ХАРАКТЕРИСТИКА БИОХИМИЧЕСКИХ ПРОФИЛЕЙ КЛИНИЧЕСКИХ ИЗОЛЯТОВ МИКРОМИЦЕТОВ РОДА CANDIDA Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

DOI: 10.24412/1999-6780-2024-2-67-71 УДК: 582.282.23: 577.1

Для цитирования: Ковыршин С.В., Выборнова И.В., Босак И.А. Характеристика биохимических профилей клинических изолятов микро-мицетов рода Candida. Проблемы медицинской микологии. 2024; 26 (2): 67-71. DOI: 10.24412/1999-6780-2024-2-67-71

For citation: Kovyrshin S.V., Vybornova I.V., BosakI.A. Study of biochemical profiles of clinical strains of the genus Candida. Problems in Medical Mycology. 2024; 26 (2): 67-71. (In Russ.). DOI: 10.24412/1999-6780-2024-2-67-71

ХАРАКТЕРИСТИКА БИОХИМИЧЕСКИХ ПРОФИЛЕЙ КЛИНИЧЕСКИХ ИЗОЛЯТОВ

МИКРОМИЦЕТОВ РОДА CANDIDA

Ковыршин С.В. (м.н.с.)* (н.с.), Босак И.А. (с.н.с.)

Выборнова И.В.

Научно-исследовательский институт медицинской микологии им. П.Н. Кашкина ФГБОУ ВО "Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Меч-

Определены биохимические профили семи основных медицински значимых представителей рода Candida с помощью модифицированного метода ассимиляции питательных веществ. Полученные профили уникальны для каждого из изученных видов. Оптимальным временем для определения профилей является 18-20 часов инкубации, для C. parapsilosis и Meyerozyma guilliermondii (C. guilliermondii) — 48 часов. Проведено сравнение биохимических профилей C. auris и наиболее сходных с ним видов микромицетов. Разработанные приемы биохимической дифференцировки будут полезны в тех случаях, когда невозможно получить оперативный доступ к высокоточным методам идентификации - таргетному ДНК-секвенированию и MALDI-TOF-масс-спектрометрии. При выборе метода идентификации следует отдавать предпочтение молекулярно-генетическим технологиям, несмотря на полученные межвидовые фенотипические различия в ассимиляции веществ.

Ключевые слова: ассимиляция, биохимические профили, Candida

* Контактное лицо: Ковыршин Сергей Валерьевич, e-mail: Sergei.Kovyrshin@szgmu.ru

STUDY OF BIOCHEMICAL PROFILES OF CLINICAL STRAINS OF THE GENUS CANDIDA

Kovyrshin S.V. (junior scientific researcher), Vybornova I.V. (scientific researcher), Bosak I.A. (senior scientific researcher)

Kashkin Research Institute of Medical Mycology of Northwestern State Medical University named after I.I. Mechnikov, St. Petersburg, Russia

The biochemical profiles of seven main medically representatives of the genus Candida were determined using a modified method of assimilation of nutrients. The obtained profiles are unique for each of the studied species. The most optimal time for determining profiles is 18-20 hours of incubation, for C. parapsilosis and Meyerozyma guilliermondii (C. guilliermondii) — 48 hours. A comparison of biochemical profiles between C. auris and most similar micromycetes species was made. The developed techniques of biochemical differentiation will be useful in cases where it is impossible to obtain prompt access to highly accurate identification methods — targeted DNA sequencing and MALDI-TOF mass spectrometry. Preference should be given for molecular methods of identification of yeast, despite of obtained intraspecific phenotypic differences of assimilation.

