CC BY
109
УДК 636.2.034:636.2.082.2
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ
ХАРАКТЕРИСТИКА
ГОЛШТИНСКОЙ ПОРОДЫ С
ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ
МАРКЕРОВ
Я.А. Хабибрахманова, к.б.н., Л.А. Калашникова, д.б.н., проф., Т.Б. Ганченкова, к.б.н., Павлова И.Ю., к.б.н., В.Г. Труфанов, д.б.н., проф.
ФГБНУ «ВНИИ племенного дела»
Полиморфизм 11
микросателлитных локусов
голштинского скота изучали с помощью коммерческого
мультиплексного набора, чтобы оценить генетическую
изменчивость. Были рассчитаны частоты аллелей, показатели информативной ценности (PIC) и гетерозиготности. Частоты аллелей показали, что в анализируемых пробах маркеры не были одинаково полиморфны.
Наибольшее значение PIC было у локуса TGLA 227 - 0,8442. Ключевые слова: голштинская
UDC 636.2.034:636.2.082.2 GENETIC CHARACTERIZATION OF HOLSTEIN CATTLE USING MICROSATELLITE MARKERS
Khabibrakhmanova I.A., Cand. Biol. Sci., Kalashnikova L.A., Dr. Biol. Sci., Prof., Ganchenkova T.B., Cand.Biol.Sci.,Pavlova I.Y., Cand. Biol. Sci., Trufanov V.G., Dr. Biol. Sci., Prof.
All Russian Research Institute of Animal Breeding
The polymorphism of 11 microsatellites from Holstein cattle was studied using a commercial multiplex system to estimate genetic variability. Allele frequencies, polymorphism information content and heterozygosis indices were calculated. Allele frequencies revealed that in the analyzed samples the markers were not equally polymorphic. The PIC was 0.8442 with the highest values for the TGLA 227.
Key words:
cattle, DNA,
Holstein
порода, полиморфизм, ПЦР, ДНК, polymorphism, PCR, микросателлиты, локус microsatellites, locus
Введение. Микросателлитные маркеры ДНК могут служить для генетической идентификации пород, типов, линий сельскохозяйственных животных, определения генетической структуры и оценки генетических расстояний между группами животных, для оценки величины и направления генного потока между популяциями, для определения эффективного размера популяции для исчезающих и малочисленных пород.
Для генетической экспертизы и контроля происхождения в Сербии была проведена оценка черно-пестрой популяции скота по 11 микросателлитным локусам. Был обнаружен всего 91 аллель, среднее число аллелей на локус составило 8,273 (Stevanovic J., et al., 2010). В
Польше проанализировали по 11 локусам красно-пестрый скот. Всего определено 79 аллелей. Наибольшее количество - 11 аллелей - было в локусе TGLA53 (Radko A., Rychlik T., 2009). В Бельгии Peelman et ál. (1998) изучали скот по 1 локусу - TGLA53, оказалось, что в голштинской породе содержится 13 аллелей, в бельгийской красной-пестрой - 12 , в восточной фламандской - 12 и в бельгийской серой - 10. В Португалии оценивали мясной скот, и наибольшее количество аллелей (10,67) было в TGLA53 и 10,00 - в TGLA227, а наименьшее ( 5,67) - в BM1824 (Carolino et ál., 2009). Были проведены исследования стада зебу (Hernandez Escobar С.et al., 2009), у которого обнаружено 157 аллелей, в среднем 14,2 на локус, исследования бразильского скота Неллор (Cervini et ál., 2006) показало, что количество аллелей на локус варьировало от 6 у TGLA227 до 16 у TGLA122.
Материал и методы исследований. Для исследований были отобраны 37 племенных животных голштинской породы Рязанской области, Р. Мордовия. Анализ был по 11 локусам, рекомендованным ISAG, используя тест-систему StockMarks II Kit для крупного рогатого скота (Applied Biosystems, Division Perkin-Elmer, Foster City, CA). Амплификацию проводили с помощью ПЦР с использованием праймеров с флуоресцентно-меченой меткой. Все 11 локусов типировали в одной 11-Plex реакционной смеси.
Постановка реакции была проведена согласно протоколу «Protocol for Bovine II Version 2 (Mixed 11 Plex Kit) Applied Biosystems».
Полученные ПЦР-продукты были проанализированы с использованием ABI 3130xl капиллярного секвенатора (Applied Biosystems) в полиакриламидном геле POP-4, в присутствии стандартного размерного маркера GS500 - ROX и контрольного образца. Результаты электрофорезного разделения были проанализированы автоматически с помощью GeneMapper. Статистическая обработка данных была выполнена с помощью «Microsoft Excel».
