этом индекс фиксации Райта указывал на незначительный избыток гетерозигот в среднем по анализируемым STR-локусам, что свидетельствует о высоком уровне генетического разнообразия в исследуемом стаде герефордского скота.
Выводы.
Для герефордской породы было характерно наличие в 15 STR-локусах 104 аллелей, при этом на один локус приходилось от 4 до 11 аллелей. Среднее число информативных аллелей на ло-кус составляло 6,93, при этом число эффективных аллелей - 4,96 или 71,6 %. Увеличение числа аллелей в локусе сопровождалось увеличением уровня полиморфности. Наибольшим уровнем полиморфности характеризовался локус TGLA 53 с числом эффективных аллелей, равным 10,0, а наименьшим - локус TGLA 126, содержащий в среднем 2,3 эффективных аллеля. Подконтрольное стадо характеризовалось высоким уровнем генетического разнообразия. Средний уровень наблюдаемой гетерозиготности составлял 0,783, ожидаемой гетерозиготности - 0,691, индекс фиксации Райта имел величину минус 0,133.
Литература
1. Бахарев А.А., Шевелёва О.М., Беседина Г.Н. Характеристика и история формирования мясного скотоводства Тюменской области // Мир Инноваций. 2017. №1. С. 65-69.
2. Relationship between the genetic variants of kappa-casein and prolactin and the productive-biological characteristics of cows of the black-motley breed / M.A. Chasovshchikova, O.M. Sheveleva, M.A. Svjazhenina et al. // Journal of Pharmaceutical Sciences and Research. 2017. № 7. V. 9. P. 10381044.
3. Характеристика генофонда крупного рогатого скота герефордской породы по микроса-теллитным ДНК / С.Д. Нурбаев, А.М. Омбаев, Т.Н. Карымсаков и др. // Современные проблемы сельскохозяйственных наук в мире: сб. науч. тр. Междунар. науч.-практ. конф. Казань, 2016. С. 3336.
4. Полиморфизм микросателлитных локусов крупного рогатого скота герефордской породы различных эколого-генетических генераций / Т.А. Седых, Е.А. Гладырь, И.Ю. Долматова и др. // Вестник АПК Ставрополья. 2014. № 3. С. 121-128.
5. Invited review: Genomic selection in dairy cattle: progress and challenges / B.J. Hayes, P.J. Bowman, A.J. Chamberlain et al. // Journal Dairy Sciences. 2009. № 2. P. 433-443.
6. Application of eighteen microsatellite markers in studies parentage testing and genetic diversity in Holstein cattles / R. Ashoory, C. Amirinia, A. Noshary et al. // International Journal of Biology, Pharmacy and Allied Sciences. 2015. № 4. P. 5823-5832.
Разведение, селекция, генетика 77
7. Microsatellite DNA polymorphism and its usefulness for pedigree verification in Simmental cattle from Serbia / J. Stevanovic, Z. Stanimirovic, V. Dimitrijevic et al. // Acta Veterinaria (Beograd). 2009. № 5-6. V. 59. Р. 621-631.
8. Генетическая характеристика красной горбатовской и суксунской пород крупного рогатого скота по микросателлитным маркерам / В.В. Волкова, Т.Е. Денискова, О.С. Романенкова и др. // Молочное и мясное скотоводство. 2017. № 6. С. 6-8.
9. Оценка результативности тест-системы на основе микросателлитов в проведении ДНК-экспертизы крупного рогатого скота / Е.А. Гладырь, П.В. Горелов, В.Н. Маурчева и др. // Молочное и мясное скотоводство. 2011. № 8. С. 51-54.
10. Изучение изменчивости микросателлитов при создании нового типа мясного скота Сибири / Е.А. Гладырь, Г.М. Гончаренко, П.В. Горелов и др. // Достижения науки и техники АПК. 2011. № 10. С. 30-32.