Key words: assimilation, biochemical profiles, Candida

ВВЕДЕНИЕ

Методика идентификации и классификации микромицетов с помощью определения их ассимиляционных свойств известна уже более 100 лет. Первый опыт был описан нидерландским ученым Beijerinck M.W. в 1889 году в статье «L'auxano-graphic ou la methode de l'hydrodiffUsion dans la gelatine appliquee aux recherches microbiologiques» и заключался в помещении на «голодный» агар с ино-кулюмом дрожжей различных углеводов с последующим учетом роста или его отсутствия на них в течение 1-2 дней. В дальнейшем методика приобрела различные модификации, которые включали в себя разработку специальных питательных сред, но их отличие от первого метода было в длительной инкубации, которая доходила до 24 дней. Наиболее значимыми являлись модификация Wickerham L.J. и Burton K.A. (ассимиляция в агаризованной среде в

пробирках с последующим сравнением мутности в них), представленная в 1948 г. в работе «Carbon assimilation tests for the classification of yeasts», и ее доработка Adams E.D. и Cooper B.H. в 1974 г. («Evaluation of a modified Wickerham medium for identifying medically important yeasts») путем добавления в агар индикатора pH. Именно эти модификации легли в основу современных тест-систем биохимической идентификации дрожжей промышленного производства. Также в 1975 г. Land G.A. и соавторами был разработан вариант диско-диффузионного метода с использованием пропитанных углеводами дисков («Improved auxanographic method for yeast assimilations: a comparison with other approaches»). Devadas S.M. и коллеги применяли отдельные чашки Петри с питательной средой, содержащей определенный углевод, на которую ка-пельно наносились инокулюмы микромицетов [1]. На сегодняшний день микробиологические лаборатории могут позволить себе коммерческие тест-системы, но время видовой идентификации дрожжевых грибов с их помощью может достигать 72 часов и, соответственно, замедлить дальнейшее определение чувствительности выделенного микромицета к противогрибковым лекарственным препаратам и своевременное назначение терапии пациентам. Более того, некоторые методики требуют наличия специального оборудования для интерпретации результатов, а использование протеомных технологий, например MALDI-TOF-масс-спектрометрии

(Matrix-Assisted Lazer Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry), ввиду высокой стоимости оборудования недоступно для многих лабораторий 1 уровня. Поэтому разработка простой в подготовке, недорогой по расходным материалам и легкой в интерпретации результатов модификации разработанных ранее методик может решить вышеописанные проблемы.

Цель работы: сравнить биохимические профили представителей Candida spp. - основных возбудителей инвазивного кандидоза.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе были изучены биохимические профили 180 клинических изолятов Candida spp: C. albicans -49, C. parapsilosis - 36, Nakaseomyces glabratus (C. glabrata) - 29, C. auris - 20, C. tropicalis - 19, Pichia kudriavzevii (C. krusei) - 13, Meyerozyma guilliermondii (С. guilliermondii) - 12, депонированных в «Российской коллекции патогенных грибов» на базе НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина СЗГМУ им. И.И. Мечникова, и 10 штаммов дрожжей из «Всероссийской коллекции микроорганизмов»: Clav-ispora lusitaniae (C. lusitaniae) ВКМ - 1022; C. intermedia ВКМ - 44; Debaryomyces hansenii (C. famata) ВКМ - 2560; С. sake ВКМ - 1499, 700, 124, 1463; C. haemulonii ВКМ - 2106; C. duobushaemulonis ВКМ -

3593; Saccharomyces kluyveri ВКМ - 1293. Предварительную идентификацию штаммов из «Российской коллекции патогенных грибов» выполняли с помощью метода MALDI-TOF-масс-спектрометрии и таргетного ДНК-секвенирования по локусу ITS. Изучение биохимических свойств микромицетов проводили с помощью модификации методики теста ассимиляции питательных веществ. Для приготовления основы питательной среды в равных пропорциях смешивали 6,75% раствор «Yeast Nitrogen Base» (YNB) с аминокислотами (Sigma-Aldrich, Германия) и 10% растворы различных углеводов (УВ): глюкозы, галактозы, рафинозы, арабинозы, мальтозы, ксилозы, лактозы и трегалозы. Все растворы были простерилизованы с помощью фильтра с диаметром пор 0,2 мкм. Затем полученный раствор разбавляли в 10 раз буфером Na2HPO4 + KH2PO4, доведенным до рН 6,2-6,3, с добавлением индикатора бромкремзоловый зеленый. Далее полученный раствор в объеме 100 мкл вносили в лунку 96-луночного плоскодонного микропланшета. Штаммы микромицетов выращивали в течение 24 часов на агаре Сабуро при температуре 37 °C. Затем клеточную массу снимали с поверхности агара бактериологической петлей, суспендировали в пробирке с 0,85% стерильным раствором натрия хлорида до густоты рабочих взвесей 0,5 ЕД по Мак Фарланду. Готовые взвеси добавляли по 100 мкл в каждую лунку со средой. Ставили следующие контроли: питательной среды (разбавленный в 10 раз раствор YNB без УВ с добавлением дистиллированной воды), исследуемого вещества (раствор YNB и УВ с добавлением дистиллированной воды) и культуры (разбавленный в 10 раз раствор YNB без УВ с добавлением взвеси). Планшеты инкубировали 24 часа при 37 ^ и дополнительно 24 часа при той же температуре. Оценку результатов проводили визуально. Положительной считали лунку желтого цвета через 24 часа, через 48 часов - значительно отличные от контроля культуры.