Результаты исследований. Нами были проведены исследования генома по тест-системе и получена генетическая характеристика голштинского скота (табл. 1).
Микросателлитный локус (МЛ) BM1824 (ААСТТТСТ (GT)nTAGT). Выявлены 5 аллелей, чаще встречался аллель 188 с частотой 0,446, на втором и третьем месте по частоте встречаемости соответственно аллели 178 (0,176) и 182 (0,162). BM2113
(GCTGCCTTCTACCAAATACCCCCTGCTCCGGCCCCCACCTCAAC(CA)n GAGTGAGCTCATAGTCTTGAGTTAAAAAAGTGACAGGTGTTGCTTCTCTC AGGAAG с повторяющейся единицей (CA)n) (GenBank). Выявлено 6 аллелей локуса BM2113, чаще встречался аллель 131 (0,284), на втором местах по частоте встречаемости аллель 135 (0,257), на третьем месте - аллель 125 с частотой 0,243. Локус ETH3 ((GT)nAC(GT)6). Нами было выявлено 6 аллелей локуса. У оцененных животных имелся аллель 123,
его частота достигла 0,486. На втором и третьем местах расположились соответственно аллели 125 (0,216) и 127 (0,203). Локус ETH10 (TAAA(AC)nAATCCT с единицей (АС)п). Было выявлено 6 аллелей, преобладает аллель 223 с частотой 0,378. ETH225, согласно результатам секвенирования, обладает последовательностью (TG)4CG(TG)(CA)n. Нами было обнаружено 5 аллельных вариантов, выявлены аллели длиной 134, 140, 142, 144 и 146 п.н., аллель 144, его частота достигла 0,392. INRA23 - (АС)п. Выявлено 6 аллелей, аллель 208 (0,338) встречался чаще. SPS115 - (CA)nTA(CA)6. Нами выявлено 5 аллелей, наиболее часто встречался аллель 242. Его частота достигла 0,662. TGLA53 - (TG)6CG(TG)4(TA)n с динуклеотидным повтором (ТА)п. Выявлено 11 аллелей. Наиболее часто встречался аллель 158 (0,284).
Локус TGLA122 - (АС)п(АТ)п, выявлено 9 аллелей, наиболее часто встречался аллель 141 (0,392). Локус TGLA126 - (TG)n. У голштинов нами выявлено 4 аллеля данного локуса. Наиболее часто у голштинских животных встречался аллель 119 с частотой 0,608. TGLA227 обладает TTTGCT(TG)nTTTCCTGCT, выявлено 10 аллелей, наиболее часто у голштинских животных встречается аллель 99 (0,230).
Таблица 1. - Полиморфизм микросателлитных локусов в голштинской породе_
Локусы Показа т. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
BM1824 Аллели 178 180 182 188 190
п 13 11 12 33 5
Часто та 0,176 0,14 9 0,16 2 0,44 6 0,06 8
BM2113 Аллели 121 123 125 131 133 135
п 2 10 18 21 4 19
Часто та 0,02 7 0,13 5 0,24 3 0,28 4 0,05 4 0,25 7
ETH 10 Аллели 207 211 215 217 221 223
п 6 3 8 25 4 28
Часто та 0,081 0,04 1 0,10 8 0,33 8 0,05 4 0,37 8
ETH Аллели 134 140 142 144 146
225 п 7 1 26 29 11
Часто та 0,095 0,01 4 0,35 1 0,39 2 0,14 9
ETH 3 Аллели 113 115 121 123 125 127
п 36 1 4 2 16 15
Часто та 0,486 0,01 4 0,05 4 0,02 7 0,21 6 0,20 3
^Л23 Аллели 200 204 206 208 212 214
п 12 21 1 25 14 1
Часто та 0,162 0,28 4 0,01 4 0,33 8 0,18 9 0,01 4
SPS115 Аллели 242 246 248 250 254
п 49 9 5 2 9
Часто та 0,662 0,12 2 0,06 8 0,02 7 0,12 2
TGLA Аллели 137 141 143 147 151 161 163 165 183
122 п 1 29 1 16 1 11 2 3 10
Часто 0,014 0,39 0,01 0,21 0,01 0,14 0,02 0,04 0,13
та 2 4 6 4 9 7 1 5
TGLA12 Аллели 117 119 123 125
6 п 22 45 3 4
Часто 0,297 0,60 0,04 0,05
та 8 1 4
TGLA22 Аллели 81 83 87 89 91 93 95 97 99 105
7 п 5 9 4 14 10 5 1 2 17 7
Часто 0,068 0,12 0,05 0,18 0,13 0,06 0,01 0,02 0,23 0,09
та 2 4 9 5 8 4 7 5
TGLA53 Аллели 150 152 154 162 156 160 158 164 168 178 184
п 8 2 16 1 15 1 21 6 2 1 1
Часто 0,108 0,02 0,21 0,01 0,20 0,01 0,28 0,08 0,02 0,01 0,01
та 7 6 4 3 4 4 1 7 4 4
Мерой информативности ПДРФ как генетического маркера, по предложению Д. Ботштейна и соавторов (1980 г.), принято считать значение содержания полиморфной информации PIC (polymorphism information content). Мы рассчитали показатели информативной ценности по 11 микросателлитным локусам ДНК (табл. 2). Наибольший показатель PIC был у локуса TGLA 227 - 0,8442. Наименьшее значение имели показатели информативности локуса TGLA 126 - 0,4681.