11. Polymorphism of Cattle Microsatellite Complexes / A.V. Garkovenko, V.V. Radchenko, E.V. Ilnitskaya et al. // Journal of Pharmaceutical Science and Research. 2018. V. 10. P. 1545-1551.
12. Characterization of the Russian breef cattle breed gene pools using inter simple sequence repeat DNA analysis (ISSR analysis) / G.E. Sulimova, V.N. Voronkova, A.V. Perchun et al. // Russian Journal of Genetics. 2016. № 52. P. 963-968.
13. Методические рекомендации по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве / Н.А. Зиновьева, А.Н. Попов, Л.К. Эрнст и др. Дубровицы: ВИЖ, 1998. 47 с.
14. Меркурьева Е.К. Генетические основы селекции в скотоводстве: учеб. пособие. М.: Колос, 1977. 174 с.
15. Айала Ф., Кайгер Дж. Современная генетика. М.: Мир, 1988. Т. 3. 336 с.
16. Tyngoziyeva A.T., Karymsakov T.N., Nurbaev S.D. Genetic structure of populations of uazakh whiteheaded and Hereford cattles on the basis of microsatellite DNA // OnLine Journal of Biological Sciences. 2017. № 17. P. 359-362.
Шевелёва Ольга Михайловна, доктор сельскохозяйственных наук, заведующий кафедрой технологии производства и переработки продукции животноводства ФГБОУ ВО «Государственный аграрный университет Северного Зауралья», 625003, г. Тюмень, ул. Республики, 7, тел.: 83452290391, e-mail: shevelevaom@gausz.ru
Часовщикова Марина Александровна, доктор сельскохозяйственных наук, профессор кафедры технологии производства и переработки продукции животноводства ФГБОУ ВО «Государственный аграрный университет Северного Зауралья», 625003, г. Тюмень, ул. Республики, 7, тел.: 83452290391, e-mail: chsovschikovama@gausz.ru
Поступила в редакцию 26 ноября 2018 года
UDC 636.082.11:636.22/.28.082.13
Shevelyova Olga Mikhailovna, Chasovshchikova Marina Aleksandrovna
FSBEIHE «State Agrarian University of Northern Zauralye», e-mail: shevelevaom@gausz.ru Characteristics of the genetic structure of the Herford herd according to STR loci Summary. The article presents the characteristic of the genetic structure of the Herford breed herd at 15 STR-loci of nucleotide DNA sequences. The material for the study was the ear tissue of 30 calves from LLC «Bizon» of the Tyumen region. The set of markers for analysis included 15 microsatellites - BM 1818, BM 1824, BM 2113, CSRM 60, CSSM 66, ETH 3, ETH 10, ETH 225, ILST 006, INRA 023, SPS 115, TGLA 53, TGLA 122, TGLA 126, TGLA 227. To achieve this goal, the frequencies of allele occurrence, polymorphism level, observed and expected heterozygosity, Wright fixation index were determined. The survey found that 15 mic-
78 Разведение, селекция, генетика
rosatellite loci included 104 alleles, whose frequencies ranged from 0.017 to 0.683. The average number of informative alleles per locus was 6.93, effective alleles - 4.96 or 71.6 %. The increase in the number of alleles in the locus was accompanied by an increase in the level of polymorphism, which confirms a positive correlation coefficient, the value of which was 0.794 (p<0.001). The highest level of polymorphism was characterized by the TGLA 53 locus with the number of effective alleles equal to 10.0, and the smallest - the TGLA 126 locus with the number of effective alleles 2.3. Analysis of genetic diversity showed that the greatest observed heterozygosity was observed in the TGLA 53 locus - 0.950, and the greatest expected in the CSSM 66 locus - 0.860. The average level of observed heterozygosity was 0.783, the expected level was 0.691, the Wright fixation index had a value of minus 0.133, which indicates a high level of genetic diversity of the Herford herd.
Key words: heifers, Hereford breed, microsatellites, polymorphism, locus, allele, heterozygosity.