Использованные сокращения. GLU - глюкоза, MAL - мальтоза, GAL - галактоза, LAC - лактоза, RAF - раффиноза, XYL - ксилоза, ARA - арабино-за, TRE - трегалоза.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Биохимические характеристики изученных видов микромицетов.

В результате исследования получены биохимические профили основных представителей Candida spp. Характерные для C. albicans свойства отражены на снимке инокулированного микропланшета, где показан результат исследований 8 штаммов с помощью модификации теста ассимиляции сахаров (Рис.1).

Рис.1. Биохимический профиль С. albicans

Для 100% штаммов вида C. albicans была характерна ассимиляция глюкозы, галактозы, мальтозы, для 92% - трегалозы на 1 сутки. Способность ассимилировать ксилозу и трегалозу для некоторых штаммов отмечалась только через 48ч - 8% и 16% изолятов соответственно.

Все штаммы Pichia kudriavzevii (C. krusei) через 24 часа ассимилировали только глюкозу. Через 48 часов положительными были все лунки. Также для данного вида характерно образование плотной пленки на поверхности среды, что может послужить дополнительным отличительным признаком для диф-ференцировки от других видов.

Вид C. parapsilosis ассимилировал глюкозу, слабоположительно - галактозу, мальтозу и у 12% штаммов - арабинозу на 1 сутки. После дополнительной инкубации 24 часа при температуре 37 оС положительными стали лунки с арабинозой у 36% штаммов, и для некоторых штаммов отмечалась ассимиляция трегалозы (36%) и ксилозы (6%). Видо-специфический биохимический профиль можно определить только через 48 часов. Но слабоположительные лунки позволяют предположить видовую принадлежность изолята несколько ранее.

Для вида Meyerozyma guilliermondii (С. guilliermondii) также необходима длительная инкубация. На 1 сутки штаммы ассимилируют глюкозу, мальтозу и трегалозу, слабоположительно - галактозу и раффинозу. При дополнительной инкубации через 24 часа положительными становились лунки с галактозой и раффинозой.

Микромицеты вида C. tropicalis ассимилируют глюкозу, галактозу, мальтозу, ксилозу и трегалозу.

Обнаружено, что после инкубации более 24 часов все лунки оказались положительными.

Биохимический профиль вида C. auris на 1 сутки состоял из ассимиляции глюкозы, мальтозы и трегалозы. На 2 сутки некоторые штаммы ассимилировали галактозу, но без возможности воспроизведения.

Вид Nakaseomyces glabratus (C. glabrata) ассимилировал только глюкозу и трегалозу через 24 часа и после дополнительной инкубации через 24 часа.

Типовые биохимические профили для основных представителей рода Candida, определенные с учетом вышеуказанных особенностей постановки и интерпретации модифицированной методики, приведены в таблице 1.

Таблица 1

Биохимические профили основных видов Candida spp.