Исследование показателей гетерозиготности показало наличие высокого уровня гетерозиготности для 10 локусов из 11, кроме локуса SPS115, для этого локуса уровень гетерозиготности был несколько ниже и составил 0,586. Наибольшее значение степени гетерозиготности в голштинской породе выявлено для локуса TGLA 227 - 0,8602, менее гетерозиготен был локус TGLA 126 - 0,5375.
Таблица 2. - Показатели информативной ценности (PIC) и гетерозиготности (Н) _
Локусы PIC Н
BM1824 0,6807 0,719
BM2113 0,7353 0,7724
ETH 10 0,6753 0,7201
ETH 225 0,638 0,6937
ETH 3 0,6243 0,6721
INRA 23 0,7001 0,7447
SPS 115 0,4971 0,586
TGLA122 0,7275 0,7603
TGLA 126 0,4681 0,5375
TGLA 227 0,8442 0,8602
TGLA 53 0,8602 0,8146
Таким образом, голшинская порода характеризовалась высоким уровнем гетерозиготности, у которой наибольший Р1С был у локуса TGLA 227 - 0,8442. Выявлено от 4 до 11 аллелей на локус. Тест-система, состоящая из 11 микросателлитных маркеров ДНК, является эффективным инструментом генотипирования крупного рогатого скота и позволяет выявлять различия между группами животных вплоть до индивидуальных.
Литература
1. Carolino Inês, Conceiçâo O, Et Âl. Implementation of a parentage control system in Portuguese beef-cattle with a panel of microsatellite markers. Genet Mol Biol. 2009;32(2)306-311.
2. Cervini M, Henrique-Silva F, Mortari N, Matheucci E Jr. Genetic variability of 10 microsatellite markers in the characterization of Brazilian Nellore cattle (Bos indicus). Genet Mol Biol. 2006;29(3)486.
3. Chaisson M., Pevzner P., Tang H. Fragment assembly with short reads. Bioinformatics 20 (13): 20672074,2004.
4. L. H. P.van de Goor, Panneman H., W. A.van Haeringen A proposal for standardization in forensic bovine DNA typing: allele nomenclature of 16 cattle-specific short tandem repeat loci, Anim. Gen.2009, 40, 630636.
5. Marcelo Cervini1, Flâvio Henrique-Silva2, Norma Mortari1 and Euclides Matheucci Jr, Laboratorio de Imunogenética, Departamento de Genética e Evoluçâo,Universidade Federal de Sâo Carlos, Sâo Carlos, SP, Brazi, Laboratorio de Biologia Molecular.
6. Peelman L.J., Mortiaux F., Van Zeveren A., Dansercoer A, Mommens G. et al. Evaluation of the genetic variability of 23 boviane microsatellite markers in four Belgian cattle breeds . An.Genet. 1998; 29-: 161-67.
7. Pevzner P.A., Tang H., Waterman M.S. An Eulerian path approach to DNA fragment assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(17):9748-9753,2001.
8. Phillip E. C. Compeau, Pavel A. Pevzner. Genome Reconstruction: A Puzzle with a Billion Pieces. In Bioinformatics for Biologists.
9. Radko A., Rychlik T. Use of blood group tests and microsatellite DNA markers for parentage verification in a population of Polish Red-and-White cattle //Ann. Anim. Sci., Vol. 9, No. 2 (2009) 119-125.
10. Schatz M.C., Delcher A.L., Salzberg S. Assembly of large genomes using second-generation sequencing. Genome Research, 20(9):1165-1173,2010.
11. Stevanovic J., Stanimirovic Z., Dimitrijevic V., Maletic M. Evaluation of 11 microsatellite loci for their use in paternity testing in Yugoslav Pied cattle (YU Simmental cattle)/Czech J. Anim. Sci., 55, 2010 (6): 221.
12. Urwin R., Maiden M. C. Multi-locus sequence typing: a tool for global epidemiology // Trends Microbiol. — 2003. — В. 10. — Т. 11. — С. 479—487.