Вид GLU GAL RAF ARA MAL XYL LAC TRE

C. albicans + + - - + -/+* - +/-

C. auris + - - - + - - +

C. glabrata + +

C. tropicalis + + - - + + - +

C. parapsilosis* + + - -/+ + -/+ - -/+

C. krusei +

C. guilliermondii* + + + - + - - +

Прим.: * - биохимические профили определены через 48 часов.

Сравнение ассимиляционных профилей дрожжей Candida auris и биохимических сходных видов.

Вид Candida auris является относительно новым патогеном, который приобрел особенно широкое распространение во время пандемии COVID-19. Первоначальные данные о его биохимических свой-

ствах указывали на аналогичный профиль с видом Saccharomyces cerevisiae (на коммерческой тест-системе). После пополнения знаний о данном новом патогене, также накапливались противоречия в использовании и интерпретации фенотипических методов идентификации. Важным аспектом работы стала сравнительная характеристика биохимических профилей вида C. auris и видов Clavispora lusitaniae

_Сравнение биохимических профилей дрожжей Candida

(C. lusitaniae), C. intermedia, Debaryomyces hansenii (C. famata), С. sake, C. haemulonii, C. duobushaemulonis и Saccharomyces kluyveri, так как в литературе присутствуют сообщения о сходствах в их ассимиляционных профилях, что затрудняет диагностику и приводит к неверной идентификации [2]. Результаты по данному разделу работы показаны в таблице 2.

Таблица 2.

is и «биохимически сходных видов» в течение 48 часов_

№ Вид GLU GAL RAF ARA MAL XYL LAC TRE

24 48 24 48 24 48 24 48 24 48 24 48 24 48 24 48

C. auris + + - + - + - + + + - + - + + +

ВКМ - 1022 C. lusitaniae + + + + - + - + + + - + - + - +

ВКМ - 44 C. intermedia + + + + - + - + + + - + - + - +

ВКМ - 2560 C. famata - - - - - - - + - - - - - - - -

ВКМ - 1293 S. kluyveri + + + + + +

ВКМ - 1499 С. sake +

ВКМ - 700 С. sake

ВКМ- 124 С. sake

ВКМ - 1463 С. sake - + - + - - - - - - - - - - - -

ВКМ - 2106 C. haemulonii + + - + - - - + - + - + - - - +

ВКМ - 3593 C. duobushaemulonis + + - + - - - - - + - - - - + +

Исходя из полученных результатов, можно сделать вывод о том, что данная модификация ассимиляционного теста подходит только для клинических изолятов, способных расти при температуре 37 оС. Также обнаружены как сходства некоторых видов между собой, так и их отличие от штаммов C. auris. Однако точную видовую принадлежность позволяют определить только молекулярно-генетические методы, которым стоит отдавать предпочтение.

Сравнение биохимических свойств дрожжей рода Candida на основе других методик и тест-систем по данным литературы.

Историческое многообразие методик изучения ассимиляции дрожжами органических веществ огромно. На сегодняшний день практически каждая из использованных ранее модификаций приобрела коммерческую версию, что позволяет сотрудникам диагностических лабораторий выбрать наиболее подходящую. Интересным для изучения является факт сходств и различий биохимических профилей дрожжей при использовании различных вариантов. Для сравнения нами были выбраны следующие методики: коммерческие тест-системы Auxacolor™2 (BIO-RAD) и ID 32С (BIOMERIEUX); методика, примененная Н.П. Елиновым, Н.В. Васильевой и соавт. [3], а также использовавшаяся нами модификация (жидкая среда). Для вида C. auris сравнение биохимических профилей проводили с системой VI-TEK 2 (BIOMERIEUX) и первой публикацией о данном виде Satoh el al. [4]. Результаты приведены в таблице 3.

Таблица 3.

Сравнение биохимических профилей дрожжей Candida spp, _полученных различными методиками ^

Методика GLU GAL RAF ARA MAL XYL LAC TRE

C. albicans

AuxacolorTM2 + + - +/- + +/- - +/-

ID 32C + + - - + +/- - +/-

по Н.П. Елинову + + - - + + - +

Жидкая среда + + - - + -/+ - +/-

C. glabrata

AuxacolorTM2 + +

ID 32C + +

по Н.П. Елинову +

Жидкая среда + +

C. tropicalis

AuxacolorTM2 + + - - + + - +

ID 32C + + - - + + - +

по Н.П. Елинову + + - - + + - +

Жидкая среда + + - - + + - +

C. parapsilosis

AuxacolorTM2 + + - + + +/- - +/-

ID 32C + + - + + + - +

по Н.П. Елинову + + - +/- + +/- - +

Жидкая среда + + - -/+ + -/+ - -/+

C. krusei

AuxacolorTM2 +

ID 32C +

по Н.П. Елинову +

Жидкая среда +

C. guilliermondii

AuxacolorTM2 + + +/- + + +/- - +

ID 32C + + + + + + - +

по Н.П. Елинову + + + + + + - +

Жидкая среда + + + - + - - +

C. auris

по Satoh et al. + - + - + - - +

VITEK 2 + - + - + - - +

Жидкая среда + - - - + - - +

Прим.: +/- - ассимиляция вариабельна.

Как следует из данных, отраженных в таблице 3, только для Meyerozyma guilliermondii (С. guillier-mondii) биохимический профиль изменялся при применении различных методик. Биохимические профили остальных видов, в зависимости от используемого подхода, могут слегка отличаться, что доказывает слабые различия предложенной нами модификации и отсутствие разночтений в идентификации видов Candida spp.

ВЫВОДЫ

1. Биохимические профили с помощью модифицированной методики изучения ассимиляции веществ удалось определить через 24 часа для 5 видов, через 48 часов - для 2 видов Candida spp.

2. Полученные профили уникальны для каждого вида, что делает возможным межвидовую диффе-ренцировку дрожжей.

3. Модифицированная методика при четком соблюдении постановки позволяет отличить вид С. аипз от «биохимически сходных» с ним микромице-тов.

4. Несмотря на полученные данные о биохимических профилях, для видовой идентификации дрожжей рекомендуем отдавать предпочтение моле-кулярно-генетическим методам: МЛЬ01-Т0Е масс-спектрометрии, мультикомплексным ПЦР-тест-системам и таргетному ДНК-секвенированию.

Исследование выполнено в рамках темы Государственного задания Минздрава России «Геномная эпидемиология множественно- и экстремально-устойчивых к антимикробным препаратам, бактериальных и грибковых возбудителей инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи» НИОКТР № 124021400014-5.

ЛИТЕРАТУРА

1. Devadas S.M., BallalM., Prakash P.Y., etal. Auxanographic carbohydrate assimilation method for large scale yeast identification. J. Clin. Diagn. Res. 2017; 11 (4): DC01-DC03. doi: 10.7860/JCDR/2017/25967.9653

2. Оганесян Э.Г., Гордеева С.А., Тараскина А.Е. и др. К вопросу о проблемах идентификации Candida auris. Проблемы медицинской микологии. 2022; 24 (3): 54-61. [Oganesyan E.G., Gordeeva S.A., Taraskina A.E., et al. On the question of identification problems of Candida auris. Problems in Medical Mycology. 2022; 24 (3): 54-61. (In Russ)]. doi: 10.24412/1999-6780-2022-3-54-61

3. Елинов Н.П., Васильева Н.В., Степанова А.А., Чилина Г.А. Candida. Кандидозы. Лабораторная диагностика: Учебно-методическое пособие. СПб.: Коста, 2010; 224 с. [Yelinov N.P., Vasilyeva N.V., Stepanova A.A., Chilina G.A. Candida. Candidiasis. Laboratory diagnostics: Educational and methodical manual. St. Petersburg: Costa, 2010; 224 p. (In Russ.)].

4. Satoh K., Makimura K., Hasumi Y., et al. Candida auris sp. nov., a novel ascomycetous yeast isolated from the external ear canal of an inpatient in a Japanese hospital. Microbiol. Immunol. 2009; 53 (1): 41-4. doi: 10.1111/j.1348-0421.2008.00083.x

Поступила в редакцию журнала 26.03.24 Принята к печати: 15.04.24